腐霉利及其代謝產(chǎn)物在百合上的殘留行為研究

楊丹,徐廣,鄒艷,郭瑀,譚秋生,鄧才富*,雷美艷,楊永東

(1.重慶市藥物種植研究所,重慶 408435;2.重慶中醫(yī)藥學(xué)院,重慶 408435;3.重慶市南川區(qū)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展中心,重慶 408435)

百合為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.、百合LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulumBaker.、細(xì)葉百合LiliumPumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉,具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效,用于治療陰虛燥咳、肺癆咳血、虛煩驚悸、失眠多夢、精神恍惚等癥[1]。百合不僅食藥用價(jià)值高,還具有重要的觀賞價(jià)值,無論作為藥用還是觀賞花卉都深受廣大消費(fèi)者喜愛。藥用百合栽培過程中腐爛病、炭疽病、疫病等病害發(fā)病率高,引起鱗莖鱗片腐爛、植株死亡,嚴(yán)重時(shí)可造成整株死亡[2],同時(shí)造成藥農(nóng)生產(chǎn)的藥用百合產(chǎn)量損失及品質(zhì)降低的重要原因。為防治病害侵襲,藥農(nóng)多選用廣譜類殺菌劑根治百合病害。

腐霉利(Procymidone),化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1,化學(xué)式C13H11ClNO2,化學(xué)名稱N-(3,5-二氯苯基)-1,2-二甲基患病玩-1,2-二羧酰亞胺,又 稱速克靈、速克利、殺霉利、二甲菌核利[3],要防治果樹、蔬菜 作物的灰病、菌核病,因具有安全、廉價(jià)、防效好等特性而被廣泛使用,要原理是通過抑制致病菌頂端的菌絲,使其細(xì)胞壁無法合成,從而使致病菌暴露在環(huán)境中而被殺死,其被廣泛用于蔬菜及果樹的灰霉病防治[4]。腐霉利代謝產(chǎn)物主要是3,5-二氯苯胺,化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖2。長期不間斷地食用帶有腐霉利農(nóng)藥殘留的瓜果蔬菜,腐霉利農(nóng)藥在人體內(nèi)自然代謝較慢的情況下,很難排出體外,則有可能會影響人的身體健康,尤其是身體較弱的老人、小孩、孕婦等特殊人群。目前腐霉利殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[5]、熒光光譜法[6]高效液相色譜法[7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]等。目前,相關(guān)研究評價(jià)了腐霉利在韭菜[10]、生菜[11]、黃瓜[12]中藥人參[13-14]、三七[15-16]、水果桑葚[17-18]草莓[19]、柑橘[20]、沃柑[21]中的殘留和消解規(guī)律,然而,對于腐霉利在百合中的使用安全性尚無評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)通過田間試驗(yàn)研究腐霉利在百合植株上的消解動態(tài)及在卷丹鱗莖中殘留量,為今后腐霉利用藥安全提供理論依據(jù)。

圖1 腐霉利分子結(jié)構(gòu)式

圖2 3,5-二氯苯胺分子結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

腐霉利標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%),3,5二氯苯胺(純度≥98%),均購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司,乙腈色譜純(阿拉丁試劑公司),無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉二水化合物、檸檬酸鈉倍半水合物(分析純,購于上海源葉生物科技有限公司),弗羅里硅土柱(杭州微米派科技有限公司),娃哈哈純凈水,50%腐霉利可濕性粉劑(日本住友化學(xué)株式會社)。

冷凍離心機(jī)(5804R德國艾本德)、 Milli-Q 純水系統(tǒng)(Merck)、數(shù)控超聲波清洗器(KQ-1000DE型昆山市超聲儀器有限公司)、手持研磨儀(HMR-1上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)、 GC-MSQP2020NX 全二維氣相色譜質(zhì)譜儀(日本島津儀器有限公司)。

1.2 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)在重慶市南川區(qū)三泉鎮(zhèn),按農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則要求設(shè)試驗(yàn)小區(qū),小區(qū)面積30 m2,重復(fù)3 次,隨機(jī)排列,小區(qū)間設(shè)保護(hù)帶;空白對照小區(qū)(清水)、低劑量區(qū)、高劑量區(qū)和消解動態(tài)試驗(yàn)區(qū),將50%腐霉利可濕性粉劑按要求對水稀釋后,采用手動氣壓式噴霧器均勻噴施于百合植株上。

1.2.1 消解動態(tài)試驗(yàn)

按有效成分3 000 g/hm2劑量于百合開花前期施藥1次,分別于施藥后當(dāng)天(2 h)和 1,3,5,7,10,14,21,28,35,42 d采樣。每小區(qū)隨機(jī)取采樣點(diǎn),采集生長正常、無病害的地上部分百合植株至少500 g,采用料理機(jī)粉碎,四分法分樣留100 g。于20 ℃貯存,待用。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn)

分別設(shè)推薦劑量(低劑量處理區(qū),有效成分1 500 g/hm2)及2倍推薦劑量(高劑量處理區(qū),有效成分3 000 g/hm2)2個(gè)處理,于百合采挖前約35 d開始首次噴霧施藥,分別施藥2次,施藥間隔期7 d,分別于末次施藥后7,14,21 d采樣。每小區(qū)隨機(jī)取采樣點(diǎn),采集生長正常、無病害的地上和地下部分至少500 g,四分法分樣留100 g。于-20 ℃貯存,待用。

1.3 儀器方法

色譜柱:DB-WAX (36.4 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent Technologies,Santa Clara,CA),全二維氣相調(diào)制器:采用固態(tài)熱調(diào)制器,HV 調(diào)制柱(1.2 m×0.25 mm),起始溫度105 ℃,保持1 min,以25 ℃/min升溫至230 ℃,保持2 min,再以15 ℃/min升溫至280 ℃,保持15 min,進(jìn)樣口溫度:250 ℃,檢測器溫度:280 ℃;載氣:高純氦氣,流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL。離子源溫度:230 ℃,接口溫度:250 ℃,溶劑延遲時(shí)間:1 min,掃描范圍:范圍41～330 m/z。

1.4 樣品前處理

根據(jù)文獻(xiàn)[22]略有改動,稱取10 g試樣于50 mL塑料離心管中,加入40 mL乙腈、4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉,蓋上離心管蓋,劇烈振蕩1 min 后4 200 r/ min離心5 min。吸取20 mL上清液于50 mL塑料離心管中加入885 mg 硫酸鎂、300 mgPSA及200 mg GCB;渦旋混勻1 min。4 200 r/min 離心5 min,準(zhǔn)確吸取2 mL上清液于10 mL試管中;40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两?。加? mL乙酸乙酯復(fù)溶,過微孔濾膜(0.22 μm),用于測定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品配置

精密稱取腐霉利標(biāo)準(zhǔn)品25 mg,用乙酸乙酯定容至10 mL,獲得2.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取3,5-二氯苯胺14.9 mg,用乙腈定容至10 mL,獲得1.49 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 加標(biāo)回收率

分別在空白新鮮百合植株和百合鱗莖樣品中添加3個(gè)水平的腐霉利和3,5-二氯苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平重復(fù)5次,按上述方法及條件進(jìn)行提取和檢測,計(jì)算平均回收率和RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取腐霉利、3,5-二氯苯胺對照溶液,分別按照1.3的方法,進(jìn)樣0.2,0.4,0.6,0.8,1 μL,以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X) 為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積 (Y) 為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。腐霉利標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=7 045 369.067 1X-45 119.622(R2=0.996 9);3,5-二氯苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=4 980 544.616 1X-15 612.498 4(R2=0.999 3)。

2.2 度方法的準(zhǔn)確度和精確度

分別以0.04,0.1,0.2 mg/kg進(jìn)行添加回收率試驗(yàn),每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)3次。3個(gè)水平下的腐霉利在百合鱗莖中添加回收率為89.4%～105.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～4.8%;在百合植株中添加回收率為90.1%～102.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～4.6%。3,5二氯苯胺在百合鱗莖中添加回收率為89.9%～98.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～4.4%;3,5-二氯苯胺在百合丹植株中添加回收率為90.5%～100.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～4.8%。如表1表明該分析方法準(zhǔn)確度和精確度較好,適合腐霉利在百合鱗莖和植株中殘留量測定。

表1 腐霉利及3,5-二氯苯胺在百合植株和鱗莖中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.3 消解動態(tài)特征

2.3.1 腐霉利和3,5-二氯苯胺在百合植株中的消解動態(tài)

如表2用50%腐霉利可濕性粉劑于百合開花前按有效成分300 0 g/hm2的劑量噴霧施藥,百合植株中腐霉利的原始沉積量為0.797 4 mg/kg,隨著季節(jié)變化和百合生長等因素的變化,腐霉利殘留量隨著時(shí)間的推移而逐漸降低,線性擬合表明其消解動態(tài)符合一級動力學(xué)反應(yīng)模型,消解半衰期為21.29 d,在最后42 d消解95%以上。如圖3在噴藥當(dāng)天,百合植株中均檢測出3,5-二氯苯胺,原始沉積量0.2715 mg/kg,線性擬合表明其消解動態(tài)符合一級動力學(xué)反應(yīng)模型,消解半衰期為33.55 d,在最后42 d時(shí)消解95%以上。

表2 腐霉利和 3,5-二氯苯胺在百合植株中的消解動態(tài)

圖3 腐霉利(A) 和3,5-二氯苯胺(B) 在百合植株中的殘留消解曲線

2.3.2 腐霉利和3,5-二氯苯胺在百合鱗莖中的消解動態(tài)

如圖4在噴藥當(dāng)天,在百合植株和鱗莖中均含有腐霉利和3,5-二氯苯胺均有檢出,但殘留量較植株低,腐霉利在第一天時(shí)殘留量最初為0.116 0 mg/kg,而3,5-二氯苯胺最初殘留量為0.022 9 mg/kg,腐霉利及其代謝產(chǎn)物3,5-二氯苯胺在百合鱗莖中的消解均不符合一級動力學(xué)反應(yīng)模型,腐霉利在百合鱗莖中殘留量呈波動變化,在三天時(shí)含量最低,然后呈波動變化,在35 d時(shí)達(dá)到最高后,42 d又降低,說明腐霉利在百合鱗莖中不斷富集和代謝,代謝的速度較慢。3,5-二氯苯胺殘留量呈緩慢波動變化在28 d時(shí)達(dá)到最高,之后緩慢降低,說明3,5二氯苯胺同時(shí)存在富集和代謝。

圖4 腐霉利和 3,5-二氯苯胺在百合鱗莖中的殘留消解曲線

2.4 最終殘留

分別以1 500 g/hm 2及2 倍推薦劑量3 000 g/hm2于百合采挖前約 35 d 開始首次噴霧施藥,分別施藥2次,施藥間隔期 7 d,分別于末次施藥后 7,14,21 d 采樣。最后一次采樣,百合植株已經(jīng)枯萎,但是植株中仍有殘留,高劑量組腐霉利在卷丹植株中殘留量0.167 8 mg/kg,在卷丹鱗莖中殘留量為0.007 0 mg/kg;3,5-二氯苯胺在卷丹植株中殘留量0.083 9 mg/kg,在百合鱗莖中殘留量為0.003 5 mg/kg,低劑量組腐霉利在百合植株中殘留量0.039 8 mg/kg,在百合鱗莖中殘留量0.009 3 mg/kg,3,5-二氯苯胺在百合植株中殘留量0.019 8 mg/kg,在卷丹鱗莖中殘留量0.004 6 mg/kg。

3 總結(jié)討論

本試驗(yàn)通過田間試驗(yàn)研究腐霉利在百合植株和鱗莖中的行為,設(shè)計(jì)空白對照小區(qū)(清水)、低劑量區(qū)、高劑量區(qū)和消解動態(tài)試驗(yàn)區(qū),將50% 腐霉利可濕性粉劑按要求對水稀釋后,采用手動氣壓式噴霧器均勻噴施于百合植株上。通過乙腈提取,GC-MS分析腐霉利及其代謝產(chǎn)物在百合植株和百合鱗莖中的殘留量。消解動態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明,百合植株中腐霉利的原始沉積量為0.797 4 mg/kg,在最后42 d消解95%以上。在噴藥當(dāng)天,百合植株中均檢測出3,5-二氯苯胺,原始沉積量0.271 5 mg/kg,在最后42 d時(shí)消解95%以上,腐霉利和3,5二氯苯胺消解曲線線性擬合表明其消解動態(tài)符合一級動力學(xué)反應(yīng)模型,腐霉利在百合植株中的消解半衰期為21.29 d,3,5二氯苯胺在百合植株中的半衰期為33.55 d。文獻(xiàn)中腐霉利在人參中的半衰期為18.28 d[14],在菠菜中的半衰期為2.4 d和8.9 d[23],這一結(jié)果說明腐霉利及其代謝產(chǎn)物在百合植株中的代謝較慢。最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明,百合鱗莖中腐霉利在第一天時(shí)殘留量最初為0.116 0 mg/kg,而3,5-二氯苯胺最初殘留量為0.022 9 mg/kg,腐霉利及其代謝產(chǎn)物3,5-二氯苯胺在百合鱗莖中的消解均不符合一級動力學(xué)反應(yīng)模型,腐霉利在百合鱗莖中的殘留量波動較大,3,5-二氯苯胺在百合鱗莖中緩慢波動。

最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明,高劑量組腐霉利在卷丹植株中殘留量0.167 8 mg/kg,在卷丹鱗莖中殘留量為0.007 0 mg/kg;3,5-二氯苯胺在卷丹植株中殘留量0.083 9 mg/kg,在百合鱗莖中殘留量為0.003 5 mg/kg,低劑量組腐霉利在百合植株中殘留量0.039 8 mg/kg,在百合鱗莖中殘留量0.009 3 mg/kg,3,5-二氯苯胺在百合植株中殘留量0.019 8 mg/kg,在卷丹鱗莖中殘留量0.004 6 mg/kg。