8-羥基喹啉對小鼠肝臟氧化損傷及微核實驗研究

廖鳳,姚飛虹,馬邵榮,姚晴,張凡,譚麗蓉 ,劉伊歡,徐劍輝

(湘南學院 藥學院,湖南 郴州 423000)

8-羥基喹啉為共軛雜環化合物,含有稠環結構,具有較強的配位能力,大多數8-HQ的鹵代化合物、金屬配合物具有生物活性,常被應用于農業和醫藥領域中。8-羥基喹啉衍生物因其具有抗菌、抗過敏、抗氧化等藥理作用,被廣泛用作抗菌、抗病毒、抗腫瘤類新藥研發中的醫藥中間體,如8-羥基喹啉衍生物喹碘仿、氯碘喹啉等具有抗菌(如真菌、血吸蟲病)、抗病毒(如HIV)、抗腫瘤[1-4]等藥理活性。在農業生產中,有報道8-羥基喹啉鈣可以作為殺菌劑用于黃瓜、馬鈴薯田間防治,丙烯酸喹啉酯類藥物用于麥類的白粉病、葉斑病防治。然而單獨的8-羥基喹啉對魚類具有生理毒性甚至致死和遺傳毒性致胚胎畸形的作用[5-8]。此外,8-羥基喹啉被用于制備金屬有機配合物發光材料,由于8-羥基喹啉應用領域廣泛,本課題組已有研究發現其對小鼠具有一定腎毒性,本研究現開展實驗探究8-羥基喹啉對小鼠肝功能及抗氧化能力是否有影響,為8-羥基喹啉的毒性研究提供一定依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級昆明小白鼠(雌雄各半),體重為18～20 g,購自長沙天勤生物技術有限公司,動物許可證號SCXK(湘) 2022-0011。實驗前喂養7 d適應環境,室溫23～25 ℃、自然光照。實驗前禁食12 h,但不限制飲水。

1.1.2 試劑

8-羥基喹啉(AR,麥克林),羧甲基纖維素鈉(AR,國藥化學);谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總蛋白(TP)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)試劑盒(均購自于南京建成生物工程研究所),環磷酰胺(山西普德藥業有限公司)、吉姆薩染色液(索萊寶生物公司)。

1.2 實驗儀器

超純水機(Direct-Q5,密理博),酶標儀(SpectraMax M2,美谷分子),冷凍高速離心機(H1850RR,湖南湘儀),高速組織分散機(T10,德國IKA),電子平臺(ATX124,日本島津),超低溫冰箱(DW-HL530,中科美菱),移液槍(大龍),顯微鏡(CX31,奧林巴斯)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

選取18～20 g健康小鼠72只,按體重進行隨機分組,每組12只(雌6只、雄6只),共5組。設5組,高、中、低濃度染毒組,溶劑對照組(CMC-Na)、陽性對照組(環磷酰胺)、空白組,劑量組含量分別為70,35,17.5 mg/kg、溶劑對照組為0.5%羧甲基纖維素鈉組、空白組為生理鹽水組,陽性對照組為環磷酰胺(0.1 mg/10 g),連續灌胃7 d。

2.2 樣本采集

各實驗組小鼠連續灌胃給藥8-羥基喹啉7 d,第7 d,給藥后8 h內,小鼠稱重并摘眼球采血,37 ℃水浴10 min后,3 500 r/min離心10 min,收集血清并低溫保存。

2.3 指標檢測

2.3.1 肝臟臟器系數測定

小鼠脫臼處死后,稱重并解剖小鼠分離肝組織、用生理鹽水洗凈血水、濾紙吸干,稱重后液氮保存。按照下列公式計算臟器系數。

肝臟臟器系數=[m肝臟/m體重]×100%

式中:m肝臟為肝臟質量,g;

m體重為體重質量,g。

2.3.2 血清樣本肝功能指標檢測

取低溫保存的血清按試劑盒操作說明進行操作,用微板法測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)的活力。

2.3.3 肝組織抗氧化能力檢測

取液氮凍存的小鼠肝臟,每個肝組織樣本中各加入液氮充分研磨成漿,用生理鹽水制備10%的肝細胞組織勻漿,高速冷凍離心機速離心10～15 min,取2 mL上清液,考馬斯亮藍法檢測血清中總蛋白(TP)、硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量,鉬酸銨法測定過氧化氫酶(CAT)、WST-1法測定超氧化物歧化酶(SOD)、比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)三種酶的活力。檢測步驟按照各試劑盒的實驗說明書操作。

2.3.4小鼠骨髓細胞微核試驗[9]

小鼠脫臼處死后,分離小鼠股骨,取骨髓制片,甲醇固定后用吉姆薩染液染色,顯微鏡下選擇細胞染色均勻的區域觀察,區分灰藍色嗜多染紅細胞(PCE)和橘黃色的正染紅細胞(NCE),含有微核的細胞呈紫紅或藍紫色,各劑量組隨取選6個樣本(雌雄共12只),分別小鼠計數1 000個PCE細胞中含有微核的PCE數,并計數200個細胞中PCE/ NCE的比值。

2.4 統計學處理方法

用SPSS 25.0統計軟件處理,實驗結果采用X±s來表示。單因素方差分析,兩兩比較進行統計分析,p<0.05為差異顯著,p<0.01為差異極顯著,均具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 8-羥基喹啉對雌雄小鼠的肝臟臟器系數的影響

與空白組比較不同劑量8-羥基喹啉作用下的雌雄小鼠肝臟臟器系數中,高劑量組雌雄鼠增加差異顯著,其余均無顯著差異,見下表1。

表1 8-羥基喹啉對小鼠的肝臟臟器系數影響(X±s,n=6)

3.2 8-羥基喹啉對小鼠的肝功能影響

不同濃度8-羥基喹啉作用下的小鼠,其肝功能重要指標:谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的活力受到不同程度的影響,各濃度組雌雄鼠的ALT、AST活性均比空白組顯著增高,高濃度組雌雄小鼠ALT、AST活性增高極顯著,且各組中雄鼠的2種酶活力均比雌鼠的高,結果見表2。

表2 8-羥基喹啉對雌性小鼠肝臟ALT和AST酶活性的影響(X±s,n=6)

3.3 8-羥基喹啉對小鼠的肝臟氧化損傷指標和抗氧化指標的影響

3.3.1 8-羥基喹啉對小鼠的肝氧化損傷指標的影響

肝組織內脂質過氧化產物丙二醛是氧化損傷的主要判斷指標,不同濃度的8-羥基喹啉作用下小鼠肝臟組織中MDA變化如下表3,肝細胞膜內脂質氧化反應隨著濃度增高,愈來愈明顯。

表3 8-羥基喹啉對小鼠肝臟脂質過氧化物生成的影響(X±s,n=6)

3.3.2 8-羥基喹啉對小鼠的肝臟抗氧化指標的影響

當組織細胞內由于自由基發生的氧化反應時,機體內氧化相關酶被激活主要有:過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-PX)等。不同濃度的8-羥基喹啉作用下小鼠肝臟抗氧化酶的活力見表4,各濃度組雌雄小鼠CAT、SOD、GSH-PX活性均較對照組有所下降。

表4 8-羥基喹啉對小鼠肝臟氧化損傷指標的影響(X±s,n=6)

3.4 8-羥基喹啉對小鼠骨髓細胞微核形成的影響

不同濃度的8-羥基喹啉作用下,小鼠的骨髓微核形成結果見表5。各劑量組與生理鹽水組比較,高濃度組小鼠骨髓細胞微核率差異顯著(p<0.05),且低于陽性對照組;顯示各劑量組8-羥基喹啉對小鼠骨髓細胞的微核形成率依次增加。

表5 8-羥基喹啉對小鼠骨髓細胞微核形成的影響(X±s,n=6)

4 討論

實驗動物臟器系數可用于判斷外源化合物對生物有機體的組織器官是否有毒性作用[9],本實驗結果表明70 mg/kg 8-羥基喹啉灌胃給小鼠后,雌雄鼠肝臟臟器系數與空白組對照增加,差異顯著,表明70 mg/kg 8-羥基喹啉可能對小鼠肝臟有一定毒性。

生物體內氧自由基的產生和清除是同時進行。當機體受到外源化學物質誘導產生自由基不能及時清除時,機體會產生損傷。因為大量活性氧導致抗氧化酶將被大量的消耗,迅速產生,而且還產生大量的不飽和脂肪酸,清除氧自由基的速度遠小于產生氧自由基的速度,最后造成了身體很難維持平衡態的結果,該過程又稱為氧化損傷[10-11]。

大多數藥物在體內代謝依賴肝臟內的細胞色素P450酶,當肝細胞氧化損傷時,會使在肝細胞質中的可溶性酶AST和ALT釋放。因此血清的AST和ALT水平的高低可作為反映肝細胞氧化受損的敏感性指標[12]。8-羥基喹啉各劑量染毒組的小鼠明顯比空白組小鼠的AST和ALT酶活性要高,且雄性較雌性小鼠的增加更明顯。

肝臟在清除自由基時,脂質會發生過氧化反應,脂質中包含的不飽和脂肪酸在肝臟清除自由基發生過氧化反應過程時會分解出反應性醛,即丙二醛(MDA),它在一定程度上可能損害細胞膜的結構和功能,因此它能反映肝組織中自由基的含量多少,判斷肝細胞氧化損傷的程度。8-羥基喹啉各劑量染毒組的小鼠明顯比空白組小鼠的MDA含量均高,高,中濃度組的雌雄性小鼠較空白組雌雄性小鼠差異極其顯著(p<0.01),且高濃度的雄性小鼠MDA含量較雌性小鼠的高。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)可以清除細胞內在發生氧化反應后產生的對細胞具有一定毒性的物質,從而保護細胞免受損傷[13]。SOD可消除超氧陰離子自由基(O2-);CAT使O2-·和H2O2水解,產生無毒的水和氧氣;GSH-PX主要作用是催化過氧化氫分解,是機體內極為重要的酶。因此三種酶的活性高低也可作為機體氧化損傷的指標,當細胞內抗氧化酶消耗后,超出機體自身抗氧化能力時,酶的活性下降,細胞組織發生一定程度的損傷。從實驗中得出,8-羥基喹啉各劑量染毒組的小鼠明顯比空白組小鼠的SOD酶、CAT酶、GSH-PX酶活性顯著降低(p<0.05)、高濃度組的差異極顯著(p<0.01),高濃度雄性小鼠三種酶的活力均比雌性小鼠的低,推測不同劑量8-羥基喹啉對小鼠的肝臟具有一定的氧化損傷,其中雄鼠較雌鼠的損傷更嚴重,即雄性小鼠對8-羥基喹啉更敏感。

小鼠骨髓微核實驗中微核的形成作為評價外源化合物對小鼠是否具有致突變性的指標,用微核率表示,微核是細胞在分裂過程中受阻時產生的,它的本質是細胞內的遺傳物質,即當染色體復制或分離受阻時,產生了微核[14]。高劑量組的8-羥基喹啉致雌雄小鼠骨髓細胞微核形成率比較顯著(p<0.05)),對骨髓細胞的分裂、染色體的分離具有一定影響,可能與DNA損傷、DNA突變、紡錘體的運動和形成等有關。

5 結論

17.5～70 mg/kg 8-羥基喹啉對小鼠的肝臟具有一定程度的氧化損傷,推測雄性小鼠對8-羥基喹啉更敏感,高劑量組8-羥基喹啉對小鼠有致突變性,其作用機制有待進一步研究探索。