有機相中乙醛對脂肪酶催化酯交換反應的影響研究

周亞梅,劉佳,王欣巧,馬世蓉

(重慶化工職業學院,重慶 401228)

脂肪酶(Lipase)亦稱三酰基甘油水解酶,因其具有較高的催化活性和選擇性被廣泛應用于醫藥[1]、食品[2-3]、能源化工[4]、廢水處理[5]等工業領域。但游離脂肪穩定性差,對所處的反應環境尤為敏感,反應后分離回收困難,重復利用性不高。為解決這一問題,酶的固定化技術破繭而出,旨在增強酶的穩定性。近年來,以新型聚合物材料為載體,采用物理或化學的方法固定脂肪酶已成為酶固定工程領域的研究熱點。與游離酶相比,固定后的脂肪酶催化活性和立體選擇性提高,在催化酯水解、酯合成、酯交換、高聚物合成及立體異構體拆分等有機合成反應中優勢明顯。

酯交換反應是典型的可逆反應,利用脂肪酶催化酯交換反應,使用烯醇酯作為酰基供體,在合成長鏈酯的過程中離去基團互變異構成乙醛,產物變化抑制逆向反應。而且由于乙醛的易揮發性可以從反應體系中進行分離,從而使得反應步驟不可逆,有利于反應向生成產物的方向移動,反應速率和收率明顯提高。但研究發現,反應過程中副產物乙醛的存在會對脂肪酶的活性造成一定的影響。乙醛易與脂肪酶表面上帶正電的賴氨酸殘基反應生成Schiff堿,阻礙酶與底物的結合,從而使得酶活性鈍化甚至失活[6-10]。Han等人[11]將熒光假單胞菌脂肪酶(PFL)固定在經戊二醛活化后的聚脲多孔材料上,得到固定脂肪酶。將此固定酶作為催化劑,用于(R,S)-1-苯乙醇外消旋化合物和乙酸乙烯酯的酯交換反應對1-苯乙醇進行手性拆分(圖1)。研究表明,隨著反應時間的延長,與不加乙醛的反應體系相比,體系中乙醛存在的情況下,立體選擇性E值出現明顯的下降趨勢,相對而言酶的催化活性降低程度較小。

圖1 (R,S)-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯的酯交換反應

湘潭大學熊龍斌[12]就乙醛影響脂肪酶催化反應的作用機制進行了研究,提出了乙醛對脂肪酶活性具有抑制作用,主要以化學結合的方式作用于酯交換反應。樊斌[13]通過酯交換反應,分析了乙醛對酶催化性能的影響,發現乙醛對酶促酯交換反應的影響表現出低促高抑的Hormesis現象。在此基礎上,考察了副產物乙醛的存在對脂肪酶催化性能的影響,并給出了乙醛存在下固定酶的重復利用性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲苯二異氰酸酯(TDI),工業級,北京科聚化學新材料有限公司;二乙烯三胺(DETA),分析純,山東西亞化學工業有限公司;(R,S)-1-苯乙醇,熒光假單胞菌脂肪酶(PFL),Sigma-Aldrich;正己烷和異丙醇,色譜純,天津科密歐化學試劑有限公司;正辛烷,分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;乙腈和正庚烷(分析純),天津市富宇精細化工有限公司;異辛烷和乙酸乙烯酯(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;乙醛(>99.5%)和戊二醛(GA)均購買于阿拉丁公司。

高效液相色譜儀(HPLC,美國Agilent 1260公司;OD-H手性柱,4.6 mm×250 mm,大賽璐藥物手性技術上海有限公司)。

1.2 脂肪酶(PFL)的固定

在250 mL圓底燒瓶中加入90 g乙腈作為反應介質,在300 r/min的攪拌速率下以20 mL/h的速率滴加TDI (7.2 g),同時以10 mL/h的速率滴加DETA (2.8 g),恒溫水浴(30 ℃)中繼續反應至24 h。對產物進行離心分離,置于60 ℃的真空干燥箱中烘干至恒重,得到白色粉末狀聚脲(PPU)。將1 g PPU超聲分散至30 mL GA溶液中,設置恒溫水浴振蕩器溫度為30 ℃,振頻為140 osc/min。反應5 h后用超純水多次離心洗滌。將洗滌后的固體放入60 ℃的真空干燥箱干燥12 h,得到活化后的聚脲多孔材料(GA-PPU)。

稱取50 mg GA-PPU放入5 mL的血清瓶中,加入3 mL PFL溶液(pH值8.0),超聲分散均勻后在30 ℃的恒溫水浴振蕩器中以140 osc/min的振頻反應5 h,完成后用緩沖溶液離心洗滌得到固定PFL脂肪酶,冷凍干燥后備用。

1.3 乙醛對固定PFL催化性能影響

以有機相為溶劑,在25 mL比色管中加入2 mL濃度為0.25 mol/L苯乙醇和2 mL濃度為0.5 mol/L的乙酸乙烯酯溶液,并向其中加入0.2 mg固定酶和一定濃度的乙醛,同時做空白實驗(相同條件下不加乙醛)。在既設定好條件的恒溫水浴振蕩器中反應24 h。反應過程中每隔一段時間取出0.2 mL反應液,用正己烷稀釋至10 mL,由HPLC檢測濾液中底物1-PEOH和產物乙酸苯乙酯中R型和S型光學異構體的含量。底物和產物對映體過量值(ees、eep)、轉化率(C)、對映體選擇率(E)分別由Chen等人給出的公式[14]計算。實驗過程中改變加入的乙醛濃度、反應溶劑、反應溫度,研究副產物乙醛的存在對脂肪酶催化性能的影響。

2 結果與討論

2.1 乙醛濃度對脂肪酶催化性能的影響

以正己烷為溶劑,在25 mL比色管中加入2 mL濃度為0.25 mol/L苯乙醇和2 mL濃度為0.5 mol/L的乙酸乙烯酯溶液,并向其中加入0.2 mg固定PFL脂肪酶和一定濃度的乙醛。在0.006 mol/L至0.056 mol/L改變乙醛濃度,反應溫度40 ℃下反應24 h。同時做空白體系對照實驗(不加乙醛),結果如圖2所示。

圖2 乙醛濃度對eep和轉化率C的影響

從表1結果可以看出,與不加乙醛的反應體系相比,乙醛的加入導致了酶的催化活性和立體選擇性下降。隨著乙醛濃度的增大,體系底物轉化率和酶的立體選擇性先增大后減小。當加入的乙醛濃度增大為0.025 mol/L時,底物轉化率由45.6%增至47.3%,對映體選擇率由129.3增至145.8。繼續增加乙醛濃度,體系轉化率C和E均有所下降。這表明低濃度乙醛可促進酶的催化能力,高濃度乙醛則抑制酶的催化能力。這是因為脂肪酶分子活性中心上方存在α-螺旋結構,通常被稱之為“蓋子”。由于反應過程中熱運動使得“蓋子”存在輕微的開合運動,而乙醛分子相對于酶分子較小,所以乙醛完全可以滲入酶分子內部使得酶分子構象更加舒展,柔性增加從而提高酶的活性。但乙醛濃度過高,滲入乙醛太多,酶的構象變化太大反而會使得酶的活性降低[11,15]。此外,極性分子乙醛易與脂肪酶上某些帶電的基團反應,如帶正電的賴氨酸殘基反應生成Schiff堿,阻礙酶的活性中心與底物結合,從而導致脂肪酶活性下降[16,18]。因此選擇濃度為0.025 mol/L的乙醛進行后續實驗。

表1 乙醛濃度對反應體系E值的影響

2.2 乙醛存在下反應溶劑對脂肪酶催化性能的影響

有機溶劑作為酶催化酯交換反應的介質,在某種程度上影響酶的催化活性及立體選擇性,因此選擇一種合適的有機溶劑對于酯交換反應尤為重要。固定反應體系中加入的乙醛濃度為0.025 mol/L,其余反應條件保持不變,改變反應溶劑為異辛烷、正辛烷、正己烷、正庚烷。同時做空白體系對照實驗(不加乙醛),結果如圖3所示。

圖3 乙醛存在下反應溶劑對eep和轉化率C的影響

從表2給出的結果可以看出,在任何溶劑中,相同反應條件下與不加乙醛的反應體系相比,加入乙醛后的反應體系中底物轉化率和立體選擇性均有所下降,表明乙醛的存在抑制了酶的催化活性和立體選擇性。相較而言,以異辛烷為溶劑,加入乙醛后體系中底物轉化率由47.0%下降至38.2%,E值由106.9降至66.3。以正辛烷和正庚烷為溶劑,乙醛存在下體系中底物轉化率下降幅度遠小于異辛烷。以正己烷為溶劑,相較于空白對照組,底物轉化率只下降了0.3%。相同條件下底物轉化率C和立體選擇率E均高于其余體系。這表明有機溶劑的分子碳鏈越長即疏水性越高(異辛烷>正辛烷>正庚烷>正己烷),乙醛對脂肪酶的抑制作用就越強。究其原因脂肪酶發揮其活性必須要維持其表面的必需水,而乙醛又屬于極性小分子,在疏水性強的溶劑中易影響底物或產物在有機相中的分配,更易剝奪脂肪酶表面的必需水,從而影響脂肪酶的催化活性和立體選擇性。另外,乙醛的存在還有可能改變構成酶蛋白活性結構的氫鍵,影響其活性構型的疏水作用,進而影響酶的催化[12]。因此,在乙醛存在的前提下,以正己烷作為反應介質可以使脂肪酶的催化活性受到的抑制最小。

表2 乙醛存在下反應溶劑對反應體系E值的影響

2.3 乙醛存在下反應溫度對脂肪酶催化性能的影響

每一個生物催化反應都有其一定的最適溫度的存在,溫度對酶催化反應主要是影響其熱能和空間結構,酶的催化效率在這兩者之間保持一個平衡。固定反應體系中加入的乙醛濃度為0.025 mol/L,以正己烷為溶劑,其余反應條件保持不變,在10～50 ℃之間改變反應溫度。同時做空白體系對照實驗(不加乙醛),結果如圖4所示。

圖4 乙醛存在下反應溫度對eep和轉化率C的影響

如表3結果所示,相同反應溫度下,乙醛的存在降低了脂肪酶的催化活性和立體選擇性。10 ℃下底物轉化率由空白組的40.5%降低至5%,E值降低至7.9,產物對映體過量值eep降低至76.7%。將溫度升高至20 ℃,底物轉化率由40.8%降低至18.4%,E值降低至85.7。繼續升高反應溫度,可以看出底物轉化率下降幅度仍然有所減小。反應溫度為40 ℃時,底物轉化率為47.3%,相較于空白組只降低了0.3%,E值為145.8。與其余體系相比,酶的催化活性和選擇性下降程度較低,這表明固定PFL脂肪酶在此溫度下催化活性和立體選擇性受到的抑制最小[18]。可以看出在考察的溫度范圍內酶的活性和立體選擇性明顯受到乙醛抑制。低溫階段,乙醛的抑制作用較明顯,隨著溫度的升高,抑制作用不斷減弱。這可能是因為由于溫度的升高超過了乙醛的沸點,加速了乙醛的揮發,從而緩解了乙醛引起的脂肪酶分子撓度下降,使得脂肪酶的構象未遭到全部破壞[12]。

表3 乙醛存在下反應溫度對反應體系E值的影響

2.4 乙醛存在下固定酶的重復利用性

為了考察乙醛對固定PFL酶的影響深度,固定乙醛的濃度為0.025 mol/L,以正己烷為溶劑,在25 mL比色管中加入2 mL濃度為0.25 mol/L的苯乙醇溶液和2 mL濃度為0.5 mol/L的乙酸乙烯酯溶液,以0.2 mg固定酶作為催化劑在反應溫度40 ℃下催化酯交換反應24 h。將反應后的脂肪酶回收并用正己烷進行洗滌,室溫干燥后繼續用于催化反應。每次重復實驗中重新加入濃度為0.025 mol/L的乙醛,同時進行空白體系對照實驗(不加乙醛),實驗結果如表4所示。

表4 乙醛存在下固定PFL的重復使用性

從表4中可以看出,與空白對照實驗相比,加入乙醛后脂肪酶的催化活性明顯下降,且隨著重復使用次數越多,抑制效果越明顯,底物轉化率和E值下降越快。該結果表明乙醛作用于脂肪酶活性的方式主要是化學結合,一旦乙醛與酶結合后便會持久的作用于每一次酯交換反應,致使酶的主鏈結構、微環境發生改變,破壞酶分子活性中心結構,酶的催化性和對映體選擇性降低,這與熊[12]等人研究一致。

3 結論

酯交換反應是工業中一類重要的化學反應,利用脂肪酶催化苯乙醇和乙酸乙烯酯酯交換反應,反應過程中副產物乙烯醇互變異構成乙醛,該物質對脂肪酶的活性和選擇性具有抑制作用。以聚脲多孔材料為載體固定熒光假單胞菌脂肪酶,將此固定酶作為催化劑,用于1-苯乙醇外消旋化合物和乙酸乙烯酯的酯交換反應,探討了副產物乙醛的存在對脂肪酶性能的影響。結果表明,加入乙醛后脂肪酶的催化活性和選擇性受到明顯抑制。乙醛在不同有機溶劑體系中對脂肪酶酯交換反應的催化活性有較大差異,對疏水性越高的有機溶劑體系的酶活抑制作用越強;低溫階段乙醛對脂肪酶的抑制作用大于高溫階段。重復使用5次后,與第一次相比,相同的反應時間下,體系轉化率下降至19.4%,對映體選擇率下降至26,表明體系中乙醛的存在使得脂肪酶的失活速率更明顯,這也證實了我們的猜想在脂肪酶催化酯交換反應中,副產物乙醛會影響酶催化活性和對映體選擇性。