白樺脂醇納米乳的制備及其在S180荷瘤小鼠體內分布研究

王立鑫 李鑫 蒙天琛 楊波

本文引用： 王立鑫， 李? 鑫， 蒙天琛， 楊? 波. 白樺脂醇納米乳的制備及其在S180荷瘤小鼠體內分布研究[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（4）： 587-591.

〔摘要〕 目的 制備白樺脂醇納米乳，研究其在S180荷瘤小鼠體內的分布情況。方法 通過相轉變法制備白樺脂醇納米乳，腹腔注射白樺脂醇納米乳和白樺脂醇注射液，采用HPLC方法測定小鼠各組織中的藥物濃度并計算藥動學參數，分析比較兩種制劑在小鼠體內組織分布情況。結果 白樺脂醇納米乳在各組織中Cmax和AUC依次為：腫瘤組織>肝>腎>脾>肺>心臟，且均高于白樺脂醇注射液組（P<0.05）;腫瘤組織和肝臟的峰濃度比Ce分別為1.53和1.54;腫瘤的靶向效率Te值最大。結論 與白樺脂醇注射液相比，白樺脂醇納米乳在腫瘤組織和肝臟中的分布顯著增加（P<0.01），白樺脂醇納米乳對腫瘤組織具有明顯的靶向性。

〔關鍵詞〕 白樺脂醇;納米乳;體內分布;靶向性

〔中圖分類號〕R? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.009

Preparation of betulin nanoemulsion and its distribution in S180?tumor-bearing mice

WANG Lixin， LI Xin*， MENG Tianchen， YANG Bo

School of Pharmacy， Harbin University of Commerce， Harbin， Heilongjiang 150028， China

〔Abstract〕 Objective To prepare betulin nanoemulsion and study its distribution in S180 tumor-bearing mice. Methods Betulin nanoemulsion was prepared by phase transition method. After intraperitoneal injection of betulin nanoemulsion and betulin injection， HPLC method was used to determine the drug concentration in various tissues of mice and calculate the pharmacokinetic parameters. The tissue distribution of the two preparations in mice was analyzed and compared. Results The Cmax and AUC of betulin nanoemulsion in each tissue were as follows： tumor tissue>liver>kidney>spleen>lung>heart， all higher than those in betulin injection group （P<0.05）; the peak concentration ratios （Ce） in tumor tissue and liver were 1.53 and 1.54， respectively; the tumor targeting efficiency （Te） value was the highest. Conclusion Compared with betulin injection， betulin nanoemulsion significantly increased distribution in tumor tissues and liver （P<0.01）， and betulin nanoemulsion exhibited obvious targeting towards tumor tissues.

〔Keywords〕 betulin; nanoemulsion; in vivo distribution; targeting

白樺脂醇（betulin）廣泛存在于酸棗仁、石榴樹皮、白樺樹皮等物質中[1]，屬于羽扇豆烷型的天然五環三萜化合物（pentacyclic triterpenoids，PTs）[2]，其在保護心肌細胞、抗輻射、抗疲勞、耐缺氧、抗炎以及抗癌方面均有具有良好的藥理作用[3-7]。白樺脂醇可作為潛在的抗腫瘤藥物，但由于其水溶性差、生物利用度低，限制了其臨床應用。

納米乳（nano emulsion）是由油相、水相和表面活性劑組成的熱力學穩定體系，其平均粒徑為1～100 nm。近年來，納米乳應用發展迅速，涉及制藥、食品等多個領域[8]。

為研究白樺脂醇對腫瘤組織的靶向性，本文采用肉豆蔻酸異丙酯（IPM）作為油相;吐溫-80和丙三醇作為表面活性劑，通過小鼠體內組織分布實驗，比較白樺脂醇納米乳和白樺脂醇注射液在荷瘤小鼠體內的分布特性。

1 材料

1.1? 實驗儀器

SW-CJ-ID單人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;TDL-60B臺式低速離心機（上海安亭科學儀器廠）;QL-861渦旋器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;MCO-15AC CO2培養箱（日本SANYO公司）;高效液相色譜儀（美國Dionex公司）;Welchrom C18色譜柱（上海月旭科技有限公司）;UltiMate3000紫外檢測器（美國Dionex公司）;DF-101S集熱恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）;LitesizerTM 500納米粒度電位儀（奧地利Anton Paar公司）;JEM-2100F透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2? 藥品與試劑

白樺脂醇（西安西海生物科技有限公司，質量分數98%，批號：20231101）;甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）;甲酸（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）;肉豆蔻酸異丙酯（上海阿拉丁試劑有限公司，分析純）;吐溫-80（天津百倫斯生物技術有限公司，分析純）;丙三醇（天津市天力化學試劑有限公司，分析純）;純凈水（娃哈哈集團有限公司）。

1.3? 動物來源

健康的SPF級昆明小鼠，雄性，5～6周，體質量18～20 g，由長春億斯實驗動物技術有限責任公司提供，動物合格證號：SCXK（吉）2023-0003。該實驗經哈爾濱商業大學倫理委員會批準，編號為：HSDYXY-2022028。

1.4? 細胞來源

S180腫瘤細胞：由中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心提供。

2 方法

2.1? 白樺脂醇樣品的制備

白樺脂醇納米乳的制備：取處方量白樺脂醇加入到15%肉豆蔻酸異丙酯（IPM）混合，渦旋5 min，37 ℃、100 r/min震蕩48 h。取出后以5 000 r/min離心5 min，離心半徑為40 cm，吸取上清液，加入23%吐溫-80與41%丙三醇，在53 ℃下，1 050 r/min轉速，磁力攪拌6 min，逐滴加入23%蒸餾水，得到5 mg·mL-1帶有淡藍色乳光的淡黃色白樺脂醇納米乳。

白樺脂醇注射液的制備：取處方量白樺脂醇、吐溫-80加入生理鹽水中分散均勻，制成濃度為5 mg·mL-1的注射液[9]。

2.2? 白樺脂醇納米乳的評價

通過投射電鏡觀察白樺脂醇納米乳的狀態;通過粒度儀考察其粒徑、多分散指數和Zeta電位;考察包封率。

2.3? 體外釋藥考察

2.3.1? HPLC方法線性試驗及其方法學考察? 精密吸取白樺脂醇對照品加甲醇定容，超聲5 min溶解，配制成4、60、100、120、160、200 μg·mL-1系列濃度的對照液。以色譜峰峰面積平均值Y為縱坐標，白樺脂醇標準溶液濃度X（mg·mL-1）為橫坐標進行線性回歸，得到白樺脂醇對照品回歸方程。配制濃度為100、120、160 μg·mL-1的白樺脂醇對照品溶液，分別在一天內進行重復測量3次，重復測量3 d，并計算日內和日間精密度。精密量取白樺脂醇納米乳1.0 mL 9份，分別精密加入100、120、160 μg·mL-1濃度的標準品溶液1.0 mL，分別進樣，記錄峰面積，代入標準曲線，計算回收率。配制濃度為100、120、160 μg·mL-1的白樺脂醇對照品溶液，分別于0、2、4、6、8 h測定，考察重復性。于室溫避光防放置24 h后測定，考察穩定性。

2.3.2? 體外釋放方法? 精密量取2 mL白樺脂醇納米乳置于處理后的透析袋中，排盡氣泡后將兩端扎緊，置于100 mL的pH 7.4的PBS緩沖液中。在37 ℃條件下，100 r/min水浴振蕩，分別于15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h取樣1 mL，同時補加同溫等量介質。根據標準曲線計算累積釋放度，繪制釋放曲線。

2.4? S180荷瘤小鼠模型的建立

S180腫瘤細胞經體外復蘇傳代后[10-12]，在小鼠腹腔內傳代5 d，無菌抽取小鼠腹腔內乳白色腹水，用無菌生理鹽水按1∶3.5稀釋，用無菌注射器吹打攪拌均勻。吸取0.2 mL腫瘤細胞懸液，接種于小鼠的右側前肢腋下，生長1周后備用[13]。

2.5? 白樺脂醇體內測定方法的建立

2.5.1? 溶液的配制? 標準溶液的配制：精密稱取適量白樺脂醇標準品于25 mL容量瓶中，加入甲醇定容，超聲波震蕩5 min，即得濃度為400 μg·mL-1的標準儲備液，保存在4 ℃冰箱中備用。

內標物溶液的配制：精密稱取適量齊墩果酸標準品于25 mL容量瓶中，加入甲醇定容，超聲波震蕩5 min，即得濃度為400 μg·mL-1的內標物溶液，保存在4 ℃冰箱中備用[9]。

2.5.2? 色譜條件? 色譜柱：Welchrom C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μL）;流動相∶甲醇∶0.2%甲酸（80∶20）;流速：1 mL/min;檢測波長：210 nm;柱溫：30 ℃;進樣量：20 μL。

2.6? 組織樣品的處理

精密稱定小鼠的心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織，加入生理鹽水制備為0.1 g·mL-1的勻漿液。精密移取各組織勻漿液200 μL，加入20 μg·mL-1的內標齊墩果酸溶液20 μL，加入磷酸20 μL，漩渦混勻，靜置10 min后加入1 mL乙酸乙酯，渦旋混勻后以3 500 r/min離心15 min，離心半徑40 cm，取上層溶液于35 ℃水浴吹干，加入甲醇50 μL復溶，離心[14-15]。按“2.5.2”項下色譜條件進樣檢測。

2.7? S180荷瘤小鼠組織分布實驗

取S180荷瘤小鼠42只，隨機分成兩組，分別給予白樺脂醇注射液（5 mg·mL-1）和白樺脂醇納米乳（5 mg·mL-1），以50 mg/kg單劑量腹腔注射給藥一次后，分別于給藥0.25、0.5、1、2、4、6、8 h后，脫頸處死小鼠。每個時間點處死3只小鼠，取心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織，清洗組織表面血液，濾紙吸干，精密稱量后放入EP管中備用，再按照“2.6”項下方法處理。

比較給藥后白樺脂醇納米乳和白樺脂醇注射液在體內的分布情況。以峰濃度比（Ce）、相對攝取率（Re）和靶向效率（Te）為指標評價制劑靶向性[16]。

3 結果

3.1? 白樺脂醇納米乳的外觀形態、粒徑、PDI及Zeta電位

透過電鏡觀察白樺脂醇納米乳見圖1;白樺脂醇納米乳平均粒徑為（34.9±0.24） nm，PDI為8.93%±1.43%;平均Zeta電位值為（26.03±0.47） mV。

3.2? 白樺脂醇納米乳包封率的考察

精密量取0.5 mL白樺脂醇納米乳于超濾離心管中，室溫下10 000 r/min的速度離心15 min，取外管溶液20 μL，加入甲醇稀釋至1 mL，檢測游離的白樺脂醇含量。另取相同批次制備的白樺脂醇納米乳取20 μL，加入甲醇稀釋至1 mL，超聲混勻，檢測白樺脂醇納米乳中藥物的總含量。結果顯示白樺脂醇納米乳包封率平均值為99.0%，包封率較高。

3.3? 體外釋藥考察

3.3.1? 方法學考察? 得到回歸方程為Y=0.096 4X-1.296 3，R2=0.999 9，線性范圍是40～200 μg·mL-1。結果顯示日內和日間精密度RSD均小于2%，回收率為95%～105%，重復性和穩定性RSD均小于2%。該方法可以用來考察釋放度。

3.3.2? 釋放度方程的擬合? 以累計釋放度Q對時間t作圖得到累計釋放曲線，見圖2。利用Orign 2021軟件對白樺脂醇納米乳的體外釋放按照零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程進行擬合，記錄相關系數，見表1。白樺脂醇納米乳在一級釋藥模型的擬合度最高，說明白樺脂醇納米乳釋放速度主要受藥物濃度的影響。

3.4? 方法學考察

3.4.1? 專屬性考察? 以肝組織為例，組織中內源性物質不干擾藥物的測定，該方法專屬性好。詳見圖3。

3.4.2? 標準曲線的測定結果? 取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織勻漿液200 μL，加入白樺脂醇對照品，配制成10、20、40、80、160、240 μg·mL-1系列濃度對照品溶液[9]。按照“2.6”項下處理組織樣品，按照“2.5.2”項下色譜條件，測定血漿和組織樣品。以白樺脂醇峰面積與內標物齊墩果酸峰面積的比值（Y）對組織中的藥物濃度（X）做線性回歸，得各個組織樣品的回歸方程。詳見表2。

3.4.3? 精密度和回收率? 分別取各空白組織勻漿液200 μL，配制白樺脂醇低（20 μg·mL-1）、中（60 μg·mL-1）、高濃度（100 μg·mL-1）的溶液，按照“2.6”項下處理組織樣品后進樣分析。分別在一天內進行重復測量3次，重復測量3天，并計算日內和日間精密度，計算方法回收率和提取回收率。結果顯示日內精密度和日間精密度均小于8.7%;3種濃度的方法回收率為98%～104%;提取回收率為95%～103%，滿足測試方法學要求。

3.4.4? 重復性和穩定性? 分別取各空白組織勻漿液200 μL，配制白樺脂醇低（20 μg·mL-1）、中（60 μg·mL-1）、高濃度（100 μg·mL-1）的溶液。分別于0、2、4、6、8 h，按照“2.6”項下處理組織樣品后進樣分析;分別取各空白組織勻漿液200 μL，配制白樺脂醇低（20 μg·mL-1）、中（60 μg·mL-1）、高濃度（100 μg·mL-1）的溶液各5份。分別于室溫放置24 h，-20 ℃反復凍融2次，按照“2.6”項下方法處理組織樣品后進樣分析。結果顯示，3種濃度的重復性RSD均小于9.1%;3種濃度的室溫穩定性和凍融穩定性RSD均小于9.4%，滿足測試方法學要求。

3.5? 小鼠體內組織分布研究

與白樺脂醇注射液小鼠各組織AUC相比，白樺脂醇納米乳組小鼠各組織的AUC均增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。白樺脂醇納米乳與白樺脂醇注射液在小鼠各組織中的藥物分布見圖4。

與白樺脂醇注射液小鼠各組織Cmax相比，白樺脂醇納米乳組小鼠各組織的Cmax均增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。腫瘤組織的Te值為1.16，說明白樺脂醇納米乳對腫瘤有靶向選擇性。詳見表4—5。

4 結語

白樺脂醇納米乳在小鼠體內的分布研究中，各組織中AUC和Cmax均比白樺脂醇注射液有所提高。將白樺脂醇制備為納米乳后，提高了藥物的溶解度，同時納米乳的粒徑較小，大幅度增加了溶出面積，加速藥物溶出和吸收，從而提高了組織中藥物濃度。白樺脂醇納米乳在肝臟和腫瘤組織中的分布明顯高于其他臟器組織，推測白樺脂醇納米乳微粒被肝臟網狀內皮系統吞噬而實現藥物大量滯留。腫瘤細胞由于增殖速度較快，使得腫瘤組織內血管和淋巴管不完整，從而導致納米乳容易從血管內滲漏到腫瘤組織內，且難以從淋巴管回流，因此，表現出腫瘤組織中藥物的分布較高。但各組織的Te值中，只有腫瘤組織的Te值大于1，所以白樺脂醇納米乳對腫瘤組織具有明顯的靶向性。

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〔基金項目〕中央支持地方高校改革發展資金人才培養項目。

〔通信作者〕*李? 鑫，男，副教授，碩士研究生導師，E-mail：102105@hrbcu.edu.cn。