基于Nrf2/HO-1通路探討捏脊改善孤獨(dú)癥大鼠行為障礙的機(jī)制研究

蘇麗紅 郭榕蕙 洪燕玲 林麗莉

本文引用： 蘇麗紅， 郭榕蕙， 洪燕玲， 林麗莉. 基于Nrf2/HO-1通路探討捏脊改善孤獨(dú)癥大鼠行為障礙的機(jī)制研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2024， 44（4）： 592-599.

〔摘要〕 目的 從氧化應(yīng)激及核因子NF-E2相關(guān)因子-2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）通路探討捏脊改善孤獨(dú)癥大鼠行為障礙的作用機(jī)制。方法 將孤獨(dú)癥模型大鼠隨機(jī)分為模型組、捏脊組，每組9只;同時(shí)納入9只正常大鼠為空白組。捏脊組進(jìn)行捏脊，21次/d，持續(xù)28 d。干預(yù)結(jié)束，各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)后處死取材，灌注固定后Nissl染色檢測(cè)海馬CA1、CA2區(qū)神經(jīng)元損傷情況，取海馬以生化試劑盒檢測(cè)還原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase， CAT）表達(dá)，Western blot檢測(cè)Nrf2及其磷酸化指標(biāo)p-Nrf2、HO-1、NAD（P）H：醌氧化還原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1， NQO1]表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組社交指數(shù)、站立次數(shù)均顯著降低（P<0.01），理毛次數(shù)顯著增多（P<0.01）;與模型組比較，捏脊組社交指數(shù)、站立次數(shù)均明顯提升（P<0.01），理毛次數(shù)減少（P<0.05）?？瞻捉M神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，形態(tài)規(guī)則，尼氏體數(shù)量豐富;模型組有大量神經(jīng)元受損，細(xì)胞核固縮深染，細(xì)胞膜破裂、邊界模糊，尼氏體偏移、溶解，尼氏體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少;捏脊組細(xì)胞排列基本整齊，核固縮形態(tài)有所改善，細(xì)胞形態(tài)可，尼氏體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加。與空白組比較，模型組GSH、SOD、CAT、p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)量均降低（P<0.05或P<0.01），MDA表達(dá)量明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，捏脊組GSH、SOD、CAT、p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)量均升高（P<0.05或P<0.01），MDA表達(dá)量顯著下降（P<0.01）。結(jié)論 捏脊能改善孤獨(dú)癥大鼠行為障礙，與其活化Nrf2/HO-1通路、引起抗氧化因子表達(dá)、改善氧化應(yīng)激、減輕神經(jīng)元損傷有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 孤獨(dú)癥;捏脊;氧化應(yīng)激;Nrf2/HO-1通路;社交行為;海馬區(qū)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R244.1? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.010

Mechanism of spine pinching in behavioral improvement of autistic rats based on Nrf2/HO-1 pathway

SU Lihong1， Guo Ronghui1， Hong Yanling1， LIN Lili1，2*

1. Fujian University of Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350122， China;

2. Fujian Academy of Chinese Medical Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of action of spine pinching in behavioral improvement of autistic rats from the perspective of oxidative stress and the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）/heme oxygenase-1 （HO-1） pathway. Methods The autism model rats were randomized into model group and spine-pinching group， with nine rats in each group. Nine normal rats were included as the blank group. In the spine-pinching group， spine-pinching manipulation was performed 21 times/d for consecutive 28 d. After the intervention， the rats in each group were sacrificed for sampling after behavioral tests. After perfusion and fixation， Nissl staining was performed to determine the neuronal damage in the CA1 and CA2 regions of the hippocampus， biochemical kits were applied to measuring the expressions of reduced glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， and catalase （CAT） in the hippocampus， and Western blot was used to examine expressions of Nrf2 and its phosphorylation indicators p-Nrf2， HO-1， and NAD（P）H： quinone oxidoreductase 1 （NQO1）. Results Compared with the blank group， the model group exhibited significantly lower social index and standing frequency （P<0.01）， as well as a significant increase in grooming frequency （P<0.01）. Compared with the model group， the spine-pinching group showed a significant improvement in social index and standing frequency （P<0.01）， with a reduction in grooming frequency （P<0.05）. In the blank group， the neurons were closely arranged， morphologically regular， and abundant in Nissl bodies. However， in the model group， a large number of neurons were damaged， with pyknotic and deeply stained nuclei， ruptured cell membranes， blurred cell boundaries， displaced and dissolved Nissl bodies， and a decrease in the number of Nissl-positive cells. In the spine-pinching group， cells were basically arranged neatly， with relieved nuclear pyknosis， acceptable cellular morphology， and an increase in the number of Nissl-positive cells. Compared with the blank group， GSH， SOD， CAT， p-Nrf2/Nrf2， HO-1， and NQO1 expressions in the model group decreased （P<0.05 or P<0.01）， and MDA expression significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， GSH， SOD， CAT， p-Nrf2/Nrf2， HO-1， and NQO1 expressions were higher （P<0.05 or P<0.01） and MDA expression was significantly lower （P<0.01） in the spine-pinching group. Conclusion Spine pinching can improve the behaviors of rats with autism， the mechanism of which is related to activating the Nrf2/HO-1 pathway， inducing the expressions of antioxidant factors， relieving oxidative stress， and reducing of the neuronal damage.

〔Keywords〕 autism; spine pinching; oxidative stress; nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1 pathway; social behavior; hippocampus

孤獨(dú)癥（autism），又稱自閉癥，以溝通能力障礙、社會(huì)交往能力異常、刻板行為和單一興趣為特征。迄今為止，孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制尚未闡明，并且仍然缺少針對(duì)孤獨(dú)癥核心癥狀的有效藥物?？拱d癇藥丙戊酸鈉（sodium valproate， VPA）被認(rèn)為是孤獨(dú)癥的環(huán)境危險(xiǎn)因素，妊娠期間孕母的VPA治療可導(dǎo)致新生兒孤獨(dú)癥[1]。VPA被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的觸發(fā)因素，能夠引發(fā)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成，ROS通過(guò)破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA來(lái)干擾神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育[2]。核因子NF-E2相關(guān)因子-2（nuclearfactor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）通路被認(rèn)為是腦組織中重要的抗氧化應(yīng)激通路，氧化應(yīng)激促使游離狀態(tài)下的Nrf2發(fā)生了磷酸化入核，激活抗氧化因子的表達(dá)，同時(shí)還可誘導(dǎo)內(nèi)源性防御系統(tǒng)以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷[3]。

素有“病變?cè)谀X，首取督脈”的觀點(diǎn)[4-5]，而捏脊也成為小兒推拿在腦病研究中的常用手段之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，捏脊可以改善自閉癥大鼠的焦慮樣行為，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種改善可能與捏脊抑制NF-κB通路的過(guò)度激活有關(guān)[6]。但氧化應(yīng)激作為孤獨(dú)癥效應(yīng)及機(jī)制研究領(lǐng)域新進(jìn)的關(guān)注熱點(diǎn)，尚且缺少研究探討捏脊干預(yù)是否與氧化應(yīng)激及其N(xiāo)rf2/HO-1通路存在關(guān)聯(lián)。因此，擬通過(guò)研究捏脊對(duì)孤獨(dú)癥大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)氧化/還原代表性指標(biāo)還原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase， CAT），和Nrf2/HO-1通路重要指標(biāo)Nrf2及其磷酸化指標(biāo)p-NRF2、HO-1、NAD（P）H：醌氧化還原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]表達(dá)，以及神經(jīng)元損傷的影響，探索捏脊改善孤獨(dú)癥大鼠行為障礙的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物

成年健康Wistar大鼠26只，雌雄各半，雌性大鼠體質(zhì)量為200～220 g，雄性大鼠體質(zhì)量為220～250 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007，喂養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：溫度20～24 ℃、相對(duì)濕度40%～60%、明暗各12 h交替，自由進(jìn)食及飲水，普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)已通過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2022-185）。

1.2? 主要試劑與儀器

鼠單克隆抗體β-actin、鼠單克隆抗體HO-1、兔多克隆抗體Nrf2、Anti-Mouse二抗、Anti-Rabbit二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為66009-1-Ig、66743-1-Ig、16396-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）;兔多克隆抗體p-Nrf2（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號(hào)：DF7519）;兔單克隆抗體NQO1（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：Ab80588）;尼氏染色液（索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：G1436）; MDA試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH試劑盒、蛋白定量（TP）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為A003-1-1、A001-3-2、A007-1-1、A006-2-1、A045-4-2）;VPA（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：P4543）。

生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)：ZT-14V1）;石蠟包埋機(jī)（亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)：YB-7LF）;電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：Mini-PROTEAN）;凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：ChemiDoc XRS+）。

1.3? 模型制備與分組

孤獨(dú)癥模型大鼠制備參考SCHNEIDER等[7]采用的方法。育齡期雌、雄Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于18：00將雌、雄大鼠按1∶1合籠過(guò)夜，次日8：00檢查鼠籠底部托盤(pán)，若發(fā)現(xiàn)脫落的淡黃色、半透明、凝膠狀陰栓，則記錄為該雌鼠妊娠0.5 d，并單獨(dú)分籠飼養(yǎng)。隨機(jī)選取9只孕鼠，在發(fā)現(xiàn)陰栓后12 d，即妊娠12.5 d，腹腔注射VPA，劑量為600 mg/kg，產(chǎn)下的仔鼠經(jīng)發(fā)育行為學(xué)檢測(cè)（體質(zhì)量、睜眼時(shí)間、方向趨向性功能測(cè)試、足底熱痛試驗(yàn)、游泳試驗(yàn)）確認(rèn)造模成功，模型組大鼠體質(zhì)量明顯偏低，睜眼時(shí)間顯著落后于空白組，在方向趨向性功能檢測(cè)、游泳試驗(yàn)、足底熱痛實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠使用了較長(zhǎng)的時(shí)間完成180°轉(zhuǎn)向、游泳評(píng)分較低、對(duì)熱痛刺激應(yīng)答時(shí)間較長(zhǎng)，顯示出明顯的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和前庭發(fā)育狀態(tài)低下、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性不足、對(duì)傷害性刺激的敏感程度減退等特點(diǎn)，均反映了孤獨(dú)癥大鼠的發(fā)育行為學(xué)缺陷[8]。另外4只孕鼠注射等量的生理鹽水，產(chǎn)下的仔鼠為空白組大鼠。每組隨機(jī)選取9只大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.4? 干預(yù)方法

捏脊組采取捏脊干預(yù)：一名實(shí)驗(yàn)員用食指和中指輕柔固定在大鼠頸部?jī)蓚?cè)，另一名實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行捏脊操作;在開(kāi)始捏脊前至上而下輕撫大鼠背部1～3次，實(shí)驗(yàn)員雙手配合交替從大鼠脊中線尾根部逐漸向上捏至大椎穴（大椎穴參照唐勇主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》確定[9]），拇、食二指相對(duì)捏起大鼠脊柱背部皮膚，邊捏邊往上推;捏起大鼠皮膚高度達(dá)0.2～0.3 cm，從大鼠脊柱中線尾根部捏至大椎穴為一遍捏脊操作;從第7次起，每捏3次將捏起處皮膚輕提起1次，直至完成所有捏脊次數(shù)操作。21次/d，連續(xù)捏脊28 d。在捏脊組大鼠捏脊期間，空白組和模型組僅模擬抓取動(dòng)作。

1.5? 取材

2%戊巴比妥鈉按0.25 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后快速打開(kāi)胸腔，暴露心臟，以眼科剪在左心室處開(kāi)一個(gè)小口，迅速將灌流針頭從左心室插入主動(dòng)脈，固定針頭，隨即剪開(kāi)右心耳，灌注生理鹽水約200 mL，直至觀察到大鼠肝臟由深褐色變?yōu)闇\褐色、足部變白，再向左心室注入4%多聚甲醛約100 mL，待大鼠頭部及肢體僵硬后斷頭，從嗅球處向下取出全腦。每組隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行灌注，取全腦置于4%多聚甲醛溶液固定，以待尼氏染色檢測(cè)，海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)參照PAXINOS等[10]主編的The Rat Brain進(jìn)行定位;另外6只大鼠不進(jìn)行灌注，麻醉后斷頭，取出全腦后鈍性分離海馬，迅速將組織轉(zhuǎn)存至-80 ℃冰箱。

1.6? 行為學(xué)檢測(cè)

1.6.1? 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)? 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱是規(guī)格為75 cm×75 cm×40 cm的正方體，四周及底部均為亞克力板。選擇大鼠的非活動(dòng)期（8：00—16：00）進(jìn)行檢測(cè)。將大鼠提前1 h放置于無(wú)背景噪聲室內(nèi)適應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前用75%乙醇清潔曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱。實(shí)驗(yàn)人員依次將大鼠放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，每次1只，并任其自由活動(dòng)，每只大鼠活動(dòng)時(shí)間為5 min，記錄大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)站立、理毛等行為。

1.6.2? 三箱社交實(shí)驗(yàn)? 三箱測(cè)試工具為亞克力板做成的長(zhǎng)方體箱子，用兩個(gè)隔板在中間隔開(kāi)，形成左側(cè)、右側(cè)、中間3個(gè)隔箱，每等份規(guī)格為30 cm×40 cm×30 cm的長(zhǎng)方體，兩個(gè)隔板開(kāi)放有可供大鼠出入的小門(mén)，左右兩側(cè)小箱子中各有一個(gè)高18 cm、直徑8 cm的鐵籠，將陌生大鼠放入其中。陌生大鼠選擇同齡、同性別、體質(zhì)量差異不大且從未接觸過(guò)的同類(lèi)。先于無(wú)背景噪聲房間內(nèi)適應(yīng)1 h，再將被試大鼠放進(jìn)三箱內(nèi)適應(yīng)5 min，期間大鼠可以在三箱中自由出入;待5 min結(jié)束后先將大鼠取出，然后將陌生大鼠1號(hào)放進(jìn)左側(cè)鐵籠（1號(hào)籠），右側(cè)鐵籠不放置大鼠，再將被試大鼠放進(jìn)中間隔箱內(nèi)，任其自由活動(dòng)，監(jiān)測(cè)10 min。大鼠探索1號(hào)籠的社交時(shí)間與探索空籠的時(shí)間比值即為社交指數(shù)[11]。

1.7? 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1? Western blot檢測(cè)? 以Western blot檢測(cè)大鼠左腦海馬Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。6只大鼠左腦海馬加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，制備勻漿，提取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加入足量的上樣緩沖液使各蛋白濃度保持一致，根據(jù)待測(cè)蛋白的預(yù)測(cè)分子量制備凝膠，80 V電泳2 h，400 mA轉(zhuǎn)膜0.5 h，封閉0.5 h，而后孵育一抗β-actin（1∶50 000）、Nrf2（1∶8 000）、p-Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶2 000）、NQO1（1∶25 000），一抗4 ℃冷庫(kù)孵育14 h后，TBST洗脫5次，1次5 min，二抗比例均為1∶10 000，室溫孵育2 h，TBST洗脫5次，1次5 min，顯影曝光，使用Image J分析條帶灰度值。

1.7.2? 生化試劑盒法檢測(cè)? 準(zhǔn)確稱取大鼠右腦海馬組織質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下，制備成10%的組織勻漿，以2 500 r/min半徑8 cm離心10 min，隨后取上清，再用生理鹽水稀釋成不同取樣濃度，根據(jù)GSH、MDA、SOD、CAT試劑盒說(shuō)明書(shū)逐一進(jìn)行操作。

1.7.3? 尼氏染色檢測(cè)? 組織脫水，浸蠟，包埋，切片（厚度4 μm），攤片，烤片。將切片依次經(jīng)二甲苯Ⅰ（8 min）、二甲苯Ⅱ（8 min）、二甲苯Ⅲ（8 min）、100%乙醇Ⅰ（4 min）、100%乙醇Ⅱ（4 min）、95%乙醇（2 min）、80%乙醇（2 min）、70%乙醇（2 min）脫蠟水化，蒸餾水水洗2次，1次1 min，隨后將切片浸沒(méi)于裝有尼氏染色液的染色缸中，避光，60 ℃條件下染色25 min。染色結(jié)束，取出切片，流水洗1 min。用95%乙醇快速分化60 s。將切片依次經(jīng)95%乙醇Ⅰ（30 s）、95%乙醇Ⅱ（30 s）、100%乙醇Ⅰ（30 s）、100%乙醇Ⅱ（30 s）、二甲苯Ⅰ（10 s）、二甲苯Ⅱ（10 s）、二甲苯Ⅲ（10 s）脫水透明，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以“x±s”表示：若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析方法，方差齊者用LSD法，方差不齊則用Dunnett T3法;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)的分析方法。以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)比較

與空白組比較，模型組大鼠站立次數(shù)明顯減少（P<0.01）、理毛次數(shù)明顯增多（P<0.01）;與模型組比較，捏脊組大鼠站立次數(shù)明顯增加（P<0.01）、理毛次數(shù)降低（P<0.05）。詳見(jiàn)圖1—2。

2.2? 各組大鼠社交指數(shù)比較

與空白組比較，模型組大鼠社交指數(shù)明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，捏脊組大鼠社交指數(shù)明顯升高（P<0.01）。詳見(jiàn)圖3。

2.3? 各組大鼠海馬CA1、CA2區(qū)尼氏染色結(jié)果

空白組海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，形態(tài)規(guī)則，核仁明顯，尼氏體數(shù)量豐富，著色均勻，無(wú)明顯的神經(jīng)元丟失。模型組有大量神經(jīng)元受損，出現(xiàn)細(xì)胞萎縮，呈空泡狀改變;細(xì)胞膜破裂、邊界模糊，細(xì)胞核深染、變小、固縮、呈不規(guī)則或破裂形態(tài)，尼氏體偏移、溶解，尼氏體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少。捏脊組神經(jīng)元細(xì)胞排列基本整齊，核固縮形態(tài)有所改善，細(xì)胞形態(tài)可，少量神經(jīng)元形態(tài)皺縮不完整，尼氏體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加。詳見(jiàn)圖4—5。

2.4? 各組大鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激指標(biāo)GSH、MDA、SOD、CAT表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組GSH、SOD、CAT表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），MDA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，捏脊組GSH、SOD表達(dá)水平升高（P<0.05），CAT表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），MDA表達(dá)水平顯著下降（P<0.01）。詳見(jiàn)圖6—9。

2.5? 各組大鼠海馬區(qū)p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)比較

與空白組比較，模型組p-Nrf2/Nrf2、HO-1表達(dá)均明顯降低（P<0.01），NQO1表達(dá)降低（P<0.05）;與模型組比較，捏脊組p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)升高（P<0.05）。詳見(jiàn)表2、圖10。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為孤獨(dú)癥屬于“目無(wú)情”“視無(wú)情”“五遲”范疇，病機(jī)為神機(jī)紊亂（或不足）、臟腑功能失調(diào)，病位在腦，與心、肝、腎相關(guān)[12]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，孤獨(dú)癥成因復(fù)雜，普遍認(rèn)為孤獨(dú)癥是遺傳、環(huán)境、免疫、神經(jīng)等多因素作用的結(jié)果，氧化應(yīng)激作為結(jié)合這些危險(xiǎn)因素的內(nèi)在機(jī)制，是孤獨(dú)癥神經(jīng)發(fā)育障礙的重要促成因素。氧化應(yīng)激損害發(fā)育中的海馬、前額皮質(zhì)等重要腦區(qū)神經(jīng)元并造成損傷，這種損傷通過(guò)炎癥等破壞進(jìn)一步加劇過(guò)氧化狀態(tài)的惡化，形成負(fù)性循環(huán)，最終導(dǎo)致孤獨(dú)癥樣異常的社會(huì)、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)行為[13]。因此，團(tuán)隊(duì)基于前期研究發(fā)現(xiàn)，捏脊改善了精神發(fā)育遲滯患兒的社交行為，緩解孤獨(dú)癥模型大鼠的孤獨(dú)癥樣行為障礙[6]，進(jìn)一步認(rèn)為捏脊改善孤獨(dú)癥模型大鼠的行為障礙可能與其調(diào)節(jié)孤獨(dú)癥模型大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)密切相關(guān)。

對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物孕期腹腔注射VPA以從子代獲取孤獨(dú)癥模型動(dòng)物，是孤獨(dú)癥可靠和成熟的造模方法，具有良好的構(gòu)建效度[14]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠站立次數(shù)下降，理毛次數(shù)增加，說(shuō)明孤獨(dú)癥模型大鼠對(duì)陌生環(huán)境缺乏探索興趣以及重復(fù)刻板行為的增多[15]。經(jīng)過(guò)捏脊干預(yù)，孤獨(dú)癥大鼠的新環(huán)境探索興趣提高，重復(fù)刻板樣行為發(fā)生次數(shù)減少。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)捏脊干預(yù)，孤獨(dú)癥模型大鼠社交指數(shù)提高，表明捏脊有助于孤獨(dú)癥模型大鼠社交缺陷的恢復(fù)。社交行為包括了社交認(rèn)知和社交記憶，海馬作為記憶和認(rèn)知的重要腦區(qū)[16]，也參與了社交行為。海馬CA1區(qū)和CA2區(qū)二者共同承擔(dān)了社交信息的傳遞和整合任務(wù)[17-18]，尤其CA2區(qū)被認(rèn)為是海馬社交功能的核心腦區(qū)，在三箱社交實(shí)驗(yàn)中，正常轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)環(huán)境中新加入的陌生鼠表現(xiàn)出顯著的探索偏好，而CA2區(qū)失活的轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)陌生鼠和熟悉鼠之間的探索興趣沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異，提示海馬CA2區(qū)對(duì)社交認(rèn)知活動(dòng)產(chǎn)生影響[19]。本實(shí)驗(yàn)中捏脊改善孤獨(dú)癥大鼠海馬社交相關(guān)的重要腦區(qū)CA1、CA2區(qū)的神經(jīng)元損傷，對(duì)海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能具有一定保護(hù)作用。

雖然普通成年人大腦只占體質(zhì)量的2%，但是消耗了機(jī)體20%的氧氣[20]。高耗氧過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量ROS，由于神經(jīng)元缺乏產(chǎn)生抗氧化劑GSH的能力，大腦解毒ROS的能力有限，神經(jīng)元是第一個(gè)受到ROS增加和抗氧化劑短缺影響的細(xì)胞[21-22]，最易受氧化應(yīng)激影響。腦組織內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)有GSH、SOD、CAT等，GSH是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，它通過(guò)提供一個(gè)電子以中和自由基，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要因素。GSH缺乏是孤獨(dú)癥的重要病理改變，低GSH水平可能是許多與孤獨(dú)癥相關(guān)的系統(tǒng)性異常的基礎(chǔ)，例如氧化應(yīng)激和免疫功能失調(diào)等[23]。SOD是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用的酶性保護(hù)系統(tǒng)的主要成分，SOD是機(jī)體對(duì)抗自由基的第一道屏障，能清除超氧陰離子自由基，將其轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）和氧氣（oxygen， O2），低SOD水平可導(dǎo)致超氧化物介導(dǎo)的DNA損傷，從而影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)和遷移[24]。CAT是過(guò)氧化物酶體H2O2的主要清除者，其可以有效地催化H2O2降解為無(wú)害的水和O2[25]。在自由基攻擊膜脂蛋白和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid， PUFA）的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生許多含氧化合物，MDA作為硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid， TBA）反應(yīng)產(chǎn)物的原型，是反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平的良好標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)中，孤獨(dú)癥大鼠海馬區(qū)存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)，表現(xiàn)在GSH、SOD、CAT等抗氧化劑含量不足，而MDA含量明顯升高。捏脊干預(yù)使得孤獨(dú)癥大鼠的MDA水平較模型組顯著下降，GSH、SOD、CAT水平較模型組顯著升高，提示捏脊具有改善海馬區(qū)氧化/還原失衡狀態(tài)的效應(yīng)。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)參與抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)成分，在外源性應(yīng)激條件下，Nrf2被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，Nrf2與Maf家族蛋白形成異源二聚體并與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游抗氧化因子HO-1、NQO1、SOD、GSH、CAT等物質(zhì)的表達(dá)[26]。一方面，Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子;另一方面，Nrf2基因也與自閉癥異常行為表現(xiàn)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，與服用VPA的野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除小鼠對(duì)早期發(fā)育期間施用VPA引起的神經(jīng)損傷更敏感，表現(xiàn)出更明顯的探索性行為減少及學(xué)習(xí)記憶障礙[27]。ZHAO等[28]研究表明，孤獨(dú)癥大鼠前額皮質(zhì)區(qū)Nrf2在核內(nèi)低表達(dá)。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HO-1可以裂解產(chǎn)生膽綠素甚至是抗氧化作用更強(qiáng)的膽紅素以減輕氧化應(yīng)激損傷[29]。NQO1能通過(guò)雙電子還原反應(yīng)使醌類(lèi)化合物變成低毒性的氫醌類(lèi)物質(zhì)，抑制醌類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化為半醌類(lèi)自由基和ROS[30]。本實(shí)驗(yàn)中，捏脊組大鼠的p-Nrf2/Nrf2比值、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)較模型組升高，提示捏脊活化孤獨(dú)癥模型大鼠海馬區(qū)Nrf2/HO-1通路，提高下游抗氧化酶HO-1、NQO1的表達(dá)。

綜上所述，捏脊干預(yù)使得孤獨(dú)癥大鼠的社交障礙發(fā)生改善，刻板理毛行為減少，對(duì)陌生環(huán)境探索興趣提升，其機(jī)制可能與捏脊活化Nrf2/HO-1通路、引起抗氧化因子表達(dá)、提高抗氧化酶含量、加速清除氧自由基、緩解神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

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〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81704194）;福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022J01366）;福建省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專項(xiàng)項(xiàng)目（2023R1003006）。

〔通信作者〕*林麗莉，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：438488409@qq.com。