硝基呋喃抗菌骨水泥的動物體內生物相容性研究

郭 銳 闞宇辰 高 喆 韓廬陽 卜文翰 許 楊 儲建軍

抗生素骨水泥（antibiotic-loaded bone cement，ALBC）的爆發性釋放會導致抗菌時間縮短［1］。釋放一周后局部抗生素濃度低于最低抑菌濃度，易導致細菌耐藥性的產生。而非浸出抗菌骨水泥（non-leaching bone cement， NLBC）中的抗菌基團不會洗脫，抗菌基團可破壞粘附在骨水泥表面細菌的細胞膜，達到抑制或殺滅細菌的效果，這種非浸出的接觸抗菌機制可以大幅延長抗菌時間［2-3］。目前研究較多的是含雜環化合物的NLBC 以及含季銨鹽類化合物的NLBC 等［4-5］。近期報道的含硝基呋喃非浸出抗菌骨水泥p（NFMA-co-MMA）具有良好的表面抑菌性能和體外細胞相容性［6-8］。本研究使用動物模型研究硝基呋喃非浸出骨水泥的體內生物相容性，進一步深入了解這種非浸出骨水泥的生物相容性能，旨在為硝基呋喃抗菌骨水泥臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 原材料 商業骨水泥包含由PMMA（14.84 g）、過氧化苯甲酰（0.16 g）、硫酸鋇（10 g）組成的固相（25 g）和由MMA（9.93 mL）、N，N-二甲基對甲苯胺（0.07 mL）、對苯二酚（10-20 ppm）組成的液相（10 mL），購自法國賽尼邁德公司。p（10% NFMA-co-MMA）通過文獻報道的方法制備［7］。C57 小鼠、新西蘭兔購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.2 PMMA 骨水泥和p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥的制備 固相和液相按2∶1 的比例配置。用模具制作不同尺寸樣件，分別為長（12.0±0.1） mm，直徑（6.0±0.1） mm 以及長（6.0±0.1） mm，直徑（6.0±0.1） mm 的圓柱體。

1.3 浸提液的制備 樣件（長12.0 mm，直徑6.0 mm）在37℃的生理鹽水（0.9% 氯化鈉溶液，添加量為0.2 g/mL）中靜置72 h。得到的浸提液繼續用0.9%氯化鈉稀釋至指定濃度，分別為40%、80% 和100%。不同濃度的浸提液經121 ℃下高壓滅菌20 min 后儲存于4 ℃冰箱中待用［9］。

1.4 急性全身毒性實驗 將21 只C57 小鼠（體質量16～21 g）采用完全隨機分組方法分為7 組，每組3 只。Ⅰ：空白對照組（0.9%氯化鈉溶液）；Ⅱ：40% PMMA 浸提液組；Ⅲ：80% PMMA 浸提液組；Ⅳ：100% PMMA 浸提液組；Ⅴ：40% p（10% NFMA-co-MMA）浸提液組；Ⅵ：80% p（10% NFMA-co-MMA）浸提液組；Ⅶ：100% p（10% NFMA-co-MMA）浸提液組。每組采用相同的方法進行腹腔注射（注射部位為小鼠下腹部距腹白線0.5 cm 處，針頭與皮膚表面呈30°刺入小鼠腹腔并注射浸提液）。各組注射量均為50 mL/kg。所有實驗小鼠均于安徽醫科大學實驗動物房，在18～22 ℃通風干燥環境下，給予鼠糧就和充足水源分籠飼養。于注射后24 h、48 h 和72 h 觀察小鼠一般狀態（如呼吸、運動和食欲等情況）、體質量變化和毒性反應（如腹瀉、嘔吐、驚厥等情況）。72 h 后統一處死小鼠，取肝臟和腎臟進行組織學觀察（蘇木精-伊紅染色）。按照GB/T 16886［10］評價急性全身毒性。

1.5 肌肉植入實驗 選取6 只新西蘭兔（體質量2～3 kg），在全身麻醉下（速眠新與舒泰混合體積比為2∶1，按0.1 mL/kg 劑量進行耳緣靜脈注射麻醉）通過直接手術將預處理的PMMA 和p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥樣件植入兔的棘旁肌肉組織中。本研究中使用的骨水泥樣件為圓柱體（長6.0 mm，直徑6.0 mm）。在兔脊柱兩側約2 cm 的對稱位置處選擇兩個植入部位，一側植入PMMA 樣件，另一側植入p（10% NFMA-co-MMA）樣件，上下間距約2.5 cm。切開皮膚筋膜，沿長軸鈍性分離肌肉組織，形成肌腔，分別植入實驗材料，每側植入2 個樣件，然后逐層縫合組織，切口予鋁噴覆蓋保護，連續3 日肌肉注射頭孢呋辛，預防感染。所有實驗兔均于安徽醫科大學實驗動物房，在通風干燥環境下，給予兔糧、蔬菜及充足水源分籠喂養。術后所有實驗兔子均正常蘇醒，進食與活動情況正常，術后切口均未發生感染。分別在第2 周和第4 周各處死3 只新西蘭兔，取樣件周圍0.5～1 cm 的肌肉組織。將肌肉組織切片，用蘇木精-伊紅染色，并在光學顯微鏡下觀察骨水泥植入后局部組織炎癥反應情況。按照GB/T 16886［10］評價肌肉組織對植入材料的生物學反應。

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0 進行數據統計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；兩組不同時間點均數的比較采用重復測量方差分析；計數資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性全身毒性實驗

圖1 兔背部肌肉植入術

2.1.1 一般情況及體質量變化 在注射不同濃度的p（10% NFMA-co-MMA）浸提液和PMMA 浸提液24 h、48 h、72 h 后觀察小鼠，各時間點均未出現呼吸困難、異常運動、震顫痙攣、腹瀉嘔吐、皮膚水腫或反應降低等癥狀。實驗小鼠均未死亡。采用重復測量方差分析對不同時間點小鼠體質量變化量進行比較，結果顯示所有實驗組小鼠3 天體質量增加量相比于注射后第1 天均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。注射不同濃度p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥浸提液的小鼠各時間點體質量增加量與Ⅰ組相比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。其中Ⅱ組小鼠3 天體質量穩定增長，且增量最明顯，第3 天體質量增加量為（3.56±2.52） g，增量與Ⅰ組相比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 腹腔注射浸提液前后小鼠體質量變化(±s,g)

表1 腹腔注射浸提液前后小鼠體質量變化(±s,g)

注：F組間是Ⅱ～Ⅶ組與Ⅰ組（空白對照組）間同一時間點小鼠體質量變化的總體比較，與空白對照組同一時間點比較，P＞0.05；F時間是各組內不同時間點小鼠體質量變化量與第1天小鼠體質量變化量的總體比較，與第1天小鼠體質量變化量比較，①P＜0.05。

組別ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦF組間/時間/交互值P組間/時間/交互值只數3333333不同時間點體質量變化量第1天1.37±0.59 2.01±0.69 0.94±0.84 0.91±0.34 1.03±0.28 0.82±0.40 1.33±0.42 1.430/9.351/1.450 0.379/＜0.001/0.203第2天1.50±0.62①2.62±1.64①1.81±1.00①1.63±0.15①1.03±0.54 1.30±0.32①1.42±0.47①第3天1.48±1.09①3.56±2.52①1.38±0.64①1.46±0.28①1.30±0.41①1.58±0.50①1.54±0.69①

2.1.2 小鼠肝臟組織學觀察 為了探究p（10%NFMA-co-MMA）對小鼠的主要器官是否有毒性反應，研究了不同濃度的p（10% NFMA-co-MMA）浸提液和PMMA 浸提液對肝臟的急性毒性作用。通過病理染色觀察發現，當注射p（10% NFMA-co-MMA）浸提液時，可見肝臟、匯管區細胞形態結構正常，間質無充血，無明顯的炎癥細胞浸潤。注射不同濃度p（10% NFMAco-MMA）浸提液的小鼠肝細胞均未發現明顯腫脹和疏松化，細胞未見明顯變性、壞死；腹腔注射PMMA 浸提液的小鼠肝臟也未見明顯毒性反應。見圖2。

圖2 小鼠肝臟組織學染色圖像（蘇木精-伊紅染色）

2.1.3 小鼠腎臟組織學觀察 在對小鼠腎臟的組織學觀察中發現，注射不同濃度p（10% NFMA-co-MMA）浸提液和PMMA 浸提液的小鼠的腎皮質、腎髓質細胞形態結構均正常。所有實驗小鼠雙側腎臟的腎小球、腎小管形態均未發現明顯異常，腎小管上皮細胞未見水腫和壞死脫落，間質無炎癥細胞浸潤。注射p（10%NFMA-co-MMA）和PMMA 浸提液的小鼠腎臟組織學觀察結果無顯著差異。見圖3。

圖3 小鼠腎臟組織學染色圖像（蘇木精-伊紅染色）

2.2 肌肉植入實驗

2.2.1 p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥肌肉植入實驗 在肌肉植入p（10% NFMA-co-MMA）樣件2 周后，周圍組織有較多的炎性細胞浸潤，局部組織可見毛細血管增生并且有成纖維細胞支持。4 周后，炎癥反應減弱，炎癥細胞減少，纖維結締組織逐漸增多。見圖4。

圖4 兔背部肌肉的組織學染色圖像（蘇木精-伊紅染色）

2.2.2 PMMA 骨水泥肌肉植入實驗 使用商業PMMA 骨水泥進行對比研究發現，PMMA 骨水泥植入2周后，植入物周圍同樣出現較多的炎性細胞浸潤以及新生毛細血管；植入4 周后局部炎癥細胞減少，炎癥減輕，纖維結締組織也逐漸增多。該結果與肌肉植入p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥時類似。見圖5。

圖5 兔背部肌肉的組織學染色圖像（蘇木精-伊紅染色）

3 討論

負載萬古霉素、慶大霉素和克林霉素的ALBC 已經在臨床治療中廣泛使用［11-13］。然而，研究表明ALBC中抗生素的爆發性釋放易造成抗菌時間短，進而引起細菌耐藥［14-17］。非浸出抗菌骨水泥中的抗菌基團是通過共價鍵穩定的結合在骨水泥中，不會洗脫，因此可產生較長時間的接觸抗菌作用［18-21］。雖然非浸出抗菌骨水泥具有良好的抗菌特性，但是對于該類骨水泥的體內生物相容性研究甚少。Deb 等［5］在對季銨化單體共聚骨水泥的研究中發現，將含有15%季銨化單體的共聚骨水泥與人骨肉瘤細胞在體外培養一周后，通過電鏡觀察發現，實驗材料與細胞間具有良好的粘附性，證明季銨化單體共聚骨水泥具有良好的體外細胞生物相容性。Sun 等［22］將丙烯酸冰片酯單體共聚物骨水泥植入小鼠背部，分別于第7 天和第28 天對植入物周圍組織進行病理學觀察，發現周圍組織與材料接觸緊密，均未出現明顯的免疫炎癥反應，明確證實該類聚合物具有良好的生物相容性。在本研究中，筆者對p（10%NFMA-co-MMA）骨水泥進行了動物體內生物相容性探究。

在急性全身毒性實驗中，觀察項目包括體質量變化、臨床觀察和病理學觀察等。其中臨床觀察包括呼吸、肌肉運動、痙攣、反射等［10］。本研究通過觀察給藥前后小鼠一般狀態、體質量變化和肝腎毒性三個基本項目，研究硝基呋喃非浸出抗菌骨水泥的體內生物相容性。在腹腔注射浸提液前及注射后24 h、48 h 和72 h 觀察小鼠，各時間點均未出現呼吸困難、異常運動、震顫痙攣、腹瀉嘔吐、皮膚水腫或反應降低等癥狀。實驗小鼠均未死亡。所有注射了p（10% NFMA-co-MMA）浸提液的小鼠的體質量都表現出自然增加，包括注射了原始浸提液（100%濃度）的小鼠，各時間點體質量增加量與Ⅰ組相比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。其中Ⅱ組小鼠3 天體質量穩定增長，且增加量最明顯，第3 天體質量增加量為（3.56±2.52）g，增量與Ⅰ組相比較差異無統計學意義（P＞0.05）。所有注射了市售PMMA浸提液的小鼠體質量均增加，各時間點體質量增量與Ⅰ組比較差異無統計學意義（P＞0.05），該結果證明硝基呋喃抗菌骨水泥與傳統的市售骨水泥均未對小鼠短期體重變化產生明顯影響。根據先前研究［9］，取實驗小鼠肝臟和腎臟進行組織學觀察，評價急性全身毒性。本研究在對小鼠肝臟組織學觀察中發現，當注射p（10% NFMA-co-MMA）浸提液時，可見肝臟、匯管區細胞形態結構正常，間質無明顯充血，也未見明顯的炎癥細胞浸潤。所有注射p（10% NFMA-co-MMA）浸提液的小鼠肝細胞均未發現明顯腫脹和疏松化，細胞無明顯變性、壞死，表明沒有發生明顯毒性反應。在對小鼠腎臟的病理學觀察中發現，注射不同濃度p（10%NFMA-co-MMA）浸提液的小鼠與注射不同濃度PMMA 浸提液的小鼠的腎皮質、腎髓質細胞形態結構均正常。所有實驗小鼠雙側腎臟的腎小球、腎小管形態均未發現明顯異常，腎小管上皮細胞未見水腫和壞死脫落，間質無炎癥細胞浸潤。根據本研究組織學觀察結果推測，p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥中的抗菌基團不會干擾液相劑中MMA 單體的聚合，大多數單體均參與聚合，因此可被洗脫的MMA 單體量較少，對小鼠的肝腎組織的急性毒性作用不顯著。在兔背部肌肉植入實驗中，通過光鏡下觀察植入物周圍組織炎癥細胞與纖維結締組織包裹情況，評價組織反應程度［9，22］。結果發現植入2 周后的組織學切片顯示骨水泥周圍組織中有大量炎癥細胞浸潤并伴毛細血管生成，而在骨水泥植入后的第4 周，在p（10% NFMA-co-MMA）樣件周圍的炎癥細胞減少，炎癥反應減輕，結蹄組織增多，逐漸形成纖維包裹。上述病理學反應均為組織愈合過程中的積極表現。在市售的PMMA 骨水泥植入物周圍也觀察到了類似的現象，表明p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥與臨床使用的PMMA 骨水泥具有同樣良好的生物相容性。

綜上所述，本研究初步表明，p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥在動物體內具有良好的生物相容性。基于此項研究取得的進展，在未來將進一步研究該非浸出抗菌骨水泥在體內的抗菌活性。