熵權-正交法優化赤蒼藤中多糖、多酚和黃酮的提取工藝

摘 要：優化赤蒼藤中多糖、多酚和黃酮的提取工藝，為綜合評價其質量提供參考。以赤蒼藤莖為研究對象，采用酶解法，選取適宜的酶質量分數、酶解pH、酶解溫度及酶解時間為考察因素，以多糖、多酚、黃酮和浸膏提取率為評價指標?；陟貦喾陀^賦權結合L9（34）正交試驗，優選赤蒼藤的多指標提取工藝。最佳提取工藝條件為：酶質量分數4%，酶解pH值6.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間45 min。考察多指標后，確認優選的提取工藝穩定可行，可為赤蒼藤的質量評價提供實驗依據。

關鍵詞：赤蒼藤；熵權法；酶解法；多指標評價；提取工藝

中圖分類號：R284.2 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2024.01.017

0 引言

赤蒼藤（Erythropalum scandens Bl.）為鐵青樹科赤蒼藤屬多年生常綠大型木質藤本植物[1]，又名腥藤、螞蟥藤、龍須藤等。在我國，赤蒼藤主要分布于廣東、廣西、海南、云南、貴州（南部）等南方地區，常以其莖、葉入藥，性平，味微苦，具有清熱解毒、祛風活血之功效[2]。赤蒼藤具有較高的藥用和食用價值[3]，其“嫩葉可作蔬菜；莖入藥，利尿，治黃膽，也治風濕骨痛；根煮肉或浸酒服，同時搗爛葉敷患處可治水腫?！盵4]，因此，赤蒼藤是一種具有開發潛力的藥食同源植物，但是對其活性成分以及藥效物質基礎的研究尚處于初級階段。

潘喬丹等[5]檢測出赤蒼藤莖水提取物中有氨基酸、多肽蛋白質類、有機酸、多糖和苷類、酚類化合物，而醇提取物中有黃酮類、酚類、生物堿、三萜類、香豆素類化合物。據文獻梳理，Sutha等[6]采用角叉菜膠誘導大鼠足腫脹，發現赤蒼藤醇提取物具有較強的抗炎作用。黃元河等[7-8]先后考察了赤蒼藤莖醇提物對高尿酸血癥大鼠和小鼠的影響，發現赤蒼藤莖醇提物不僅能抑制黃嘌呤氧化酶的活性，降低高尿酸血癥大鼠的血清尿酸含量，而且對血管內皮舒縮功能具有保護作用，無明顯毒性作用，同時對高尿酸血癥小鼠也有良好的治療作用和腎臟保護作用。梁臣艷等[9]分別考察了赤蒼藤醇提物和水提物對健康小鼠的利尿作用，發現二者在低、中、高劑量時均有較好的利尿活性，并且醇提物的藥效更顯著。許崇搖等[10]發現赤蒼藤水提物能降低高尿酸血癥小鼠的血尿酸和血肌酐水平，并能緩解痛風性關節炎小鼠的足趾腫脹程度，并伴隨相關炎癥指數的降低。Somdee等[11]對泰國東北部 30 種蔬菜進行了抗氧化活性研究，發現赤蒼藤具有顯著的抗氧化作用，其酚類成分是其抗氧化性能的主要因素。潘喬丹等[12]對赤蒼藤多糖進行了體外抗氧化試驗，發現赤蒼藤多糖清除DPPH·、·OH 和 ABTS+·的能力均強于VE（維生素E）。因此，根據現代研究初步推測，赤蒼藤的醇提物和水提物為其主要活性部位，赤蒼藤所含的多糖、多酚以及黃酮類成分可能是其在體內發揮抗炎、抗風濕、利尿、抗痛風、降尿酸、抗氧化等藥理作用的主要活性成分。

近年來，應用纖維素酶、果膠酶及復合酶等方法提取植物活性成分取得了重要進展[13]。二者聯用可以破壞植物細胞壁結構，促進中草藥有效成分溶出，在一定程度上優化了活性成分的提取率。目前，未見關于酶解法提取赤蒼藤活性成分的文獻報道。因此，本文采用酶解法提取赤蒼藤的有效成分，并對酶質量分數、酶解pH、酶解溫度和酶解時間加以考察；以赤蒼藤多糖、多酚、黃酮的提取率和赤蒼藤浸膏得率為評價指標，通過熵權法計算各項指標權重，并以多指標綜合評分為考察指標，結合正交試驗優選提取工藝，為進一步評價赤蒼藤的質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

葡萄糖（110833-202109）、蘆?。?00080-202012）、沒食子酸（110831-201906）均購于中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶（H28S10S98904，酶活力≥400 U/mg）購于金城化學（江蘇）有限公司；乙醇、苯酚、濃硫酸、福林酚、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、碳酸鈉均為分析純；赤蒼藤藥材采自廣西玉林地區，經廣西科技大學天然藥物教研室卓燊中藥師鑒定為赤蒼藤（E. scandens Bl.）的干燥莖，藥材經干燥切片后存于廣西科技大學實驗室。

1.1.2 實驗儀器

GL124旋轉蒸發儀 N-1300D（東京理化器械株式會社（中國））；低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；超聲清洗機（昆山潔力美超聲儀器有限公司）；GL124-ISCN 電子天平（季爾國際貿易上海有限公司）；手動單道可調移液槍（大龍興創實驗儀器（北京）股份有限公司）；UV-1900 島津紫外可見分光光度計（島津企業管理（中國）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 赤蒼藤樣品的制備

稱取干燥至恒重的赤蒼藤藥材粗粉10.0 g，量取300 mL 60%乙醇溶液并置于500 mL燒杯中，加入適量的纖維素酶，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節酶解pH，溫熱酶解一定時間后用沸水煮5 min使酶滅活，最后超聲30 min，過濾后濃縮、凍干，得到赤蒼藤浸膏。精密稱取赤蒼藤浸膏0.15 g，用純化水超聲溶解后定容至50 mL，備用。

ρ=（m1/m2）×100%.

式中：ρ為浸膏率；m1為赤蒼藤浸膏質量；m2為赤蒼藤粗粉質量。

1.2.2 赤蒼藤各指標的標準曲線與含量測定

1）葡萄糖標準曲線的繪制及多糖含量測定

配制質量濃度為0.5 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別從中精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL溶液置于25 mL容量瓶中，然后依次加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL濃硫酸混勻，用純化水定容后，70 ℃水浴加熱20 min，冷卻至室溫。在490 nm處測定其吸光度，分別以葡萄糖質量濃度（mg/mL）和相應的吸光度為橫坐標、縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

精密吸取4.0 mL赤蒼藤樣品溶液，依次加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL濃硫酸混勻，純化水定容至25.0 mL，于70 ℃水浴加熱20 min后冷卻至室溫。按照上述苯酚-硫酸比色法在490 nm處測得吸光度，計算浸膏中多糖的提取率，其計算公為

[Y=c×d×VM×1 000 ×100%]， （1）

式中：Y表示提取率（%）；c表示提取液中所測指標的質量濃度（mg/mL）；d為稀釋倍數；V為提取液的體積（mL）；M為赤蒼藤原料粉末質量（g）。

2）沒食子酸標準曲線的繪制及多酚的含量測定

先配制質量濃度為0.2 mg/mL的沒食子酸標準液，再從中精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL溶液，分別置于100 mL容量瓶中，依次加入5.0 mL福林酚試劑和15.0 mL 10%碳酸鈉溶液，純化水定容，室溫避光放置2 h，即得目標溶液。在750 nm處測定溶液吸光度，分別以沒食子酸質量濃度和相應的吸光度為橫坐標、縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線。

精密吸取2.0 mL赤蒼藤樣品溶液，依次加入5.0 mL福林酚試劑和15.0 mL 10%碳酸鈉溶液，純化水定容至25.0 mL，室溫避光放置2 h。按照上述Folin-Ciocalteu比色法在750 nm處測得吸光度，計算浸膏中多酚的提取率，計算公式參照式（1）。

3）蘆丁的標準曲線繪制及黃酮的含量測定

先配制質量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液，分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL溶液置于50 mL容量瓶中，并加入蒸餾水稀釋至12.0 mL。然后依次加入1.0 mL 5% NaNO2、1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液、10.0 mL 4% NaOH溶液，搖勻并靜置10 min后用純化水定容，即得目標溶液。在506 nm處測定溶液吸光度，分別以蘆丁質量濃度和相應的吸光度為橫坐標、縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。

精密吸取8.0 mL供試液，依次加入1.0 mL 5% NaNO2、1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液、10.0 mL 4% NaOH溶液，搖勻后靜置10 min，純化水定容至25.0 mL。按照上述NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法在506 nm處測定吸光度，計算浸膏中黃酮的提取率，計算公式參照式（1）。

1.3 方法學考察

1.3.1 精密度試驗

分別取葡萄糖、沒食子酸、蘆丁標準溶液，按1.2.2的方法進行檢測，重復6次，考察儀器精密度。

1.3.2 重復性試驗

稱取同一批樣品粉末6份，分別按1.2.2的方法制備6份樣品溶液，測定多糖、多酚、黃酮含量，考察各指標方法重復性。

1.3.3 穩定性試驗

取相同樣品液3份，分別于4 h內每隔5 min進行一次，按1.2.2的方法測定其多糖、多酚、黃酮含量，考察各指標的穩定性。

1.3.4 加標回收率試驗

取已知質量濃度的樣品溶液18份，每6份為一組，按1.2.2的方法，進行加標回收實驗，測定多糖、多酚、黃酮含量。每份樣品測3次，取均值，考察赤蒼藤多糖、多酚、黃酮的回收率。

1.4 單因素試驗

1.4.1 酶質量分數對赤蒼藤各指標的影響

參照1.2的實驗方法，在酶解pH值為5.0、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為60 min的同等條件下，將纖維素酶的質量分數分別設置為1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察酶質量分數對赤蒼藤多糖、多酚、黃酮提取率及浸膏率的影響。

1.4.2 酶解pH對赤蒼藤各指標的影響

參照1.2的實驗方法，在酶質量分數為3%、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為60 min的同等條件下，分別將酶解pH值調至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，考察酶解pH對赤蒼藤多糖、多酚、黃酮提取率及浸膏率的影響。

1.4.3 酶解溫度對赤蒼藤各指標的影響

參照1.2的實驗方法，在酶質量分數為3%、酶解pH為5.0、酶解時間為60 min的同等條件下，分別設置酶解溫度為25、30、35、40、45、50、55 ℃，考察酶解溫度對赤蒼藤多糖、多酚、黃酮提取率及浸膏率的影響。

1.4.4 酶解時間對赤蒼藤各指標的影響

參照1.2的實驗方法，在酶質量分數為3%、酶解pH值為5.0、酶解溫度為45 ℃的同等條件下，設置酶解時間分別為0、30 、45、60、75、90 min，考察酶解時間對赤蒼藤多糖、多酚、黃酮提取率及浸膏率的影響。

1.5 正交試驗因素水平表

根據單因素的結果，設計 L9（34） 正交試驗，選取酶質量分數（A）、酶解pH值（B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D）為考察因素，以多糖提取率（y1）、多酚提取率（y2）、黃酮提取率（y3）及浸膏率（y4）的綜合評分為評價指標，因素水平見表1。

1.6 熵權法客觀賦權

熵是由信息論的概念發展而來的，熵本身也具有加和性，用于描述系統的無序程度或混亂程度。假如指標的熵值越小，則信息量越大，說明熵有著重要意義，即所占的權重也越大。而熵權法就是根據熵值來確定研究對象中各指標的客觀權重[14]。按照其確定權重的系數值對赤蒼藤中多糖、多酚、黃酮的提取率及浸膏率進行綜合評價，4個指標均設為正向指標。

Step 1 設正交試驗有[m]個因素，共進行了[n]次試驗，建立赤蒼藤各項原始數據的矩陣[X]，如下：

X[=X11X12…X1mX21X22…X2m???Xn1Xn2…Xnm].

Step 2 將該矩陣標準化，并以[rij+]0.000 1進行平移計算，得到矩陣R。

[rij ＝ （yij-yj，min）/（yj，max-yj，min）]， （2）

式中：[yij]代表第[i]個試驗時第[j]項指標數據；其中[yj，max]、[yj，min]分別表示[yij]的最大值和最小值；[i]＝1，2，…，[n]；[j]＝1，2，…，[m]。

Step 3 計算第[j]項指標下的第[i]個樣本所占比重，得到指標值的比重[pij]，

[pij = rij/i=1nrij] . （3）

Step 4 求取信息熵值和權重。根據式（2）和式（3），將其歸一化后計算熵值[Ej]，確定各指標的熵權[Wj]，

[Ej=-1ln "ni=1nln "pij] ， （4）

[Wj=（1-Ej）/m-i=1nEj.] （5）

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

參照1.2.2的實驗方法，得到葡萄糖標準曲線的回歸方程y=13.143x+0.056 3，R2 =0.999 0；沒食子酸標準曲線的回歸方程y=88.976x+0.054 9，R2 =0.998 9；蘆丁標準曲線的回歸方程y=10.317x+0.000 7，R2 =0.999 1。結果表明葡萄糖質量濃度在0.02～0.06 mg/mL、沒食子酸質量濃度在0.002～0.009 mg/mL、蘆丁的質量濃度在0.001～0.070 mg/mL范圍內呈良好的線性關系，見圖1。

2.2 方法學考察結果

2.2.1 精密度試驗

測得多糖、多酚、黃酮相對標準偏差值分別為1.6%、0.1%、0.3%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性試驗

測得多糖、多酚、黃酮相對標準偏差值分別為1.61%、1.27%、2.27%，結果表明所用方法重復性良好。

2.2.3 穩定性試驗

結果表明多酚在5～240 min內較穩定，相對標準偏差值為0.910%；黃酮在5～90 min內較穩定，相對標準偏差值為1.103%；多糖在5～30 min內較穩定，相對標準偏差值為2.460%。

2.2.4 加標回收率試驗

結果顯示多酚的加標回收率為96.79%～103.25%、多糖的加標回收率為95.39%～99.64%、黃酮的加標回收率為90.20%～96.11%，相對標準偏差分別為2.46%、1.85%、2.50%，表明該方法回收率較好。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 酶質量分數對赤蒼藤各指標的影響

如圖2所示，當酶質量分數在2%～4%范圍內時，赤蒼藤多糖含量顯著增加，其他指標也處于較高水平。因此，確定正交優選試驗的酶質量分數的3個水平為2%、3%和4%。

2.3.2 酶解pH對赤蒼藤各指標的影響

如圖3所示，當酶解pH值為5.5時，赤蒼藤各項指標接近最高值；而當酶解pH值超過5.5時，赤蒼藤中的各項指標呈下降趨勢。可見弱酸性條件下更有利于赤蒼藤中有效成分的提取，因此，確定正交優選試驗酶解pH值的3個水平為5.0、5.5、6.0。

2.3.3 酶解溫度對赤蒼藤各指標的影響

如圖4所示，當酶解溫度為50 ℃時，各項指標均處于峰值?？紤]到酶解溫度過高會造成酶滅活，而溫度過低會降低酶解效率，因此，確定正交優選試驗酶解溫度3個水平為45、50、55 ℃。

2.3.4 酶解時間對赤蒼藤各指標的影響

如圖5所示，當酶解時間在30～60 min范圍內時，赤蒼藤各項指標已處于較高水平，且隨著酶解時間的延長，各項指標逐漸趨于平穩。基于時間成本考慮，確定正交優選試驗酶解時間的3個水平為30、45、60 min。

2.4 赤蒼藤最優工藝的篩選

2.4.1 綜合權重的確定

Step 1 建立赤蒼藤各項原始數據的矩陣X。

X[ =17.469.823.0212.9921.5110.723.8512.4521.0711.753.7612.5219.999.482.9713.3622.0211.153.679.9521.0710.754.9313.1217.9610.143.6114.2721.3210.833.4612.3327.5411.483.7512.91].

Step 2 將原始數據標準化，根據式（2）并以0.000 1平移，得到矩陣[R]。

R[ =0.000 10.149 90.025 60.703 80.401 90.546 40.449 10.578 80.358 21.000 10.403 20.595 00.251 10.000 10.000 10.789 50.452 50.735 80.357 20.000 10.358 20.559 61.000 10.733 90.049 70.290 80.326 61.000 10.383 00.594 80.250 10.551 01.000 10.881 20.398 10.685 3].

Step 3 根據式（3）計算指標值的比重[pij]。

[pij =0.000 00.031 50.008 00.124 80.123 50.114 80.139 90.102 70.110 10.210 20.125 60.105 50.077 10.000 00.000 00.140 00.139 00.154 60.111 30.000 00.110 10.117 60.311 50.130 20.015 30.061 10.101 80.177 40.117 70.125 00.077 90.097 70.307 30.185 20.124 00.121 6].

Step 4 根據式（4）和式（5），計算出各項指標的信息熵[Ej]和權重[Wj]，見表2。

2.4.2 正交試驗設計及評分結果

根據熵權法的賦權結果，參考文獻[15]的綜合評分方法并稍作修改，實驗安排及結果見表3，方差分析見表4。

由表3直觀分析可知，各因素對赤蒼藤各項指標綜合評分影響大小依次為：酶解pH值（B）gt; 酶用量（A） gt;酶解溫度（C）gt;酶解時間（D）；由表4方差分析可知，當α=0.05時，酶解pH值具有顯著性差異，其余3因素對實驗結果的綜合評分無顯著差異。最終確定赤蒼藤的最優工藝組合為A3B3C2D2，即酶質量分數為4%，酶解pH值為6.0，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為45 min。

2.4.3 工藝驗證

根據最優工藝，分別取3批次藥材粉末進行平行驗證試驗，結果見表5。試驗數據之間無顯著差異，且得到的綜合評分都在89分以上，y1、y2、y3和y4的相對標準偏差分別為1.43%、2.75%、2.13%和2.47%，表明優選出的提取工藝穩定可行。

3 討論與結論

酶解法在提取各種生物分子如多糖、多酚、黃酮、油脂中的優勢日益凸顯[16]，由于細胞壁多糖（如半纖維素，淀粉，果膠）降低了常規提取技術的提取效率，因此，可利用纖維素酶的專一性特點，在促進有效成分溶出的同時，兼顧實驗條件與環境[17]。

赤蒼藤是一種藥食同源的民族草藥，由于其生長環境特殊，在我國南方以及南亞地區有著悠久的食藥用歷史。為了確保民族用藥安全性和有效性，科學地篩選質控指標和優化提取工藝，對合理評價赤蒼藤質量、指導赤蒼藤資源開發和利用具有重要意義。中草藥具有作用整體性、成分多樣性、靶點復雜性以及成分間相互作用難預測性等特點，相較于傳統的、只注重單一活性成分含量的工藝優化方法，多指標綜合評價已然成為中草藥質量評價新趨勢。為了更合理地評價赤蒼藤的提取工藝，本研究利用酶解法從赤蒼藤中提取多糖、多酚和黃酮類成分。在單因素試驗基礎上，采用熵權法結合L9（34）正交試驗對赤蒼藤的有效部位群進行多指標的綜合定量優化提取，使實驗評價更加客觀，實驗結果更加科學可靠。試驗結果表明：赤蒼藤的最佳提取工藝條件為酶質量分數4%，酶解pH值6.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間45 min。在此條件下，赤蒼藤多糖、多酚、黃酮的平均提取率分別為2.77%、1.18%和0.52%，浸膏平均得率為6.54%，綜合評分均在89分以上，驗證結果較理想。說明熵權-正交法優化赤蒼藤中多指標的提取工藝穩定可行，結果合理、客觀、有效，可應用于赤蒼藤的工藝評價。

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Optimization of multi-index extraction process of Erythropalum scandens Bl. by entropy weight-orthogonal method

LU Yuting1，2，3，5， BI Mingyue4， ZHUO Shen1，2，3，5， LI Youjuan1，5， LU Yuan1，5， WU Shanguang*1，5

（1. Medical School， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545005， China; 2. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 3. Hunan Engineering Technology Research Center of Bioactive Substance Discovery of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 4. School of Pharmacy， Anhui Medical University， Hefei 230032， China; 5. Liuzhou Key Laboratory of Guizhong Characteristic Medicinal Resources Development （Guangxi University of Science and Technology）， Liuzhou 545005， China）

Abstract： The extraction process of Erythropalum scandens Bl. was optimized to provide reference for comprehensive evaluation of its quality. The stem of E. Scandens was taken as the research object and the enzymatic method was used to select the appropriate enzyme dosage， enzymatic pH， enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time as the investigation factors， and extraction rates of polysaccharides， polyphenols， flavonoids and extracts were chosen as the evaluation indexes. Based on the entropy weight method and L9（34） orthogonal test， the multi-index extraction process was optimized. "The optimum extraction conditions were as follows： enzyme mass fraction being 4%， enzymatic hydrolysis "pH 6.0， enzymatic hydrolysis temperature 50 ℃， and enzymatic hydrolysis time 45 min. It is believed that the optimal extraction process is stable and feasible， which can provide "experimental basis for the quality evaluation of Erythropalum scandens Bl.

Keywords：Erythropalum scandens Bl.; entropy weight method; enzymatic method; multi-index evaluation; extraction process

（責任編輯：于艷霞）