蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的抑制機理及其與阿卡波糖的協(xié)同作用

秦朝鳳，李 姣，郝經(jīng)文，卜雅琴，李 勝，陳乃東,3,*

（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；3.中藥質(zhì)量評價與品質(zhì)提升安徽省重點實驗室，安徽 六安 237012）

糖尿病屬于慢性代謝性疾病，需要通過藥物治療才能有效地控制血糖[1]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計，成年糖尿病人數(shù)從2000年的1.51億增長至2017年的4.25億，預計2045年將達6.29億[2]。其中，2型糖尿病被認為是糖尿病的主要類型，它是由于胰島素分泌不足而導致的餐后高血糖[3]。此外，有研究表明，持續(xù)的餐后高血糖往往會引起多種并發(fā)癥，尤其是心腦血管疾病的發(fā)生[4]。因此，控制餐后高血糖已成為治療糖尿病及其并發(fā)癥的重要手段。淀粉作為最重要的碳水化合物來源之一，在人類飲食中貢獻了約40%～60%的能量。然而，體內(nèi)對淀粉的快速消化會導致餐后血糖的快速增加，這與代謝性疾病2型糖尿病呈正相關[5-6]。因此，減少淀粉的消化速度吸引了越來越多研究人員的關注。其中，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以通過抑制小腸中的糖苷酶活性，延緩對所攝入的碳水化合物的消化，進而降低對葡萄糖的吸收，從而達到對血糖水平的控制[7]。

蘆薈大黃素即1,8-二羥基-3-羥甲基-9,10蒽醌，是多種中草藥的天然生物活性蒽醌類化合物，主要來源于百合科蘆薈葉片、蓼科大黃根莖、巴天酸模、山扁豆等植物[8]。蘆薈大黃素被用作中藥已有2 000多年的歷史，來源廣泛，具有安全、經(jīng)濟、高效的優(yōu)點，目前仍存在于各種中藥制劑[9]。蘆薈大黃素已被證實具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、抗寄生蟲、神經(jīng)保護和肝保護等，因此，它已被廣泛用于治療流感病毒、炎癥、敗血癥、阿爾茨海默病、青光眼、瘧疾、肝纖維化、銀屑病、2型糖尿病、生長障礙和幾種癌癥等[10]。對于糖尿病方面，有研究表明，蘆薈大黃素能夠在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和不抵抗情況下激活糖原合成通路；從而降低培養(yǎng)基中葡萄糖水平，增加糖原合成，實現(xiàn)降低血糖的目的[11]。此外，Lu Ling等[12]研究得出蘆薈大黃素可能通過抑制干擾素調(diào)節(jié)因子4、Notch1、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號通路，降低腎組織膠原活性，從而減緩糖尿病腎病癥狀，減輕對腎組織的損害。

蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶活性是否有抑制作用以及如何發(fā)揮抑制作用目前均尚未明確，并缺乏對其聯(lián)合抑制作用的探討。鑒于此，本研究擬系統(tǒng)探究蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的抑制效果和抑制機制。主要采用酶抑制動力學、紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）、熒光猝滅等多種手段，從體外分子水平探究蘆薈大黃素抑制α-葡萄糖苷酶的作用機理，并探究蘆薈大黃素與阿卡波糖的聯(lián)合抑制作用效果，為進一步開發(fā)利用蘆薈大黃素作為調(diào)節(jié)人體血糖的保健食品配方提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆薈大黃素（≥98%）購自南京道斯夫生物科技有限公司，來源于蘆薈葉片，土黃色結晶粉末。其水溶性較低，本研究用含二甲基亞楓的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解（反應液中二甲基亞砜的體積分數(shù)不超過5%），無異常氣味。

α-葡萄糖苷酶（酶活力≥71.2 U/mg）、對硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）（≥99%）、阿卡波糖（≥95%）合肥博美生物科技有限公司；對硝基苯酚（≥99%）、二甲基亞楓（≥99.9%）、磷酸氫二鉀（≥99%）、磷酸二氫鉀（≥99%）、溴化鉀（≥99.95%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純；溶液均采用雙蒸水配制。

1.2 儀器與設備

Synergy H1型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；TU-1950型雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；F-4600型熒光分光光度計 日立科學儀器（北京）有限公司；Thermo Scientific Nicolet iS10型FTIR儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參照文獻[13-14]方法并稍作改動。具體操作步驟為：α-葡萄糖苷酶和PNPG溶解在PBS（0.1 mol/L、pH 6.8）中。將80 μL不同質(zhì)量濃度（25、50、100、150、200 μg/mL）的蘆薈大黃素溶液和20 μLα-葡萄糖苷酶溶液（28 μg/mL）混合，在37 ℃條件下預孵育10 min平衡反應后，將8 mmol/L的PNPG溶液（40 μL）作為底物加入預孵育混合液體系中引發(fā)反應。37 ℃條件下反應30 min后，立刻加入1 mol/L碳酸鈉溶液60 μL以停止反應。最后使用酶標儀測定405 nm波長處的吸光度。將阿卡波糖作為陽性對照，按下式計算α-葡萄糖苷酶抑制率：

式中：A樣品、A樣品空白、A對照及A對照空白分別表示添加蘆薈大黃素和酶反應的吸光度、添加蘆薈大黃素反應的吸光度、添加酶反應的吸光度及蘆薈大黃素和酶均未添加反應的吸光度。

1.3.2 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶抑制動力學實驗

按照1.3.1節(jié)所述方法，當α-葡萄糖苷酶質(zhì)量濃度為28 μg/mL時，分別測定不同質(zhì)量濃度（0、40、80、120、160 μg/mL）的蘆薈大黃素在底物PNPG濃度分別為0.5、1、2、4、6、8 mmol/L時酶的反應初速率。按照式（2）以1/V對1/[S]作圖，得出Lineweaver-Burk曲線圖，并計算其抑制動力學常數(shù)米氏常數(shù)（Km）和最大反應速率（Vmax），以此判定蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的抑制類型[15-16]。利用式（3）進行二次作圖，得到蘆薈大黃素與酶的解離常數(shù)Ki及蘆薈大黃素與酶-底物結合的復合物的解離常數(shù)Ki’，根據(jù)Lineweaver-Burk曲線特征及Ki、Ki’大小判斷其具體抑制類型，分析其抑制作用機制。

式中：[S] 和[I] 分別表示底物和抑制劑的濃度/（mmol/ L）；V表示初始反應速率/（mmol/（L·min））；Km和Vmax分別表示米氏常數(shù)/（mmol/L）和最大反應速率/（mmol/（L·min））；Ki和Ki’均為解離常數(shù)/（μg/mL）。

1.3.3 紫外分析

參照文獻[17-18]方法并稍作修改，將300 μL不同質(zhì)量濃度（0、20、40、60、80、100、120、140 μg/mL）的蘆薈大黃素加入到3 mLα-葡萄糖苷酶溶液（112 μg/mL）中，置于37 ℃條件下反應10 min后，用紫外-可見分光光度計掃描240～310 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。以未添加蘆薈大黃素的α-葡萄糖苷酶溶液作為對照。

1.3.4 FTIR分析

參照文獻[14,18]的方法，并稍作修改，將0.5 mLα-葡萄糖苷酶（1 mg/mL）和1 mL蘆薈大黃素（0.25 mg/mL）的混合溶液在37 ℃條件下孵育10 min。然后將反應后的混合溶液冷凍干燥，進行FTIR測定。對照組采用PBS代替蘆薈大黃素溶液。通過溴化鉀壓片法，利用FTIR對樣品進行分析。在4 cm-1的分辨率下進行60 次掃描，記錄4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的吸光度。

1.3.5 熒光猝滅分析

參考文獻[14,16]的方法，并稍作修改，測量不同質(zhì)量濃度蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶熒光的猝滅作用。在3 mL 28 μg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液中加入不同質(zhì)量濃度（0、20、40、60、80、100、120、140 μg/mL）的蘆薈大黃素溶液300 μL，分別在297.15、303.15、310.15 K溫度條件下反應10 min，用等量PBS作為對照。在3 種不同溫度下，記錄300～500 nm波長處的熒光光譜，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射帶寬均設置為5 nm。在發(fā)射光譜中扣除空白光譜（PBS）。蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅類型由Stern-Volmer方程確定，公式如下：

式中：F0和F分別為無或有蘆薈大黃素時α-葡萄糖苷酶的熒光強度；Kq為猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；Ksv為猝滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為蘆薈大黃素的濃度/（mol/L）；τ0為熒光團的壽命/s；Ka和n分別為蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的結合常數(shù)/（L/mol）和結合位點數(shù)。

通過計算相關的熱力學參數(shù)，以確定蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶之間相互作用的主要結合力類型[19]。焓變（ΔH0）、熵變（ΔS0）和自由能變化（ΔG0）3 個熱力學參數(shù)可由van’t Hoff方程確定，公式如下：

式中：T為溫度/K；R為氣體常數(shù)/（8.314 J/（mol·K））；ΔG0、ΔH0和ΔS0分別為自由能變化/（kJ/mol）、焓變/（kJ/mol）和熵變/（kJ/（mol·K））。

1.3.6 協(xié)同抑制作用分析

參考文獻[20]的方法研究阿卡波糖與蘆薈大黃素聯(lián)合抑制-葡萄糖苷酶活性的作用。Va和Vb分別為阿卡波糖和蘆薈大黃素存在時，α-葡萄糖苷酶的剩余活性。抑制劑阿卡波糖和蘆薈大黃素同時存在時，α-葡萄糖苷酶的剩余活性定義為Vab。Vc表示預期的α-葡萄糖苷酶的剩余活性。假設兩種抑制劑的抑制作用是相互獨立的，則Vc等于VaVb。為了分析阿卡波糖與蘆薈大黃素的相互作用類型，將Vab-Vc值范圍在-0.1以下視為協(xié)同作用，在-0.1和0.1之間的值視為相加作用，超過0.1的值視為亞相加作用[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶抑制活性的評價

如圖1所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蘆薈大黃素和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果均隨著質(zhì)量濃度增加明顯增強。由Origin非線性擬合得到蘆薈大黃素的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值為75.97 μg/mL，而阿卡波糖IC50為338.84 μg/mL。以上結果表明，蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用比阿卡波糖更強，對α-葡萄糖苷酶有更好的抑制作用[22]。

圖1 蘆薈大黃素和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of aloe emodin and acarbose on α-glucosidase

2.2 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶抑制類型的分析

如圖2a所示，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中所有直線交于第3象限。隨著蘆薈大黃素質(zhì)量濃度的增加，橫截距越小、縱截距均越大，即Vmax和Km均呈下降趨勢，此結果說明蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶抑制類型是一種非競爭與反競爭的混合型抑制。

圖2 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk圖Fig.2 Lineweaver-Burk plot for the inhibitory effect of aloe emodin on α-glucosidase

由圖2b、c可知，抑制劑與α-葡萄糖苷酶作用的解離常數(shù)Ki值為88.78 μg/mL，而抑制劑與α-葡萄糖苷酶-PNPG的復合物作用的解離常數(shù)Ki’值為25.90 μg/mL，說明蘆薈大黃素更傾向于與α-葡萄糖苷酶-底物復合物結合。詳細的動力學參數(shù)如表1所示。

表1 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for α-glucosidase inhibition by aloe emodin

2.3 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶紫外光譜的影響

紫外-可見吸收光譜法是一種可以簡單、快速、準確地評價在抑制劑作用下，酶的結構及復合物形成的一種新方法。α-葡萄糖苷酶在280 nm波長處有一特征吸收峰，是由于其芳香族氨基酸發(fā)生π→π*躍遷所引起的[23]。由圖3可以看出，α-葡萄糖苷酶的紫外吸收峰在沒有或存在蘆薈大黃素時存在顯著差異。隨著蘆薈大黃素質(zhì)量濃度的增加，特征峰的位置并沒有顯著地移動，但α-葡萄糖苷酶的吸收峰強度大幅增加，吸收峰強度變化具有濃度依賴性，這說明蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶之間存在相互作用，形成了新的復合物。該現(xiàn)象表明α-葡萄糖苷酶-蘆薈大黃素復合物的形成可能會有利于分子間和分子內(nèi)聚集，破壞Trp和Tyr芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境空間結構，可能導致酶的構象變化和疏水基團的暴露，這與沈荷玉等[17]研究沒食子酸與α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶結合的紫外光譜圖結果相似。

圖3 蘆薈大黃素質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶紫外光譜的影響Fig.3 Effect of aloe emodin concentration on UV spectra of α-glucosidase

2.4 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶FTIR的影響

紅外光譜分析是研究蘆薈大黃素誘導α-葡萄糖苷酶結構變化的重要手段。蛋白質(zhì)的FTIR由幾個特征吸收峰組成，包括N—H拉伸振動（3 300～2 070 cm-1）峰，酰胺I 鍵（1 700～1 600 cm-1）、酰胺II 鍵（1 600～1 500 cm-1）和酰胺III鍵（1 400～1 200 cm-1）特征峰[24]。據(jù)報道，酰胺I鍵（C＝O拉伸振動）對蛋白質(zhì)二級結構的變化比其他鍵更敏感[25]。因此，為了進一步確定化合物對α-葡萄糖苷酶的影響，使用FTIR儀檢測樣品的酰胺I鍵特征峰。如圖4所示，在蘆薈大黃素的存在下，α-葡萄糖苷酶的特征峰數(shù)量沒有增加，說明酶與抑制劑相互作用過程中沒有形成新的共價鍵[26]。另一方面，在α-葡萄糖苷酶溶液中加入蘆薈大黃素后，酰胺I鍵的吸收峰強度明顯增加，且酰胺I鍵由1 654.58 cm-1藍移到1 650.11 cm-1，表明蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶發(fā)生了相互作用并對其構象產(chǎn)生了影響。

圖4 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶紅外光譜的影響Fig.4 Effect of aloe emodin on IR spectra of α-glucosidase

2.5 蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響

熒光光譜法常被用于研究蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用[27]。因為含有Trp、Tyr和Phe等芳香族氨基酸，所以α-葡萄糖苷酶會產(chǎn)生一種內(nèi)源性熒光，而熒光的強度和位置與這些芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境有著緊密的聯(lián)系[28]。如圖5所示，當激發(fā)波長為280 nm時，α-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射特征峰位于340 nm處，隨著蘆薈大黃素的加入（0～140 μg/mL），該體系的熒光強度降低，但最大發(fā)射波長并無明顯變化，這說明蘆薈大黃素能夠通過與酶的相互作用強烈地猝滅α-葡萄糖苷酶的固有熒光，且使其芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生變化。

圖5 蘆薈大黃素質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響Fig.5 Effect of aloe emodin concentration on fluorescence spectra of α-glucosidase

從圖6a可以看出，蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶熒光強度的線性關系良好。由表2可知，Ksv值隨著溫度的升高而減小，由2.101×103L/mol降低至1.755×103L/mol；Kq值遠大于生物大分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/（mol·s），其值均大于1.5×1011L/（mol·s），說明蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅不是動態(tài)碰撞引起的，而是通過酶-配體復合物的形成引起的靜態(tài)猝滅。

表2 蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶相互作用及熱力學參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters for the interaction between aloe emodin and α-glucosidase

圖6 蘆薈大黃素猝滅α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer圖Fig.6 Stern-Volmer plots of fluorescence quenching of α-glucosidase by aloe emodin

2.6 蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的熱力學參數(shù)及相互作用力類型的判斷

為了進一步確定蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的相互作用機制，可以通過式（5）計算確定結合常數(shù)（Ka）和結合位點數(shù)（n），結果如圖6b所示。由表2可知，隨著溫度的升高，結合常數(shù)Ka也隨之增加，由1.898×102L/mol增加至3.927×105L/mol，說明溫度越高，蘆薈大黃素與酶結合的親和力越強，即蘆薈大黃素與酶形成的復合物穩(wěn)定性提高；同時，結果表明在大部分溫度下蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的相互作用位點趨向于1。

根據(jù)van’t Hoff公式計算ΔH0、ΔS0及ΔG0的變化，從而確定蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的作用力。配體與蛋白質(zhì)之間的非共價相互作用力一般有4 種類型，即靜電相互作用、氫鍵、范德華力和疏水相互作用[29]。如表2 所示，ΔG0為負值，證明了蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的相互作用是一個自發(fā)的過程。而ΔH0為452.03 kJ/mol，ΔS0為1.562 kJ/（mol·K），表明其相互作用力主要是疏水相互作用。

2.7 蘆薈大黃素與阿卡波糖聯(lián)合抑制α-葡萄糖苷酶的作用分析

許多研究表明，兩種或兩種以上的抑制劑聯(lián)合使用可以協(xié)同抑制α-葡萄糖苷酶的活性。本研究采用報道的方法計算組合作用的類型，根據(jù)聯(lián)用后α-葡萄糖苷酶的剩余活性Vab與預期的α-葡萄糖苷酶的剩余活性Vc的差值判斷，差值在-0.1以下為協(xié)同作用，在-0.1和0.1之間的值為相加作用[21]，相應結果見表3。蘆薈大黃素與阿卡波糖組合的Vab-Vc值范圍均在-0.1以下，表明蘆薈大黃素與阿卡波糖低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度的組合對α-葡萄糖苷酶的活性均具有協(xié)同抑制作用，即蘆薈大黃素與阿卡波糖的結合可以增強對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。因此，可以推測出蘆薈大黃素與阿卡波糖聯(lián)用時，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用優(yōu)于單一抑制劑，能有效地提高抑制能力并降低阿卡波糖的不良反應。

表3 阿卡波糖與蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶抑制活性的協(xié)同作用Table 3 Synergistic effect of acarbose combined with aloe emodin on α-glucosidase activity

3 討論

α-葡萄糖苷酶是2型糖尿病的治療靶點，其抑制劑可以通過阻礙膳食碳水化合物的消化，將餐后血糖維持在正常水平。大量研究表明，自然界中存在的天然產(chǎn)物是α-葡萄糖苷酶抑制劑的重要來源，包括黃酮類化合物、酚酸、單寧酸、類胡蘿卜素、萜類、糖類和生物堿等[30-31]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找抑制α-葡萄糖苷酶活性的有效藥物對調(diào)節(jié)血糖濃度和控制餐后高血糖具有重要意義。本實驗以蒽醌化合物中的蘆薈大黃素為研究對象，發(fā)現(xiàn)其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用強于阿卡波糖。另外，研究可知蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶抑制類型是非競爭與反競爭的混合型抑制，其抑制類型與阿卡波糖不同。

Zheng Yuxue等[14]通過紅外光譜、圓二色光譜和熒光光譜研究阿魏酸對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制機理，證實了阿魏酸與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶以非共價鍵結合，猝滅其固有熒光強度，并證實隨著阿魏酸的加入，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的二級結構發(fā)生改變。沈荷玉等[17]采用紫外光譜和圓二色光譜分析表明，沒食子酸的加入導致酶構象發(fā)生變化，熒光光譜結果表明沒食子酸以靜態(tài)猝滅的方式強烈猝滅酶的內(nèi)源性熒光，改變氨基酸殘基Trp和Tyr所處的微環(huán)境。本實驗也采用多種光譜分析方法研究蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的抑制機理。首先運用紫外光譜法初步分析蛋白質(zhì)分子構象，得出蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶之間形成一種新的復合物。再運用紅外光譜法得出蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶發(fā)生相互作用使其構象發(fā)生改變。最后利用熒光光譜法深入探究兩者的作用機制，其結果表明蘆薈大黃素通過靜態(tài)猝滅的方式猝滅α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光，且結合方式以疏水作用力為主。

單藥大劑量的使用常常會產(chǎn)生多種不良反應或藥物抗性，而將兩種或兩種以上具有協(xié)同治療作用的藥物組合使用時，可明顯降低藥物的劑量和毒性。聯(lián)合用藥所產(chǎn)生的協(xié)同效果一般具有以下的優(yōu)勢：在顯著增加治療效果的同時，可以減少藥物使用的劑量，即能夠增加或保持相同療效以減緩毒副作用的發(fā)生以及減少或減緩耐藥性的發(fā)生。當具有不同機制或作用模式的藥物直接作用于單一靶點或某一種疾病時，可以起到更有效的治療效果。阿卡波糖是一種典型的α-葡萄糖苷酶競爭性抑制劑，臨床常用來治療餐后高血糖[32]。但大量或長期服用阿卡波糖可引起腹脹、腹瀉等副作用。越來越多的證據(jù)表明，天然降糖產(chǎn)品與阿卡波糖聯(lián)合使用可以提高阿卡波糖的療效，延長其降糖活性[33]。因此，針對糖尿病的治療方案，迫切需要對傳統(tǒng)藥物和天然產(chǎn)物的聯(lián)合使用進行研究。本實驗通過將蘆薈大黃素與阿卡波糖以不同質(zhì)量濃度聯(lián)合使用，結果表明蘆薈大黃素與阿卡波糖具有協(xié)同抑制α-葡萄糖苷酶的作用，即蘆薈大黃素與阿卡波糖聯(lián)合使用能更好地改善降糖效果。目前，越來越多的研究表明兩種不同類型的抑制劑同時使用時具有協(xié)同抑制α-葡萄糖苷酶的效果。Yang Jichen等[20]曾報道過4 種黃酮類化合物（芹菜素、野黃芩素、高車前素和澤蘭黃酮）與阿卡波糖聯(lián)合抑制α-葡萄糖苷酶活性具有協(xié)同作用，其中，芹菜素與阿卡波糖組合的協(xié)同效果最好，低濃度和高濃度均有協(xié)同抑制作用，與本實驗結果相似。

4 結論

本研究以蘆薈大黃素作為蒽醌類化合物代表，采用抑制動力學、紫外光譜法、紅外光譜法和熒光光譜法系統(tǒng)研究蘆薈大黃素抑制α-葡萄糖苷酶的機理，并對蘆薈大黃素和阿卡波糖聯(lián)用的抑制作用進行了研究。蘆薈大黃素IC50為75.97 μg/mL，阿卡波糖IC50為338.84 μg/mL，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用比阿卡波糖強。酶促反應動力學結果顯示，蘆薈大黃素以非競爭性和反競爭性混合型抑制類型方式與α-葡萄糖苷酶結合，且更傾向于與酶-底物的復合物結合。紫外光譜分析結果表明，蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶之間形成了一種新的復合物。FTIR分析結果進一步表明，蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶發(fā)生了相互作用并對其構象產(chǎn)生影響。蘆薈大黃素對α-葡萄糖苷酶的熒光光譜分析結果顯示，蘆薈大黃素通過靜態(tài)猝滅的方式猝滅α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光，使其所處的環(huán)境發(fā)生變化，進而影響其活性。并且，蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的結合主要以疏水相互作用為主。同時，蘆薈大黃素與阿卡波糖聯(lián)合使用抑制α-葡萄糖苷酶活性的結果顯示，兩者對α-葡萄糖苷酶的活性具有協(xié)同抑制作用。

綜上所述，蘆薈大黃素能夠很好地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而有效地延緩了糖類的消化速度，這對于改善人體的血糖水平以及控制餐后高血糖都有非常重要的意義。因此，該研究可為天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的研發(fā)利用提供一定的實驗依據(jù)。