山藥顆粒結合型淀粉合成酶基因DaGBSS的克隆與分析

王培龍, 徐 婉, 楊燕萍, 付雙彬, 應 震, 楊周祥, 姚麗娟, 周 莊

(浙江省亞熱帶作物研究所1,溫州 325005)

(瑞安市自然資源和規劃局2,瑞安 325200)

山藥為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)具有雙子葉植物特征的一年生或多年生纏繞性藤本植物[1,2],其塊莖是主要的食用部位,有長、扁、圓3種不同形態[3]。山藥地下塊莖因含有豐富的淀粉、蛋白質、氨基酸、薯蕷皂苷及其他對人體有益的微量元素,具有增強免疫力、延緩衰老和抗氧化等功效,具有很高的營養保健和藥用價值,在我國被廣泛用作菜用鮮食和藥材加工的原材料。因其塊莖中的淀粉及蛋白質含量與谷物相當,又被視為糧食作物,是一種有著廣闊前景的經濟作物[4-8]。我國的山藥栽培分布非常廣,且地區間自然環境和氣候差異較大,經過長期的自然適應和人工選擇,在全國范圍內形成多個栽培區域[9]。以長江為界,我國的山藥栽培區域分為南方栽培區和北方栽培區[10],北方栽培地區的主要山藥品種為薯蕷(D.opposite),即山藥分類中的普通山藥,包括許多品質優良的地方特色品種,如鐵棍山藥、嘉祥細毛長山藥和西施種子等。南方地區不僅栽培薯蕷,同時也種植山薯(D.fordi)、參薯(D.alata)、日本薯蕷(D.japonica)和褐苞薯蕷(D.persirnilis)等。不同種類的山藥因其基因表達、激素含量等不同從而影響其生長發育規律,且地區間環境的差異對其生長發育過程也有顯著的影響。山藥的種植地域遼闊,溫度、水分和光照條件等差異大,在長期的栽培過程中形成了華南、華中、東北、西北和華北5個主要栽培區域,各區域所產山藥的品質也各有差異[11]。

淀粉是山藥的主要儲藏物質,其性質和組成與山藥的食用和加工品質有著密切關系[12]。大部分山藥品種的淀粉組成以直鏈淀粉含量為主,口感上表現出粉性,如淮山藥等;而部分種質則以支鏈淀粉為主,表現出極具特色的糯性口感。顆粒結合型淀粉合成酶(GBSS)在直鏈淀粉的合成中起關鍵作用,GBSS通過α-1,4糖苷鍵將ADPG中的葡萄糖殘基添加到葡聚糖的非還原端上,來延長葡聚糖的直鏈[13]。GBSS包括GBSSI(也稱為GBSS1)和GBSSII(也稱為GBSS2)2種同工酶,GBSSI主要控制儲藏器官中直鏈淀粉的合成,GBSSII主要控制非儲藏器官中直鏈淀粉的合成[14]。

Wang等[15]報道了水稻GBSSI基因(又稱蠟質基因或Wx基因)的全序列,該基因與玉米、小麥等單子葉植物的Wx基因相比,第1內含子較大,水稻GBSSII與GBSSI的結構相似,二者在氨基酸序列水平的一致性達到了66%[16]。在谷物中,GBSSI由Wx基因編碼,在花粉、胚乳和胚囊中控制直鏈淀粉的合成,具有組織特異性,而GBSSII基因在葉、莖、根、果皮等非儲藏組織中表達[17,18]。在栽培稻中,Wxa主要存在于秈稻中,Wxb則主要存在于粳稻中,并且純合Wxa水稻胚乳內的蠟質蛋白表達量高于Wxb水稻蠟質蛋白,導致秈稻直鏈淀粉含量高于粳稻[19,20]。趙雨欣[21]對水稻OsGBSSI基因的啟動子進行多靶向位點編輯,發現突變植株的直鏈淀粉含量出現了不同程度的降低,且突變株的直鏈淀粉含量隨OsGBSSI基因表達量的下降而降低。沈革志等[22]將反義Wx基因和含潮霉素抗性的基因導入水稻,篩選出直鏈淀粉含量降低而無潮霉素抗性基因的植株。Chen等[23]將反義Wx基因轉入水稻,發現部分水稻胚乳的直鏈淀粉質量分數降低,最低可達7.02%,比野生型低72.4%。玉米GBSSI和GBSSIIa參與玉米籽粒中直鏈淀粉的合成,GBSS基因在授粉15 d的胚乳中表達量較高,在根和葉中表達量較低[24,25]。高直鏈玉米比普通玉米具有更高的直鏈淀粉含量、更低的相對結晶度,可能是由于GBSSI和PUL基因的高表達量、SBEIIa基因和SBEIIb基因的低表達量導致的[26]。糯玉米中的GBSSI基因發生突變,會形成高支鏈淀粉[27]。

小麥中編碼GBSS蛋白的基因為Wx基因,小麥Wx蛋白由Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1編碼,小麥籽粒中缺失不同Wx蛋白對GBSSI基因的相對表達量、GBSS活性、直鏈淀粉的積累量產生影響[28]。在小麥中高溫脅迫使GBSSI基因的表達量提前到達頂峰[29]。在灌漿過程中大麥GBSSI主要負責直鏈淀粉的合成[30]。高粱籽粒中缺失GBSSI會導致其支鏈淀粉含量增加[31]。

在薯類作物中,劉玉匯等[32]從馬鈴薯塊莖中克隆出GBSSI基因的cDNA序列,編碼607個氨基酸,具有3個保守功能區域。馬鈴薯塊莖形成過程中GBSS活性、GBSSI基因的表達量降低,淀粉黏度和回生值降低,直鏈淀粉含量增加,總淀粉含量減少[33]。通過CRISPR/Cas9技術對馬鈴薯的GBSS進行基因編輯,使馬鈴薯GBSS酶的功能完全喪失[34]。Veillet等[35]通過敲除優良四倍體馬鈴薯品種中產生直鏈淀粉的GBSSI基因,產生了直鏈淀粉生物合成受損的四等位基因突變馬鈴薯,也證實了GBSSI蛋白的功能。文成糯山藥Wx基因的表達量降低,導致山藥的直鏈淀粉含量減少[36]。

在其他物種中,關于GBSS基因也有相關報道。在離體百合鱗莖發育過程中,LohGBSSI基因在小鱗莖膨大初期(15 d時)表達量最高,在鱗莖和葉中的表達顯著高于莖段和根,表明百合鱗莖直鏈淀粉合成的主要的部位是鱗莖和葉[37]。在豌豆胚胎發育過程中GBSSII的表達高峰在GBSSI前,GBSSII在植物的各個組織中都有表達,而GBSSI在根、托葉或花中不表達[38]。王前等[39]克隆了芡實GBSSI基因,編碼528個氨基酸,為穩定的親水性蛋白。

在一些水果中也鑒定到了GBSS基因,從蘋果、桃子和橘子3種水果中分離并鑒定了3、2、2個GBSS基因,它們在葉、花、果實發育過程中均有表達,具有組織表達特異性[40]。從天寶蕉中克隆出了MaGBSSI[41],在巴西蕉中分離并鑒定了6個GBSS基因,且能通過影響香蕉果實發育和儲藏過程中GBSS的水平變化、淀粉顆粒的數量和大小來調節直鏈淀粉代謝[42]。荸薺EdGBSS基因在球莖、匍匐莖、葉狀莖和分株芽組織中均有表達,但在球莖中的表達量最高,在分株芽中表達量最低[43]。從蓮藕美人紅和z9中克隆出NnGBSS基因,發現隨著蓮藕根狀莖的發育,其總淀粉與直鏈淀粉含量不斷增加,且NnGBSS基因的表達量越高,直鏈淀粉的含量也越高[13]。

隨著消費者對食品口感和營養保健功能需求的不斷提高,糯性山藥因其獨特的口感和藥用價值而成為市場的新寵,其中以產自浙南地區的糯米山藥為代表。糯米山藥為參薯(D.alata)的一個地方傳統栽種品種,由于市場影響力不斷擴大,得到了越來越多育種專家的關注。但是目前對糯米山藥的研究仍處于起步階段,在山藥淀粉代謝及淀粉特性、山藥糯性品質形成機制、通過分子手段對與山藥生長發育相關差異表達基因的研究均鮮有報道,鮮見通過準確調控淀粉含量、組成等技術開展山藥新品種選育,影響了山藥產業的進一步發展。鑒于此,本研究采用分子克隆的方法對山藥顆粒結合型淀粉合成酶基因DaGBSS進行克隆并進行相關的生物信息學分析,同時通過qRT-PCR對該基因在糯米山藥不同部位的時空表達模式進行探究,相關酶活進行測定,以期在分子水平上,為研究糯米山藥塊根在直鏈淀粉合成相關酶的表達與調控、糯米山藥塊莖發育過程中直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成與積累的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

糯米山藥樣本為浙江省文成縣采挖15 d的山藥根莖,將樣本按照生長部位從上至下分為4個部分,去皮處理后放入液氮中速凍,之后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 RNA提取、反轉錄及cDNA的合成

采用CTAB法對獲得的山藥樣品進行總RNA提取,具體操作步驟參考胡根海等[44]方法。分別采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanovue微型光度計對獲得的RNA提取質量和濃度進行檢測。RNA反轉錄和cDNA合成采用蘭博利德All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix (with dsDNase),具體操作方法按照說明書進行。將反轉錄獲得的山藥cDNA稀釋10倍后用于實時熒光定量RT-PCR和基因克隆。

1.3 DaGBSS基因的查找與克隆

以“granule-bound starch synthase”為關鍵詞,對實驗室前期獲得的糯米山藥轉錄組Unigenes進行查找,獲得的GBSS基因cDNA序列,運用BioEdit軟件對比篩選,去除序列相同的基因,進而通過BLASTX(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)篩選具有完整ORF的基因序列。以DaGBSS-F:ATGGCTGCTGTTACGGCTTCCCAT;DaGBSS-R:TCATGCAG-TGGCTGGTACTTTCT為引物,以糯米山藥cDNA為模板進行DaGBSS基因的RT-PCR克隆,反應體系為:dNTP Mix(10 mmol/L)0.4 μL,10×LA Taq PCR buffer 2 μL,LA Taq(5 U/μL)0.3 μL,基因上下游引物各1 μL,模板2 μL,無菌水補充至20 μL;反應程序為:95 ℃預變性3 min, 95 ℃變性30 s, 61 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min 10 s,30個循環,72 ℃延伸10 min。將獲得的RT-PCR反應產物進行電泳,取片段大小正確的基因片段使用膠回收試劑盒進行回收。之后將膠回收產物與T載體連接,進而將連接產物通過熱激法轉化到大腸桿菌感受態細胞TOP10中,并涂布于含有50 mg/L氨芐青霉素(Amp)的固體LB培養基中,37 ℃培養8 h。挑取單克隆菌落,用載體引物和基因引物分別進行PCR驗證,選取條帶大小正確的菌株進行測序分析。

1.4 DaGBSS基因的生物信息學分析

對DaGBSS基因序列利用ExPASy軟件中的ProtParam程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)推導其編碼蛋白的相對分子質量及理論等電點;利用ProtComp 9.0 (http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group= programs&subgroup=proloc&example=example1)在線工具對DaGBSS蛋白進行亞細胞定位預測分析;利用InterProscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)在線工具對山藥DaGBSS蛋白所屬的家族和存在的結構域進行預測。應用ExPASy的ProtScale程序(https://web.expasy.org/protscale/)計算山藥DaGBSS蛋白的疏水性圖譜。利用在線分析軟件SignalP 4.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)對DaGBSS蛋白的信號肽進行預測;根據ExPASy提供的軟件TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/ service.php?TMHMM-2.0)對DaGBSS蛋白的跨膜區和跨膜拓撲結構進行預測;運用ExPASy Proteomics tools中的SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)軟件預測DaGBSS蛋白的二級結構,使用Swissmodel軟件(https://swissmodel.expasy.org/)預測DaGBSS蛋白的三維結構。

利用NCBI中的BLASTP程序對DaGBSS的氨基酸序列進行比對,搜索10種同源性較高的植物的GBSS氨基酸序列,包括圓形薯蕷亞種(Dioscoreacayenensissubsp.rotundata)、油棕(Elaeisguineensis)、檬果(Mangiferaindica)、龍舌蘭(Agavetequilana)、海棗(Phoenixdactylifera)、尖頭芭蕉亞種(Musaacuminatasubsp.malaccensis)、阿月渾子(Pistaciavera)、澳洲堅果(Macadamiaintegrifolia)、香蕉(MusaacuminataAAA Group)、karat香蕉(Musatroglodytarum)。利用Clustalx1.83軟件進行多序列比對分析。此外,根據選取的10個物種的GBSS蛋白氨基酸序列,使用MEGA5.0軟件進行系統進化樹構建分析。

1.5 qRT-PCR分析

以糯米山藥不同部位cDNA為模板,用糯米山藥DaGBSS基因定量引物(表1)進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。選擇山藥CKI-2基因作為內參基因[45]。qRT-PCR的反應體系為:SYBR 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各1 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O補充到20 μL。反應程序為:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,80 ℃ 1 s,讀版,45個循環。使用QuantStudioTM6 and 7 Flex實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR實驗。qRT-PCR數據采用2-ΔΔ(Ct)方法分析[46]。

表1 DaGBSS基因克隆和qRT-PCR引物序列

1.6 GBSS和直鏈淀粉含量測定分析

對山藥樣品采用酶聯免疫分析中的雙抗體夾心法進行GBSS含量測定,詳細的實驗方法為:用純化的植物結合型淀粉合成酶(GBSS)捕獲抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被的微孔中依次加入GBSS,再與HRP標記的檢測抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GBSS呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中GBSS活性[47]。同時采用碘結合比色法對樣品的直鏈淀粉含量進行測定[48]。

2 結果與分析

2.1 糯米山藥DaGBSS基因的克隆

以糯米山藥cDNA為模板,以DaGBSS-F和DaGBSS-R為上下游引物,通過RT-PCR擴增得到一條特異條帶(圖1b)。純化回收后連接到pMD18-T克隆載體上,轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α,將菌液PCR檢測得到的陽性克隆菌株進行測序,得到1條具有完整ORF的DaGBSS基因。

圖2 DaGBSS蛋白的一級結構

圖3 DaGBSS蛋白的疏水性、跨膜區和跨膜拓撲結構、信號肽預測

圖5 山藥DaGBSS蛋白質的三級結構預測

2.2 DaGBSS蛋白質的結構分析

通過測序分析,得到一個完整的山藥DaGBSS基因ORF序列,長度為1 845 bp,編碼614個氨基酸,通過BLASTp對DaGBSS氨基酸序列分析得到DaGBSS蛋白一級結構圖(圖 2)。ProtParam預測DaGBSS蛋白的分子質量為67.87 ku,理論等電點PI為6.27,為一酸性蛋白,其中含有72個帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu),67個帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys),N-末端含硫類的蛋氨酸M(MET)序列,在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別大于20 h和10 h。DaGBSS蛋白的不穩定值數為(II)29.59,屬于穩定蛋白。

利用ProtComp9.0在線工具對DaGBSS的亞細胞定位預測,結果顯示,DaGBSS蛋白的定位在葉綠體的分值為8.57。利用InterProscan在線工具預測,結果表明DaGBSS蛋白屬于植物糖原合酶(IPR011835),含有1個淀粉合酶催化結構域(IPR013534,90-348)和1個糖基轉移酶1類結構域(IPR001296,404-532)。用ExPASy的ProtScale程序計算山藥DaGBSS蛋白的疏水性,結果表明DaGBSS蛋白的疏水曲線在143、144、407、408、409位附近氨基酸疏水性較強,而在71、72、73、131、132位附近氨基酸親水性較強,疏水性系數為-102.18,屬于親水性蛋白(圖 3a)。利用ExPASy提供的在線跨膜區預測軟件TMHMM對DaGBSS蛋白的跨膜區和跨膜拓撲結構進行預測,結果顯示該蛋白沒有跨膜區(圖 3b),屬于非跨膜蛋白。利用在線分析軟件SignalP 4.1預測DaGBSS蛋白信號肽,結果顯示無信號肽存在(圖 3c)。

運用ExPASy Proteomics tools中的SOPMA軟件對DaGBSS蛋白質二級結構進行預測,該蛋白質的二級結構中,α-螺旋和無規則卷曲占主要部分,分別占39.74%和40.55%,片層結構和β轉角占14.50%和5.21%(圖 4)。

進一步通過SWISS-MODEL對DaGBSS蛋白的三級結構進行預測,結果顯示,共匹配到4個可能的模型圖(圖 5),分別為顆粒結合淀粉合酶1,糖原磷酸化酶,糖原(淀粉)合酶、麥芽糖糊精磷酸化酶,其得分依次為0.75、0.31、0.32、0.36,且顆粒結合淀粉合酶1的模型匹配度高達68.63%,說明DaGBSS蛋白的三級結構最有可能為模型A。

2.3 山藥DaGBSS蛋白的序列相似性及進化分析

DaGBSS、10個不同物種的GBSS氨基酸序列比對結果顯示,DaGBSS與所選物種的氨基酸序列之間具有較高的同源性(相似性為70.03%～95.28%),都含有典型的淀粉合酶催化結構域和糖基轉移酶1類結構域。為進一步分析山藥DaGBSS蛋白的進化關系,將選擇的10個GBSS氨基酸序列與山藥DaGBSS氨基酸序列一起,使用MEGA 5.0中的Neighbor-joining構建蛋白系統進化樹。結果表明,DaGBSS蛋白與圓形薯蕷亞種(Dioscoreacayenensissubsp.rotundata)的物種進化親緣關系更近(圖6)。

圖6 DaGBSS蛋白與其他物種GBSS蛋白的進化分析

2.4 山藥DaGBSS基因的時空表達分析

為了初步分析DaGBSS基因的表達能力,利用實時定量qRT-PCR分析了在糯米山藥塊根不同組織部位(圖7)DaGBSS基因的表達模式。結果顯示(圖8):與S1部位相比,DaGBSS基因在S2、S3、S4的表達量明顯升高,分別是S1的9.13、7.73、11.44倍,尤其是在S4部位表達量達到最高值。進一步對4個部位的顆粒結合型淀粉合成酶(GBSS)、直鏈淀粉含量進行測定。結果顯示,4個部位的GBSS含量均在2.5 U/g左右,其中與S1部位相比,S2和S3部位的含量稍低,而S4部位的GBSS含量最高,是S1的1.17倍;而直鏈淀粉在4個部位的含量與DaGBSS基因的表達趨勢一致,在S1部位最低,在S4部位最高。綜合三者結果,說明DaGBSS基因在山藥根部的表達存在差異性,這些表達差異會引起山藥根部不同位置顆粒結合型淀粉合成酶合成量的不同,從而導致不同部位直鏈淀粉含量差異。

圖7 取樣部分示意圖

圖8 DaGBSS基因在山藥根部不同部位的表達分析

3 討論

山藥的塊莖作為食用和藥用的主要部分,其組成對其食用和藥用的效果有重要影響,了解其營養成分的含量和作用,可以更好地使糯米山藥的塊莖在飲食和健康管理中發揮作用。淀粉是高等植物光合產物主要的儲存形式,可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。淀粉也是山藥地下塊莖的重要組成成分,直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對含量可以影響山藥的口感、黏性、糊化性、回生性等特性[49]。在山藥中有多種酶參與淀粉的合成,其中顆粒結合淀粉合成酶在直鏈淀粉的延長中扮演重要角色[50]。GBSS蛋白不能正常表達或活性下降是禾谷類作物糯性形成的根本原因。例如,糯稻中GBSSI基因堿基片段的突變或插入,會引起前體mRNA的不能正常剪切,從而導致GBSSI表達量減少[51];在糯玉米中,GBSSI基因缺失突變體Wx-D7和Wx-D10的GBSSI蛋白功能喪失[52,53];編碼小麥GBSS蛋白表達的Wx基因發生突變會影響小麥的糯性[54]。在馬鈴薯中,4個經CRISPR/Cas9基因編輯的GBSS基因形成的突變體則完全缺失直鏈淀粉的合成能力[55]。

研究通過對山藥轉錄組分析、同源克隆得到一個擁有完整開放閱讀框的糯米山藥顆粒結合型淀粉合成酶基因,cDNA片段長度為1 845 bp,編碼614個氨基酸。生物信息學分析結果顯示DaGBSS蛋白為酸性穩定蛋白,含有淀粉合酶催化和糖基轉移酶2個功能結構域。氨基酸多序列比對結果顯示:糯米山藥DaGBSS蛋白與所選的物種具有較高的同源性,在70.03%以上,且含有典型的功能結構域。無根進化樹分析結果顯示DaGBSS蛋白與圓形薯蕷亞種的物種進化親緣關系更近,說明該基因在同屬內具有較強的保守性。通qRT-PCR對該基因在糯米山藥塊莖不同部位的表達分析結果表明:DaGBSS基因在山藥塊莖的表達存在明顯的差異性,DaGBSS基因在S2、S3、S4的表達量分別是S1的9.13、7.73、11.44倍。進一步對相關指標測定結果表明,GBSS和直鏈淀粉在不同部位的含量存在差異性,且直鏈淀粉的含量變化趨勢與DaGBSS基因的表達趨勢一致,由此推測DaGBSS基因的組織表達差異性可能會引起山藥塊莖顆粒結合型淀粉合成酶合成的差異,從而導致山藥塊莖不同位置直鏈淀粉含量的差異,最終影響食用口感和效果。

通過對DaGBSS基因的結構和蛋白結構特點、在山藥塊莖不同部位的表達進行解析,為山藥的分子育種提供重要的基因資源,同時為糯米山藥塊莖發育過程中直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成與積累的研究提供參考。研究僅對DaGBSS基因的結構及相關表達進行了探究,關于DaGBSS基因的基本分子生物學功能、與如何在山藥塊莖的淀粉合成途徑中發揮功能將在未來的研究中進行詳細的探究。

4 結論

研究從山藥中克隆得到1個顆粒結合型淀粉合成酶基因DaGBSS,ORF全長1 845 bp,編碼614個氨基酸,為酸性穩定親水性蛋白,含有典型的淀粉合酶催化結構域和糖基轉移酶1類結構域,且與圓形薯蕷亞種的物種進化親緣關系最近。通過對采收15 d山藥塊莖進行RNA提取、qRT-PCR分析,結果表明,DaGBSS基因的表達具有時空表達特異性,且在距離地表位置最遠的部位DaGBSS基因的表達量、GBSS和直鏈淀粉的含量均為最高。研究通過對山藥塊莖淀粉合成的早期階段進行分析,克隆出淀粉合成過程中的關鍵調控因子,為淀粉合成的調控、農作物品種改良和能源植物的培育提供參考。