基于黑曲霉固態(tài)發(fā)酵的綠豆皮降解及理化特性提升機(jī)理

趙一帆, 羅 磊, 馬 瀟, 劉浩宇

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,洛陽 471023)

綠豆在我國有2000余年的種植史,種植地區(qū)非常廣泛[1]。綠豆皮是綠豆加工過程中的主要副產(chǎn)物,綠豆皮中含有大量的膳食纖維及各種活性成分[2-7]。但綠豆皮中纖維素的含量較高[8]、難以粉碎至口感較好的程度,導(dǎo)致綠豆皮本身的良好保健功能難以表現(xiàn),大部分綠豆皮被棄置或用于牲畜飼料[9],這大大浪費(fèi)了其價(jià)值。傳統(tǒng)的制粉方法主要采用螺桿擠壓、超微粉碎、高溫高壓等方法來破壞綠豆皮結(jié)構(gòu),但都存在需求大型設(shè)備、耗能較高、成本較高等問題。

微生物法具有能耗低、成本低廉等優(yōu)勢。且微生物本身分泌的多種酶類能夠有效破壞綠豆皮的植物細(xì)胞壁[10]。使用微生物法來改善高纖維作物加工產(chǎn)品有較好的作用。徐安民[11]使用白腐菌固態(tài)發(fā)酵麥麩中的木質(zhì)纖維素來改善小麥麩皮面條的粗糙口感,Wu等[12]使用米曲根瘤菌改善麥麩風(fēng)味的同時(shí)也增加了其淀粉消化率,裴曾薇[13]對香菇柄膳食纖維使用黑曲霉改性后持水力、持油力、葡萄糖吸附能力等理化特性均得到提升。黑曲霉作為一種常見發(fā)酵曲霉,已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,其能產(chǎn)生多種酶如纖維素酶、木聚糖酶、糖化酶等,且不產(chǎn)生真菌毒素[14]。

本研究用黑曲霉對綠豆皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,并以體積平均徑、比表面積為指標(biāo),考察制粉特性的改善,持水力、持油力、膨脹力、溶解性、膽酸鈉吸附能力、陽離子交換能力及葡萄糖吸附能力為指標(biāo),考察綠豆原皮(GY)與黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后綠豆皮(GH)的理化特性提升。采用掃描電鏡、X射線衍射及紅外光譜法考察黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對綠豆皮微觀結(jié)構(gòu)與化學(xué)鍵的影響,初步探究綠豆皮被降解的機(jī)理,以期為提高綠豆皮利用率以及擴(kuò)寬其應(yīng)用面提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與樣品

黑曲霉(Aspergillusniger),為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;綠豆皮,洛陽產(chǎn)。

1.2 試劑與設(shè)備

PDA營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂,生物試劑(BR);葡萄糖、凡士林、石蠟油、氯化鈉、溴化鉀,分析純(AR);牛膽酸鈉,化學(xué)純(CP)。

SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái),DHP9272電熱恒溫培養(yǎng)箱,YXQ-LS-50S自動(dòng)高壓滅菌鍋,T6紫外可見分光光度計(jì),BJ-150多功能粉碎機(jī),TM3030Plus臺(tái)式掃描電鏡,VERTEX70傅里葉變換中遠(yuǎn)紅外光譜儀,Xstress3000(G2)X射線衍射儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

取清洗、烘干后的綠豆皮50 g于1 L錐形瓶中,用透氣膜封口,于全自動(dòng)高壓鍋121 ℃下滅菌20 min后進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。取經(jīng)過菌種分解的綠豆皮,攤開后放入55 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干過夜。然后使用萬能粉碎機(jī)對綠豆皮進(jìn)行粉碎后過125 μm篩網(wǎng),粉碎時(shí)間為2 min。收集粉末,放置在干燥器中于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 菌種活化及種子液的制備

黑曲霉孢子懸浮液的制備:參考吳紅影等[15]的方法并稍作修改。

1.3.3 綠豆皮發(fā)酵

在接種黑曲霉孢子量2×107個(gè)、溫度36 ℃、時(shí)間7 d、料液比1∶3的條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。

1.3.4 綠豆皮制粉特性的測定

粒徑分布及比表面積測定:取相同條件粉碎后的適量綠豆皮粉于燒杯,倒入激光粒度分布儀進(jìn)行測定,物質(zhì)折射率為1.52,介質(zhì)為水,折射率為1.33。為方便描述將綠豆原皮用GY表示,黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后綠豆皮用GH表示,余同。

1.3.5 綠豆皮理化特性測定

1.3.5.1 持水力測定

參照Tian等[16]的方法并稍作修改,計(jì)算持水力。

(1)

式中:WH為綠豆皮粉的持水力/g/g;m0為干燥樣品質(zhì)量/g;m1為離心管質(zhì)量/g;m2為離心管和沉淀質(zhì)量/g。

1.3.5.2 溶解性測定

參照王萍等[17]的方法并稍作修改,計(jì)算溶解性。

(2)

式中:WS為綠豆皮粉的溶解性/%;m0為樣品質(zhì)量/g;m1為平皿質(zhì)量/g;m2為烘干后的上清液和平皿質(zhì)量/g。

1.3.5.3 膨脹力測定

參照Oluwatoyin等[18]的方法并稍作修改,計(jì)算膨脹力。

(3)

式中:PL為綠豆皮粉的膨脹力/mL/g;V1為初始體積/mL;V2為溶脹后體積/mL;m0為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5.4 持油力測定

參照Kurek[19]的方法并稍作修改,計(jì)算持油力。

(4)

式中:OH為綠豆皮粉的持油力/g/g;m2為離心管和樣品質(zhì)量/g;m1為離心管質(zhì)量/g;m0為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5.5 陽離子交換能力測定

參照Wei等[20]的方法稍作修改。

1.3.5.6 膽酸鈉吸附能力分析

膽酸鈉吸附能力測定:參照王雅琪[4]的方法稍作修改。

1.3.5.7 葡萄糖吸附能力分析

葡萄糖吸附能力測定:參照Peerajit等[21]的方法稍作修改。

1.3.6 綠豆皮降解機(jī)理研究

1.3.6.1 掃描電鏡觀測

將樣品臺(tái)放入掃描電鏡,抽真空并觀測。具體條件:加速電壓為 15 kV,模式為“Standard”,圖片掃描倍數(shù)為 80～500倍。

1.3.6.2 傅里葉紅外光譜掃描

將制得的樣品壓片在4 cm-1分辨率4 000～400 cm-1區(qū)間進(jìn)行掃描,掃描次數(shù)設(shè)置為64次,KBr做空白樣品,每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.3 XRD射線衍射表征

對經(jīng)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵綠豆皮粉和原粉分別進(jìn)行X-射線衍射檢測,具體條件:Cu 靶、管壓力為 40 kV、電流為 30 mA、掃描速率為2(°)/min、起始角:5°、終止角:90°、采樣步寬 0.05°。

1.3.6.4 綠豆皮主要組分變化

采用Van Soest 洗滌法并參考陳露露[22]的方法稍作修改進(jìn)行測定。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組樣品做3次平行實(shí)驗(yàn),取平均值,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),使用沃勒-鄧肯法進(jìn)行顯著性分析,利用Origin 2021軟件作圖,利用Design Expert 12軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對綠豆皮制粉特性的影響

GY與GH的粒徑與表面積大小如表1所示,經(jīng)過黑曲霉固態(tài)發(fā)酵,在相同粉碎條件下,綠豆皮粉的體積平均徑由391.05 μm顯著縮小到45.46 μm,減少了8.52倍。綠豆皮粉比表面積由8.51 m2/kg顯著提升至279.07 m2/kg,增加了32.46倍。這是由于固態(tài)發(fā)酵破壞了綠豆皮的結(jié)構(gòu),使其易被粉碎為粒徑更小的粉體。更小粒徑的綠豆皮粉末,會(huì)帶來更好的口感,改善綠豆皮制粉特性。

表1 綠豆皮粉的粒徑及比表面積

2.2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對綠豆皮理化特性的影響

2.2.1 水合特性

經(jīng)過黑曲霉固態(tài)發(fā)酵的綠豆皮,溶解性得到顯著提升(表2),增加了11.22倍,可能是因?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵使綠豆皮中的一些大分子長鏈的不溶性成分被降解為小分子短鏈的可溶性成分。而固態(tài)發(fā)酵后比表面積的增加,使更多小型基團(tuán)暴露,更易與水和油結(jié)合,持水力、膨脹力、持油力與陽離子交換能力得到提升,分別增加了1.07、1.03、1.20倍和1.11倍。溶解性的提升說明有更多的可溶性活性成分產(chǎn)生,而更高的持油力表明有更好的降血脂功能,陽離子交換能力的提高更有助于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[23]。

表2 綠豆皮的水合特性

2.2.2 膽酸鈉吸附能力分析

對比吸附后上清液膽酸鈉濃度可以看出,GH中膽酸鈉溶液濃度要明顯低于GY(圖1),反應(yīng)120 min時(shí)測得GY膽酸鈉質(zhì)量濃度為0.59 mg/mL,GH中膽酸鈉質(zhì)量濃度為0.34 mg/mL,吸附能力提升了1.18倍。這可能是因?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵造成比表面積增大,使得更多基團(tuán)暴露,更易于膽酸鈉結(jié)合,同時(shí)更疏松的孔隙結(jié)構(gòu)也有利于膽酸鈉的吸附。對膽酸鈉的吸附有利于膽固醇的消化,有助于提升綠豆皮的降血脂作用。

圖1 膽酸鈉濃度變化圖

2.2.3 葡萄糖吸附能力分析

在相同葡萄糖濃度下,GH相較于GY的葡萄糖吸附量更大(圖2),在200 mmol/L的葡萄糖濃度下,GH的葡萄糖吸附能力提升了1.17倍。這說明固態(tài)發(fā)酵使綠豆皮具有更好的葡萄糖吸附能力。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵后更高的可溶性膳食纖維形成膠質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將葡萄糖捕獲[24],同時(shí)更加疏松的結(jié)構(gòu)也更易吸附葡萄糖。而更強(qiáng)的降血糖能力,能夠有效預(yù)防高血糖與糖尿病等疾病[25],有助于綠豆皮應(yīng)用在保健食品中。

圖2 不同葡萄糖濃度對GY與GH吸附能力的影響

2.3 綠豆皮降解機(jī)理研究

2.3.1 掃描電鏡分析

從電鏡掃描圖可以看到(圖3),綠豆皮發(fā)酵前后發(fā)生明顯的變化,左側(cè)GY表面結(jié)構(gòu)完整均勻,僅有少量褶皺和空隙,而右側(cè)GH表面褶皺與孔隙明顯增多,并出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)。這說明黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對綠豆皮的表面結(jié)構(gòu)造成了明顯破壞,其原因可能是纖維素、半纖維素的降解造成綠豆皮變得疏松多孔,這與符旭棟[26]使用微生物發(fā)酵改性檸檬皮渣的研究結(jié)論相似。

圖3 綠豆皮的掃描電鏡圖(×500)

2.3.2 傅里葉紅外光譜掃描結(jié)果及分析

通過對綠豆皮粉紅外光譜分析可知(圖4),3 330 cm-1出現(xiàn)較寬吸收譜帶是綠豆皮纖維素與半纖維素的O—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生,2 922 cm-1附近吸收峰為糖類亞甲基中C—H伸縮振動(dòng)[27],在1 321 cm-1處的吸收峰是木質(zhì)素組分的拉伸或彎曲特征峰,1 060 cm-1的較寬吸收是纖維素和半纖維素C—O、C—C、C—O—C的拉伸。從圖4中可以看到,GH和GY的紅外光譜基本一致,但GH纖維素、半纖維素及木質(zhì)素特征峰的吸收明顯減弱,這可能是黑曲霉固態(tài)發(fā)酵能夠部分破壞纖維素、木質(zhì)素等的化學(xué)鍵,并降解纖維素木質(zhì)素等不溶性膳食纖維成分造成的。

圖4 綠豆皮的紅外光譜圖

2.3.3 XRD射線衍射表征結(jié)構(gòu)及分析

通過對綠豆皮粉的X射線衍射譜圖的分析,GY與GH出峰位置基本相同(圖5),均在掃描角度為22.62°處出現(xiàn)主衍射峰,15.00°和34.66°出現(xiàn)次衍射峰,呈現(xiàn)出典型的纖維素Ⅰ型晶體結(jié)構(gòu)[28]。但GH峰值明顯低于GY,說明黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后的綠豆皮結(jié)晶區(qū)所占面積有明顯下降。這可能是固態(tài)發(fā)酵過程中部分結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)被破壞,向非定性區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,相對結(jié)晶度下降,導(dǎo)致綠豆皮膳食纖維聚合度降低,這與劉鴻鋮等[29]的研究結(jié)果是相似的。

圖5 綠豆皮的X射線衍射圖

2.3.4 綠豆皮主要組成變化分析

根據(jù)圖6的觀察結(jié)果可知,在降解的初期階段,綠豆皮中的木質(zhì)素和半纖維素的降解速度高于纖維素,在中期階段纖維素的降解速度開始提升,半纖維素的降解速度也隨之提高。說明黑曲霉對綠豆皮成分的降解過程中,先降解包裹在纖維素上的木質(zhì)素和半纖維素,隨著酶的進(jìn)一步作用,纖維素才開始降解,而纖維素的降解又會(huì)促進(jìn)附著在其表面的半纖維素的降解。黑曲霉對綠豆皮中纖維素的降解率最高,達(dá)到57.71%;其次是半纖維素,降解率為46.00%;最低的是木質(zhì)素,降解率為43.27%。而李紅亞等[30]對玉米秸稈進(jìn)行降解,纖維素和半纖維素的降解率僅為30.5%和41.4%。這表明黑曲霉對綠豆皮有較好的降解能力,特別是對綠豆皮中含量最高的纖維素具有有效降解作用。

圖6 纖維素、半纖維素及木質(zhì)素降解率變化

3 結(jié)論

研究黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對綠豆皮特性的影響,并進(jìn)行了降解機(jī)理的探究。結(jié)果表明,在制粉特性上,經(jīng)過黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后綠豆皮的粒徑明顯下降8.53倍、比表面積顯著上升32.46倍,這將有利于綠豆皮粉的加工與利用。在理化特性上,經(jīng)過黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后綠豆皮的持水力、溶解性、膨脹力、持油力、陽離子交換能力、膽酸鈉吸附能力及葡萄糖吸附能力等均得到明顯提升。在降解機(jī)理上,主要通過電鏡掃描、紅外掃描及XRD晶體衍射進(jìn)行探究。黑曲霉對綠豆皮的降解,先降解木質(zhì)素與半纖維素,再降解纖維素。主要通過破壞纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的化學(xué)鍵,使長鏈結(jié)構(gòu)被降解為短鏈結(jié)構(gòu),破壞結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu),降低相對結(jié)晶度,并轉(zhuǎn)化纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等主要成分,進(jìn)而破壞綠豆皮結(jié)構(gòu),使其變得疏松多孔,讓綠豆皮更易被粉碎為粒徑更小、比表面積更大的粉體,具有更好的物質(zhì)交換效率,提升綠豆皮的理化特性。