荊芥和砂仁揮發油對米象熏蒸活性的協同作用及成分研究

楊悅玲, 蘇懿清, 何洋洋, 梁宗鎖, 王 芳, 梁 倩,

(西南林業大學林學院1,昆明 650224)

(浙江理工大學紹興生物醫藥研究院2,紹興 312000)

倉儲害蟲對糧食儲藏造成巨大威脅,據估計非洲國家儲存環節糧食損失率為10%～30%[1]。米象(SitophilusoryzaeLinnaeus)是重要的儲糧害蟲[2],對多種谷物及其加工品、豆類、油料、干果、藥材均可造成嚴重危害[3]。小麥感染米象后,隨著時間的推移,小麥表面覆粉明顯,千粒重下降,水分含量升高,面筋吸水量降低,品質變劣[4]。長期以來使用磷化氫作為熏蒸劑防治倉儲害蟲,但是多次反復使用存在影響公眾健康、環境安全及產生害蟲抗性等潛在問題[5,6]。植物揮發油是由不同生物活性化合物構成的小分子脂溶性物質,主要成分有單萜、倍半萜及其含氧衍生物[7],穿透能力強,可以破壞昆蟲的體壁結構,溶解蠟質層,增強了穿透、吸收、轉運和進入氣孔等的能力,提高了殺蟲效果[8]。植物揮發油有易降解,不傷害害蟲天敵等非靶標生物,對害蟲的作用方式多樣,害蟲不易產生抗藥性等優點,發展潛力巨大。

荊芥(NepetacatariaL.)為唇形科(Lamiaceae)荊芥屬(Nepeta)多年生植物[9]。荊芥揮發油具有良好的殺蟲活性,對灰翅夜蛾具有良好的熏蒸與觸殺活性[10],對埃及伊蚊、斯氏按蚊和致倦庫蚊有驅避活性[11]、對西花薊馬具有良好的產卵抑制活性及急性毒性活性[12]。砂仁(AmomumvillosumLour.)為姜科(Zingiberaceae)豆蔻屬(Amomum)植物[13]。砂仁揮發油對綠豆象熏蒸后的產卵量、孵化率、羽化率、雌性比率、發育歷期等均有明顯的抑制作用[14],對赤擬谷盜和煙草甲均具有不同程度的觸殺和驅避活性,砂仁揮發油在較高濃度時對赤擬谷盜和煙草甲具有驅避活性,隨著濃度的降低,表現出不同程度的引誘活性[15]。

植物揮發油及其主要成分的混配或作為殺蟲劑的增效劑可以提高殺蟲活性,這種協同效應可以減少殺蟲劑的用量,減少對環境的危害,也可延緩害蟲抗性的發生。Tak等[16]研究結果表明,檸檬草揮發油的主要成分檸檬醛與香葉醇乙酸酯按照質量比1∶1混配,對粉紋夜蛾三齡幼蟲的殺蟲活性最好,協同比為1.92。郝蕙玲等[17]研究結果表明,松油烯- 4-醇、桉葉油醇與松油烯-4-醇復配對醚菊酯具有協同作用。

研究基于前期對20種植物揮發油的篩選,發現荊芥揮發油對米象的熏蒸活性最好。以各揮發油的LC30為基礎進行混配,發現荊芥揮發油與砂仁揮發油混配后具有良好的協同作用。通過氣相-質譜法和化合物消除法評價了荊芥揮發油和砂仁揮發油的化學成分及確定了主要活性成分,并且通過活性化合物的混配確定其協同作用,以期為荊芥和砂仁2種植物資源的開發利用及米象的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種植物樣品經西南林業大學林學院植物學教研室戚建華副教授鑒定,樣品的種名、拉丁名、科名、采集地、采集部位見表1。

表1 植物樣品的種名、拉丁名、科名、采集地及采集部位

D-檸檬烯(純度≥99%)、異薄荷酮(純度≥98%)、胡薄荷酮(純度≥95%)、芳樟醇(純度≥98%)、冰片(純度≥96%)、(-)-4-萜品醇(純度≥98%)、石竹烯氧化物(純度≥90%)、β-蒎烯(純度≥95%)、桉葉腦(純度≥99%)、樟腦(純度≥96%)、左旋松油醇(純度≥98%)。正己烷為分析純。

1.2 儀器與設備

HP7 890A-5 975C氣相色譜-質譜聯用儀等。

1.3 方法

1.3.1 揮發油的提取

20種植物揮發油的提取參照中國藥典附錄XD中的甲法。3 L的圓底燒瓶中加入提取樣品,加入適量的水,置電熱套中,連接揮發油提取器及回流冷凝管,加熱提取5～6 h,至油量不再增加時停止加熱,得到油狀物,冷凍干燥,冷藏備用。

1.3.2 揮發油成分的測定

氣相色譜條件: HP7 890A-5 975C氣相色譜-質譜聯用儀。色譜柱:毛細管柱(30 m×0.25 mm 0.25 μm)。升溫程序:100 ℃保持2 min,以4 ℃/min升至250 ℃,保持10 min。載氣(He)流速為1.2mL/min,進樣量0.2 μL,分流比100∶1。質譜條件:離子源EI,電子能量70 eV,氣質接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃。電子倍增器電壓為1 894 V。采用wiley7 n.l標準譜庫檢索定性。通過面積歸一化法計算各化合物的相對含量。

1.3.3 米象的培養條件

供試米象蟲源由西南林業大學生物多樣性保護與利用學院昆蟲學實驗室提供。培養溫度:26～28 ℃,相對濕度:65%～75%,光照周期為光照∶黑暗=16 h∶8 h,用大米飼養,7 d 后篩去成蟲,待新一代成蟲羽化大量出現1～2周,篩出成蟲作為試蟲[18]。

1.3.4 熏蒸活性測定方法

參照Arabi等[19]和Ncibi等[20]的熏蒸方法,測定揮發油對米象的熏蒸活性。通過預實驗確定測試濃度,正己烷做溶劑。取帶蓋玻璃瓶(直徑2.5 cm,高度6.0 cm),放入10只試蟲,將直徑2.0 cm的濾紙用固體膠粘在瓶蓋里面,吸取不同濃度的揮發油溶液10 μL滴在濾紙上,揮發20 s后,擰緊瓶蓋,每組10只,重復5次,放在培養箱培養。用正己烷做對照。24 h時檢查試蟲的存活情況,記錄數據,用式(1)和式(2)計算死亡率和校正死亡率。用SPSS軟件,分析-回歸-概率計算致死中濃度LC50(mg/L)。

(1)

(2)

式中:Na為死亡蟲數;Nb為處理總蟲數;Nc為處理組死亡率;Nd為對照組死亡率。

1.3.5 荊芥揮發油與其他19種揮發油的混配

參照Abbassy等[21]和Dhinakaran等[22]的混配方法,測定荊芥揮發油與其他19種植物揮發油的協同作用。按照各自揮發油的LC30配制一系列揮發油,測試每種揮發油對米象熏蒸活性的校正死亡率及各混劑的校正死亡率,通過式(3)計算共毒性因子(CTF)。

共毒性因子=

(3)

混劑預期校正死亡率為每種揮發油實際的校正死亡率相加,當CTF≥20為協同作用,-20

1.3.6 化合物消除法評價荊芥與砂仁揮發油主要化合物對米象熏蒸活性的貢獻

參照Kim等[23]和Yeom等[24]的方法,評價荊芥和砂仁揮發油主要成分對米象熏蒸活性的貢獻。對荊芥揮發油和砂仁揮發油中成分質量分數大于3%的化合物按照其自然比例進行混配。配制荊芥揮發油一系列溶液:LC90質量濃度(26.51 mg/L)的荊芥揮發油溶液、荊芥混配油(D-檸檬烯、異薄荷酮和胡薄荷酮,混配質量比例為5.39∶18.37∶61.13)、混配油-D-檸檬烯溶液(混配油消除D-檸檬烯)、混配油-異薄荷酮溶液、混配油-胡薄荷酮溶液。配制砂仁揮發油一系列溶液:LC90質量濃度(141.92 mg/L)的砂仁揮發油溶液、砂仁混配油(β-蒎烯、桉樹腦、芳樟醇、樟腦、冰片、(-)-4-萜品醇、左旋松油醇和石竹烯氧化物按照質量比6.73∶12.56∶3.44∶4.11∶6.20∶6.23∶10.52∶8.04混配)、混配油-β-蒎烯、混配油-桉樹腦、混配油-芳樟醇、混配油-樟腦、混配油-冰片、混配油-(-)-4-萜品醇、混配油-左旋松油醇及混配油-石竹烯氧化物。每組揮發油測試10只試蟲,重復5次。

1.3.7 胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇混配對米象的熏蒸活性

參照Kim等[23]和Chen等[25]的測定方法,測試胡薄荷酮與(-)-4-萜品醇之間的相互作用。胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇按照61.13∶6.23比例及1∶1的質量比進行混配。通過式(4)和式(5)計算預期的LC50和協同比。

(4)

(5)

式中:w1為化合物E在混劑中的比例;w2為化合物F在混劑中的比例;w3為化合物G在混劑中的比例;LC50(E)為化合物E的實際LC50;LC50(F)為化合物F的實際LC50;LC50(G)為化合物G的實際LC50;R為協同比,R>1.5為協同作用,0.5

2 結果與分析

2.1 20種揮發油對米象的熏蒸活性

20種植物揮發油對米象的熏蒸活性見表2。荊芥揮發油對米象的熏蒸活性最好。茴香、灰毛蕕、肉桂、肉豆蔻對米象也具有較好的熏蒸活性,LC50均小于20.00 mg/L。艾、薄荷、細辛、迷迭香、石香薷、砂仁對米象熏蒸活性的LC50均小于50.00 mg/L。白豆蔻、望春玉蘭、八角、姜、香附子、酸橙、丁香蒲桃、清香木和木姜子的熏蒸活性較弱。

表2 20種植物揮發油對米象的熏蒸活性

2.2 荊芥揮發油與其他19種揮發油混配對米象的熏蒸活性

荊芥揮發油與其他19種揮發油混配對米象的熏蒸活性見表3。荊芥揮發油與肉豆蔻、迷迭香、石香薷、砂仁、望春玉蘭、姜、清香木揮發油混配都具有協同作用,與砂仁揮發油混配的協同作用最好。荊芥揮發油與茴香、灰毛蕕、肉桂、細辛、白豆蔻、酸橙、丁香蒲桃和木姜子揮發油混配,具有相加作用。荊芥揮發油與艾、薄荷、八角和香附子揮發油混配具有拮抗作用。

表3 20種植物揮發油二元混配對米象的熏蒸活性

2.3 荊芥和砂仁揮發油的化學成分

荊芥和砂仁揮發油的化學成分分別見表4和表5。由表4可以看出,荊芥揮發油中質量分數大于3.00%的主要成分為D-檸檬烯、異薄荷酮和胡薄荷酮,質量分數分別為5.39%、18.37%和61.13%,3種主要成分的質量分數為84.89%。

表4 荊芥揮發油的化學成分

表5 砂仁揮發油的化學成分

由表5可以看出,大于3%的主要化合物有β-蒎烯、桉樹腦、芳樟醇、樟腦、冰片、(-)-4-萜品醇(松油烯-4-醇)、左旋松油醇和石竹烯氧化物共8種化合物,總質量分數為57.83%。

2.4 荊芥與砂仁揮發油主要化合物對米象熏蒸活性的貢獻

荊芥揮發油以LC90濃度對米象熏蒸活性的校正死亡率為96.00%,混配油、混配油-D檸檬烯、混配油-異薄荷酮、混配油-胡薄荷酮的校正死亡率分別為98.00%、92.00%、94.00%、0.00%?；炫溆?胡薄荷酮的校正死亡率與荊芥揮發油、混配油、混配油-D檸檬烯、混配油-異薄荷酮的校正死亡率存在顯著差異,因此,認為胡薄荷酮是荊芥揮發油的主要活性成分。

砂仁揮發油、混配油、混配油-β-蒎烯、混配油-桉樹腦、混配油-芳樟醇、混配油-樟腦、混配油-冰片、混配油-(-)-4-萜品醇、混配油-左旋松油醇、混配油-石竹烯氧化物的校正死亡率分別為90.00%、94.00%、98.00%、96.00%、100.00%、94.00%、96.00%、70.00%、98.00%和100.00%?；炫溆?(-)-4-萜品醇與砂仁揮發油、混配油及消除其他7種化合物的校正死亡率存在顯著性差異。因此,認為(-)-4-萜品醇是砂仁對米象熏蒸活性的主要活性化合物。

2.5 胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇對米象的熏蒸活性

胡薄荷酮與(-)-4-萜品醇對米象的熏蒸活性見表6。通過化合物消除法得到的胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇活性化合物的LC50對米象的熏蒸活性明顯好于20種揮發油對米象的熏蒸活性。因此化合物消除法可以用于揮發油活性成分的篩選。

表6 胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇對米象的熏蒸活性

2.6 胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇混配對米象的熏蒸活性

胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇混配對米象的熏蒸活性見表7。胡薄荷酮與(-)-4-萜品醇按照61.13∶6.23的比例混配的協同比要優于1∶1的比例混配的協同比,按照0.5

表7 胡薄荷酮與4-萜品醇混配對米象的熏蒸活性

3 討論

對20種不同植物揮發油進行米象熏蒸活性篩選,發現荊芥揮發油明顯優于其他19種揮發油,LC50為13.27mg/L(14.27 μL/L)。荊芥揮發油的活性成分胡薄荷酮及砂仁揮發油的活性成分(-)-4-萜品醇對米象熏蒸活性LC50分別為7.34(7.57 μL/L)和8.35 mg/L(8.98 μL/L)。Lee等[26]研究結果表明18種植物揮發油中,桉樹揮發油對米象的熏蒸活性最好,1,8-桉葉素是桉樹的主要成分,也是熏蒸活性最好的化合物,LC50分別為28.9、23.5 μL/L。Moses等[27]研究結果表明八角黃皮揮發油對米象熏蒸活性LC50為17.84 μL/L。Wang等[28]研究結果表明大麗花揮發油及主要成分D-檸檬烯、4-松油醇和α-松油醇對米象熏蒸活性的LC50分別為14.10、7.92、12.03、38.22 mg/L。Kim等[29]研究結果表明香菜、蒔蘿和孜然揮發油對米象熏蒸活性的LC50分別為2.45、3.29、4.75 mg/L。從熏蒸活性可以看出,荊芥揮發油和其他揮發油相比,對米象的熏蒸活性優于大多數揮發油,但是不及香菜、蒔蘿和孜然揮發油對米象的熏蒸活性。從化學成分來看,胡薄荷酮的熏蒸活性要優于其他提到的化合物對米象的熏蒸活性。

為了評價荊芥揮發油中3種主要成分D-檸檬烯、異薄荷酮和胡薄荷酮及砂仁中8種主要成分β-蒎烯、桉樹腦、芳樟醇、樟腦、冰片、(-)-4-萜品醇、左旋松油醇和石竹烯氧化物對米象熏蒸活性的貢獻,用化合物消除法確定胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇為荊芥和砂仁揮發油熏蒸活性的主要成分。文獻報道羅勒揮發油的4種主要成分為草蒿腦、芳樟醇、α-蛇麻烯和十一酸甲酯[23],消除草蒿腦和芳樟醇時,對斜紋夜蛾三齡幼蟲的校正死亡率與羅勒揮發油、混配油、α-蛇麻烯和十一酸甲酯存在顯著性差異,說明草蒿腦和芳樟醇是羅勒揮發油對斜紋夜蛾三齡幼蟲殺蟲活性成分。橘子揮發油的6種主要成分為檸檬烯、β-蒎烯、γ-松烯、十一酸甲酯、α-蒎烯和鄰傘花烴。消除檸檬烯時,對斜紋夜蛾三齡幼蟲的校正死亡率與橘子揮發油、混配油及消除其他5種化合物存在顯著性差異,說明檸檬烯是橘子揮發油對細紋夜蛾三齡幼蟲殺蟲活性成分。芡歐鼠尾草揮發油的主要成分有14種,僅消除α-側柏酮時對甜菜夜蛾三齡幼蟲的校正死亡率與揮發油、混配油及其他13種主要成分存在顯著性差異[25]。說明α-側柏酮是芡歐鼠尾草揮發油對甜菜夜蛾三齡幼蟲殺蟲活性的主要成分?？梢钥闯龌衔锵ㄓ糜诤Y選活性化合物是行之有效的方法。

胡薄荷酮為荊芥揮發油對米象熏蒸活性的主要成分,此外胡薄荷酮還對其他害蟲具有殺蟲活性。長葉薄荷揮發油的主要成分胡薄荷酮對尖音庫蚊熏蒸活性的LC50為578.48 μL/L[30]。輪葉金雞菊揮發油的主要成分胡薄荷酮對玉米象的熏蒸活性LC50為11.81 μL/L[31]。(-)-4-萜品醇為砂仁揮發油對米象熏蒸活性的主要成分,此外(-)-4-萜品醇還具有其他殺蟲活性。如冷蒿揮發油的主要成分(-)-4-萜品醇對嗜卷書虱和赤擬谷盜具有良好的熏蒸活性,LC50分別為0.08、3.74 mg/L,對嗜卷書虱和煙草甲具有觸殺活性,LD50分別為33.10 μg/cm2、8.62 μg/頭[32]。

為了解胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇之間相互作用對米象熏蒸活性的整體貢獻,胡薄荷酮與(-)-4-萜品醇分別按照揮發油自然質量比例及1∶1的比例混配后具有相加作用?；靹┭艋钚詢炗诿糠N揮發油的熏蒸活性,按照各自揮發油自然比例混配后的熏蒸活性優于各自化合物的熏蒸活性。Kim等[23]研究了28種揮發油對斜紋夜蛾三齡幼蟲殺蟲活性的篩選,發現羅勒揮發油的殺蟲活性最好,因此用羅勒與其他27種揮發油以各自的LD25混配,羅勒揮發油與橘子揮發油混配協同作用最好。羅勒揮發油的主要活性成分草蒿腦和芳樟醇與橘子揮發油的主要成分檸檬烯按照各自揮發油的比例及1∶1的比例混配,均表現出相加作用。植物揮發油的化學成分復雜多樣,殺蟲活性取決于所含的化學成分以及化學成分的組成,研究其化合物對害蟲的協同作用,在生物防治領域具有重要意義。

4 結論

通過對20種植物揮發油的篩選,發現荊芥揮發油對米象的熏蒸活性最好,LC50為13.27 mg/mL。荊芥揮發油以LC30與其他19種揮發油的LC30混配,砂仁揮發油表現出最大的協同作用,共毒性因子為107.14。氣相-色譜法檢測荊芥與砂仁揮發油的化學成分,荊芥揮發油的主要成分為D-檸檬烯、異薄荷酮和胡薄荷酮。砂仁揮發油的主要成分為β-蒎烯、桉樹腦、芳樟醇、樟腦、冰片、(-)-4-萜品醇、左旋松油醇和石竹烯氧化物。通過化合物消除法評價荊芥揮發油和砂仁揮發油的主要活性成分分別為胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇,對米象熏蒸活性的LC50分別為7.34和8.35 mg/L,優于荊芥揮發油的熏蒸活性。胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇按照自然比例61.13∶6.13和1∶1的比例混配,LC50值分別為5.91和8.29 mg/L,協同比分別為1.26和0.94,具有相加作用。