半胱天冬酶3靶向分子影像探針在腫瘤細胞凋亡監測中的應用進展

奚鴻杰，華迪，蔡舒玥，謝佺，邱玲，林建國

1 南京醫科大學藥學院，南京 211166；2 江蘇省原子醫學研究所

惡性腫瘤是嚴重威脅我國居民健康的重大公共衛生問題之一。正常情況下，生物體內的細胞增殖和凋亡維持動態平衡狀態［1-2］。細胞增殖失控或凋亡受阻可導致惡性腫瘤的發生，而通過調控信號通路或相關蛋白表達誘導細胞凋亡是許多抗腫瘤藥物的主要作用機制之一［3-5］。然而，傳統的細胞凋亡檢測或評價方法，如TUNEL 法和腫瘤細胞形態學觀察，存在操作流程繁瑣、醫生主觀判斷差異、各種原因所致假陽性結果等局限性，有可能使患者錯過最佳治療時機［6］。因此，早期動態監測細胞凋亡對惡性腫瘤治療效果評估以及指導后續治療具有重要意義。分子影像是一種新興的無創顯像技術，能夠可視化單個分子或特定細胞亞群，從而反映活體狀態下分子水平變化。常用的分子影像技術，如近紅外熒光顯像具有靈敏度高、響應速度快的特點，正電子發射計算機斷層顯像（PET）具有靈敏度高、組織穿透力強等優點，如今已廣泛應用于生物醫學研究以及藥物研制等領域［7-8］。半胱天冬酶3（Caspase-3）是細胞凋亡的半胱天冬酶級聯反應過程中至關重要的死亡執行蛋白酶，能夠啟動細胞內蛋白的特異性降解，從而誘導細胞凋亡，是引起細胞凋亡的關鍵酶［9-10］。因此，設計靶向Caspase-3 的分子影像探針，能夠實時監測治療過程中腫瘤部位Caspase-3表達，精準評估治療效果，從而為個體化治療提供可靠依據。本文結合文獻就Caspase-3 分子影像探針在腫瘤細胞凋亡監測中的應用進展作一綜述。

1 Caspase-3分子影像探針概述

Caspase-3 是細胞凋亡的半胱天冬酶級聯反應過程中至關重要的死亡執行蛋白酶，主要由細胞應激引起的內源性途徑和細胞外信號誘導的外源性途徑激活。活化的Caspase-3可通過酶解凋亡抑制物、細胞外基質及骨架蛋白和裂解DNA 修復相關分子的方式誘導細胞凋亡［9］。因此，Caspase-3 可作為重要的分子靶點用于細胞凋亡顯像，從而實現對治療效果的實時評估。

近年已設計出許多靶向Caspase-3 的分子影像探針，根據與Caspase-3 不同的作用方式，主要分為Caspase-3 抑制劑類和Caspase-3 多肽底物類分子影像探針，見表1。Caspase-3 抑制劑類分子影像探針能夠與Caspase-3 結合，通過顯像信號改變來檢測Caspase-3 活性，如［18F］ICMT-11、［123/125I］-FITI。Caspase-3 多肽底物類分子影像探針則是基于Caspase-3特異性識別多肽底物天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸（DEVD）設計的，能夠靶向凋亡細胞并被Caspase-3 剪切而釋放顯像信號，如Bio-DEVD-HCy、［18F］CP-18。

表1 Caspase-3分子影像探針類型、結構及顯像方式

2 Caspase-3抑制劑類分子影像探針在腫瘤細胞凋亡監測中的應用

Caspase-3 抑制劑類分子影像探針具有靛紅磺胺、肽醛、N-亞硝基苯胺等基團，其結構中缺電子的羰基可與Caspase-3高親和性結合，隨后通過探針中標記的放射性核素或熒光基團進行顯像［11］，通常用于檢測治療后Caspase-3表達。

2.1 ［18F］ICMT-11 ［18F］ICMT-11是在化合物靛紅磺酰胺的結構上進行修飾，左側引入苯基醚的氟取代基團，在保持該化合物對Caspase-3高選擇性和高親和力的同時，提高其生物穩定性。隨后，在其N-1側引入1，2，3-三唑并通過2-氟乙基疊氮化物在銅催化下發生環加成反應，使用18F 進行放射性標記［12］。［18F］ICMT-11 具有較高的放射化學產率和代謝穩定性，可與高表達的Caspase-3特異性結合并顯像凋亡的腫瘤細胞。有研究在纖維肉瘤細胞和黑色素瘤細胞荷瘤小鼠中發現，［18F］ICMT-11 在體內無脫氟現象，可從心臟和未經治療的腫瘤組織中迅速清除；在分別使用順鉑和多西環素治療后，荷瘤小鼠腫瘤組織能夠觀察到清晰的PET 顯像信號，并且Caspase-3表達和對探針的攝取顯著升高［13］。與目前已應用于臨床的［18F］FDG 相比，在治療6 h 后就可通過注射［18F］ICMT-11 進行PET 顯像，觀察Caspase-3 表達，能夠較早地驗證腫瘤細胞凋亡，表明該探針在臨床檢測Caspase-3 和療效評估方面具有巨大潛力。此外，注射［18F］ICMT-11 后未觀察到明顯的不良反應［14］，表明該探針具有一定的安全性和良好的耐受性。然而，該探針肝臟和腸道的攝取較高，導致腹部具有高背景信號，并且在治療過程中可能受腫瘤組織壞死、對治療反應的異質性、Caspase-3 表達低等因素影響，導致對探針的攝取減少［15］，但該探針在無創顯像方面仍具有巨大潛力。

2.2 ［123/125I］-FITI 有研究對ICMT-11 的結構進行優化，在三唑環上引入一個碘取代基團，開發了ICMT-11 的5-碘-1，2，3-三唑衍生物FITI。在成功合成探針前體FITI 后，使用鄰菲羅啉作為螯合劑成功標記獲得［123/125I］-FITI。［123/125I］-FITI 通過引入高極性物質1，2，3-三唑類化合物，使N-烷基化取代基與Caspase-3的S1結構域發生相互作用，提高了探針與Caspase-3的親和力，從而達到更好的顯像效果［16］。

［123/125I］-FITI 的抑制常數Ki 為（6.1±0.9） nM，略低于ICMT-11［（12.4±4.7） nM］，表明該探針與底物結合較緊密，對Caspase-3的親和力較高。隨后有研究選用人結腸癌細胞SW1222 構建了荷瘤小鼠模型，給予依托泊苷誘導細胞凋亡并通過SPECT/CT顯像進行體內研究發現，注射依托泊苷的荷瘤小鼠腫瘤組織對［123/125I］-FITI 的攝取有所提高；但與［18F］ICMT-11類似，該探針在腹部攝取較高，而在腫瘤組織總攝取較低，體內降解和代謝較快，SPECT/CT顯像效果并不理想［17］。因此，提高腫瘤組織攝取和降低代謝速率是提高Caspase-3 抑制劑類分子影像探針顯像的關鍵。

3 Caspase-3多肽底物類分子影像探針在腫瘤細胞凋亡監測中的應用

Caspase-3 多肽底物類分子影像探針是基于Caspase-3 可識別四肽底物DEVD 設計的，將其與相應的顯像和修飾基團相連，能夠增強此類探針對Caspase-3 的靶向性和特異性，從而增強顯像效果［18］。此類探針進入凋亡細胞后，Caspase-3 特異性識別并切割底物序列，隨后剪切產物釋放顯像信號。相較于Caspase-3 抑制劑類分子影像探針，Caspase-3 多肽底物類分子影像探針不易受治療早期腫瘤細胞中低表達的Caspase-3影響，能夠更好地顯示細胞凋亡進程，進而指導治療效果的早期評估。

3.1 Ac-Tat-DEVD-CV Ac-Tat-DEVD-CV 是由Caspase-3 底物DEVD、細胞穿透肽及熒光基團甲酚紫組成的近紅外熒光分子探針。該探針在細胞穿透肽協助下進入腫瘤細胞后，肽-甲酚紫共軛結構在582 nm 處顯示發射峰，經Caspase-3 裂解多肽底物后，迅速釋放肽-甲酚紫共軛結構，導致582 nm 處熒光強度降低、628 nm 處熒光強度增加，從而增強可探測的熒光強度［19］。將該探針與其他內源性物質（如生物小分子、蛋白質）孵育一定時間后，不會導致熒光比率增加，表明該探針對Caspase-3具有選擇特異性。在使用星形孢菌素誘導宮頸癌HeLa 細胞凋亡后，通過Ac-Tat-DEVD-CV進行細胞顯像及光譜分析發現，經星形孢菌素處理的HeLa細胞在628 nm處出現了新的發射峰；雖然在復雜的細胞環境中，HeLa 細胞在582、628 nm 處的熒光強度均降低，但其熒光比率仍有所提升；隨著共孵育時間延長，HeLa 細胞中Caspase-3 表達和熒光比率均逐漸升高，當加入Caspase-3 抑制劑后則明顯降低［19］，二者呈現良好的相關性。因此，Ac-Tat-DEVD-CV在指示細胞凋亡程度方面展現出了優越的性能，有望在小鼠體內進一步進行顯像研究。

3.2 Bio-DEVD-HCy 靶向Caspase-3 的小分子熒光/光聲（FL/PA）雙模態探針Bio-DEVD-HCy，能夠將熒光顯像的高靈敏度與光聲顯像的高空間分辨率及高穿透性相結合，從而提供更全面的凋亡顯像信息。Bio-DEVD-HCy由靶向腫瘤的生物素、Caspase-3識別底物DEVD 及半花菁染料HCy組成。該探針可與腫瘤凋亡細胞表面高度表達的生物素受體結合，進入細胞后濃聚，被Caspase-3 識別剪切后，生成帶有游離氨基的HCy，進而發出強烈的FL/PA 信號。該探針在Caspase-3 工作緩沖液中孵育后，FL/PA 信號強度隨著Caspase-3濃度增加呈線性升高，具有較高的動力學參數，并且不易被體內物質干擾，對Caspase-3具有良好的選擇性。有研究在4T1荷瘤小鼠尾靜脈注射阿霉素（Dox），隨后注射Bio-DEVD-HCy進行顯像，結果發現，FL/PA 信號強度在注射4 h 后達到最大值，加入生物素阻斷劑后，FL/PA信號強度有所降低［20］。因此，Bio-DEVD-HCy 可通過靶向生物素更好地進入腫瘤凋亡細胞并濃聚，從而放大FL/PA 信號，可視化腫瘤細胞中Caspase-3 表達，有望在臨床上轉化應用。

3.3 ［18F］-CP18 靶向Caspase-3 的PET 顯像探針［18F］-CP18 由三部分組成，即多肽底物DEVD、用于增強腎清除能力的半乳糖基團以及用于促進細胞攝取及改善藥代動力學的C 末端聚乙二醇鏈，并通過銅催化的疊氮化物-炔烴環加成反應進行放射性核素18F 標記。當探針進入腫瘤細胞后被活化的Caspase-3裂解，聚乙二醇鏈斷裂導致其余分子的親水性降低，從而在細胞中濃聚，繼而增加信號強度［21］。該探針與21 種蛋白酶共孵育后，只有Caspase-3 能夠使其顯著裂解，表明該探針對Caspase-3具有靶向特異性。通過不同腫瘤細胞系荷瘤小鼠體內顯像研究發現，經5-氟尿嘧啶或地塞米松治療后，荷瘤小鼠的腫瘤組織對［18F］-CP18 均能顯著攝取［22］。RAPIC等［23］研究發現，結直腸癌細胞荷瘤小鼠在經5-氟尿嘧啶或伊立替康治療后，［18F］-CP18 在腫瘤部位的攝取略有升高，兩者聯合治療后腫瘤細胞Caspase-3表達上調，在腫瘤部位則顯示出更高的攝取。此外，［18F］-CP18 主要通過腎臟清除，代謝較快，腫瘤背景較低。這些研究表明，［18F］-CP18 在腫瘤治療效果監測方面具有較高的應用價值。然而，［18F］-CP18在體內血液循環時間較短，組織代謝快且易受背景干擾，無法得到持久且清晰的顯像信息。

3.4 ［18F］-C-SNAT及［18F］SF-DEVD ［18F］-C-SNAT是基于CBT-Cys 的點擊縮合反應，通過兩步法進行18F 放射性標記，得到的新型智能自組裝PET 分子探針。［18F］-C-SNAT 在進入腫瘤凋亡細胞后，多肽底物DEVD 被Caspase-3 識別并剪切，而在腫瘤微環境中存在的谷胱甘肽可將二硫鍵還原為巰基，隨后通過CBT-Cys 的點擊縮合反應進行分子內環化，環狀探針通過疏水相互作用形成納米顆粒，在腫瘤細胞中濃聚，從而延長滯留時間［24］。有研究在經Dox 治療的宮頸癌HeLa 細胞荷瘤小鼠體內PET 顯像研究中發現，［18F］-C-SNAT 能夠清晰顯像發生細胞凋亡的腫瘤部位，并且具有較高的腫瘤背景比。此外，［18F］-C-SNAT 在經抗腫瘤治療的腫瘤組織積累量顯著增加，但耗散速率改變并不明顯。有研究對CBT-Cys 的點擊縮合反應中芳香腈與氨基硫醇構效關系分析發現，芳香環上的電子離域、吸電子基團、雜原子以及氨基硫醇的親核性對點擊縮合反應均有顯著影響［25］，這為該點擊縮合反應的優化提供了思路。然而，體內高濃度內源性游離半胱氨酸易與CBT 結構中的巰基競爭性結合，從而影響該點擊縮合反應。

自組裝PET分子探針［18F］SF-DEVD是將CBT-Cys的點擊縮合反應中的環支架進行改進，引入了兩個長度適當的芐基以調節配體的長度和芳香性，形成了一個新的生物正交反應支架SF，在改善反應動力學的同時，使其更易發生分子內環化，從而提高在體內的原位自組裝效率，達到更理想的顯像效果［26］。有研究在宮頸癌HeLa 細胞荷瘤小鼠瘤內注射Dox，評估了［18F］SF-DEVD 的PET 顯像能力，結果發現，注射顯像60 min 后，該探針在荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡部位逐漸濃聚，PET顯像非常清晰；共注射冷化合物［19F］SF-DEVD 后，在腫瘤細胞凋亡部位顯示出更高的攝取和更強、更持久的放射性信號［27-28］。結果表明，［18F］SF-DEVD 可用于無創、實時、靈敏地監測體內Caspase-3活性，未來有望應用于臨床研究。

3.5 ［18F］-IR780-1 將雙模態探針與原位自組裝策略相結合，設計并合成了小分子PA/PET 探針［18F］-IR780-1。［18F］-IR780-1 以三唑IR-780 為支架，引入了CHQ，Caspase-3 可切割底物DEVD，二硫鍵保護的D-Cys 以及用于18F 標記的三氟硼酸鹽。［18F］-IR780-1 在腫瘤細胞內部濃聚形成納米顆粒，增強PET 顯像信號的同時，引起聚集熒光淬滅效應，導致FL 信號減弱、PA 信號增強。因此，該探針通過PA和PET聯合顯像，具有PA顯像的高分辨率和PET顯像的高靈敏度優點，能夠對治療期間腫瘤組織中Caspase-3 活性進行全面、準確的顯像分析。與其他Caspase-3分子影像探針相比，［18F］-IR780-1具有更高的動力學參數，并且只有Caspase-3能夠激活其PA信號，表明該探針對Caspase-3具有更高的靈敏度和選擇性。體外實驗證實，該探針在復雜的生物相關環境中表現出良好的穩定性，可用于后續小鼠體內顯像。有研究經Dox 治療建立腦膠質瘤U87MG 荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡模型，使用［18F］-IR780-1 進行雙模態顯像，結果發現，經Dox治療后荷瘤小鼠腫瘤部位對［18F］-IR780-1 具有更高的攝取，產生更強的PA 和PET 信號；當靜脈注射Caspase-3 抑制劑Z-VAD-FMK后，PA和PET信號顯著降低，表明兩者信號的增強主要是因為腫瘤細胞中Caspase-3 表達上調［29］。因此，［18F］-IR780-1 可通過放大PA 和PET 信號，顯像細胞凋亡，提供腫瘤組織Caspase-3活性和分布情況，對早期監測腫瘤治療應答具有重要意義。此外，該探針主要通過腎臟和肝臟清除，并且經Dox治療后PET信號明顯增強［30］，推測可能與Dox的毒副作用有關。因此，［18F］-IR780-1 還可用于監測藥物對器官的毒副作用。

綜上所述，分子影像是一種新興的無創顯像技術，能夠可視化單個分子或特定細胞亞群，從而反映活體狀態下分子水平變化。Caspase-3 是細胞凋亡的半胱天冬酶級聯反應過程中至關重要的死亡執行蛋白酶，能夠啟動細胞內蛋白的特異性降解，從而誘導細胞凋亡。設計靶向Caspase-3的分子影像探針，能夠實時監測治療過程中腫瘤部位Caspase-3表達，精準評估治療效果，從而為個體化治療提供可靠依據。根據與Caspase-3不同的作用方式，Caspase-3分子影像探針主要分為Caspase-3抑制劑類和Caspase-3多肽底物類分子影像探針。這兩類探針對Caspase-3均具有良好的靶向特異性和選擇性，已成功應用于實時顯像小鼠或人體治療早期的腫瘤細胞凋亡。但這些探針仍有一定不足，如靈敏度低、組織背景高、代謝速度快等，尚需進一步優化。