血清miR-33a-5p、SMAD7 水平與視網膜靜脈阻塞患者視力預后的關系

楊璐舟，王剛

巴中市中心醫院眼科，四川巴中636000

視網膜靜脈阻塞是臨床常見的一種眼底血管病，其發病率為0.3%～2.3%，僅次于糖尿病視網膜病變［1］。目前，視網膜靜脈阻塞的發病機制尚不完全清楚，其致病因素包括高眼壓、青光眼等局部因素和高血壓、糖尿病、高血脂等全身因素［2］。視網膜靜脈阻塞會導致不同程度視力障礙，部分患者治療反應較差［3］。因此，臨床一直在尋找視網膜靜脈阻塞預后的生物標志物，以便指導治療和判斷預后。微小核糖核酸（miRNA）是一類內源性非編碼單鏈小RNA 分子，可在轉錄后水平調控基因的表達，從而廣泛參與多種生物學過程，如細胞增殖、分化、凋亡等。miR-33a-5p 是miRNA 家族中的一員，定位于人22號染色體［4］。近期有研究通過高通量微陣列檢測發現，視網膜靜脈阻塞患者房水miR-33a-5p 水平顯著降低［5］。SMAD同源物7（SMAD7）基因定位于人染色體18q21.1，其編碼蛋白在調節TGF-β家族細胞因子的信號轉導中起關鍵作用［6］。而TGF-β 可通過控制細胞骨架重塑、視網膜屏障和微血管內皮間質轉化等參與視網膜靜脈阻塞的發生、發展［7］。有研究報道，miR-33a-5p 能夠靶向調控SMAD7 而參與機體多種生物學過程［8］。但血清miR-33a-5p、SMAD7 水平與視網膜靜脈阻塞患者視力預后的關系鮮見報道。本研究觀察了視網膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p、SMAD7 水平變化，并探討二者與視力預后的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年6 月—2023 年1 月巴中市中心醫院眼科收治的視網膜靜脈阻塞患者108例（觀察組）。納入標準：①符合視網膜靜脈阻塞診斷標準［9］；②單眼發病；③初診；④入院前未接受任何相關治療。排除標準：①合并其他視網膜疾病者；②合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能障礙者；③合并惡性腫瘤者；④合并自身免疫性疾病者。其中，男52 例、女56 例，年齡28～74（53.96 ± 6.76）歲，有并發癥79 例（黃斑囊樣水腫41 例、玻璃體出血19 例、視網膜新生血管15例、新生血管性青光眼4例）。同期隨機另選在巴中市中心醫院體檢健康的志愿者108 例（對照組），男53 例、女55 例，年齡26～72（52.85 ± 7.08）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經巴中市中心醫院醫學倫理委員會批準（批準文號：202009）。所有研究對象或其家屬知情同意并自愿簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-33a-5p、SMAD7檢測 觀察組入院次日、對照組體檢當日，采集清晨空腹外周靜脈血3～5 mL，待血液自然凝固后取上清，以3 000 r/min 離心10 min、離心半徑12 cm，留取上層血清，-20 ℃冰箱保存。

取部分血清，按血清總RNA 提取試劑盒說明提取血清總RNA，經紫外可見分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA 純度高且分子完整。按cDNA 第一鏈合成試劑盒說明將總RNA 逆轉錄合成為cDNA。逆轉錄條件：37 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃10 min。以cDNA 為模板，按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。miR-33a-5 上游引物5'-GCCAGTAGCACTCACCATAGCTCGC-3'、下游引物5'-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3'，內參U6 上游引物5'-GCTGGACTCTAGGGTGCAAG-3'、下游引物5'-GAGCATACCAGGTGGTAGTAG-3'。反應體系共20 μL：cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，2 ×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s 共40 個循環。所有操作在ABI 7500 Fast 實時熒光定量PCR 儀上完成。PCR擴增反應結束，繪制熔解曲線，獲取循環閾值（CT）數。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-33a-5p水平。

取剩余血清，采用Varioskan LUX 多功能酶標儀、按ELISA 法檢測血清SMAD7。所有操作嚴格按ELISA試劑盒說明進行。

1.3 治療與隨訪 所有視網膜靜脈阻塞患者予雷珠單抗0.5 mg 玻璃體腔內注射治療，每個月注射1次，連續注射3 次。治療3 個月后，評估視力?；佳圩罴殉C正視力≤0.05 為盲、＞0.05～≤0.3 為低視力［10］。患眼低視力或盲為預后不良，患眼最佳矯正視力＞0.3為預后良好。108例視網膜靜脈阻塞患者中，預后不良57例、預后良好51例。

1.4 視力預后相關的資料收集分析 收集所有視網膜靜脈阻塞患者治療前臨床資料，包括性別、年齡、BMI、發病部位，是否合并高血壓、糖尿病、高血脂和有無并發癥以及血清miR-33a-5p、SMAD7 水平等。比較視網膜靜脈阻塞患者視力預后良好者與預后不良者上述臨床資料，將有統計學差異的指標納入多因素Logistic 回歸模型，分析視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的危險因素。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0統計軟件。計量資料經正態性檢驗和方差齊性檢驗符合正態分布，以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析法。危險因素分析采用多因素Logistic回歸模型。預測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-33a-5p、SMAD7 水平比較 觀察組與對照組血清miR-33a-5p 水平分別為0.58 ±0.16、1.04 ± 0.32，血清SMAD7水平分別為（42.71 ±6.72）、（14.37 ± 3.59）ng/L。觀察組血清miR-33a-5p水平低于對照組，血清SMAD7水平高于對照組（t分別為13.362、38.657，P均＜0.01）。

2.2 視網膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p 水平與血清SMAD7 水平的關系 Pearson 相關分析顯示，視網膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p 水平與血清SMAD7水平呈負相關（r=-0.649，P＜0.05）。

2.3 視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的危險因素 視網膜靜脈阻塞患者視力預后良好者與預后不良者臨床資料比較見表1。以視網膜靜脈阻塞患者視力預后為因變量（預后不良=1，預后良好=0），以血清miR-33a-5p、SMAD7 水平以及是否合并高血壓、高血脂和有無并發癥為自變量，納入多因素Logistic 回歸模型。結果發現，血清miR-33a-5p 水平降低、血清SMAD7 水平升高和合并高血壓、高血脂以及有并發癥是視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的獨立危險因素（P均＜0.05），見表2。

表1 視網膜靜脈阻塞患者視力預后良好者與預后不良者臨床資料比較

表2 視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的多因素Logistic回歸分析結果

2.4 血清miR-33a-5p、SMAD7 水平對視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的預測效能 ROC 曲線分析顯示，血清miR-33a-5p、SMAD7 水平預測視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的曲線下面積（AUC）分別為0.870、0.869，二者聯合預測視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的AUC為0.938。血清miR-33a-5p、SMAD7 水平聯合預測視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的AUC高于二者單獨（Z分別為2.419、2.422，P均＜0.05），見表3。

表3 血清miR-33a-5p、SMAD7水平對視網膜靜脈阻塞視力預后不良的預測效能結果

3 討論

視網膜靜脈阻塞是繼糖尿病視網膜病變之后第二常見的視網膜血管疾病，發病初期癥狀不明顯，多數患者在體檢時被查出［11］。視網膜靜脈阻塞會導致不同程度視力障礙，還可引起黃斑囊樣水腫、玻璃體出血、視網膜新生血管、新生血管性青光眼等并發癥。視網膜靜脈阻塞的治療反應較差，其視力改善效果相對有限［12］。因此，臨床一直在尋找預測視網膜靜脈阻塞視力預后的生物標志物，以便指導治療和判斷預后。

miRNA 是一類內源性非編碼單鏈小RNA 分子，在血液、尿液、唾液等體液中廣泛存在，可在轉錄后水平上調控基因的表達［13］。miR-33a-5p 是miRNA家族中的一員，定位于人22 號染色體。有研究報道，miR-33a-5p能夠參與膽固醇穩態和脂肪酸/葡萄糖等代謝過程，與妊娠期糖尿病、頸動脈粥樣硬化以及多種惡性腫瘤的發生和發展密切相關［14］。LIU等［15］研究發現，原發性IgA 腎病患者血清、尿液和腎組織miR-33a-5p 水平顯著低于健康志愿者，隨著腎臟損傷程度加重，血清、尿液和腎組織miR-33a-5p水平逐漸降低。因此認為，miR-33a-5p可作為反映IgA腎病患者腎臟損傷嚴重程度的生物標志物。本研究結果發現，觀察組血清miR-33a-5p 水平顯著低于對照組；視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良者血清miR-33a-5p 水平顯著低于其預后良好者，多因素Logistic 回歸分析顯示，血清miR-33a-5p 水平降低是視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的獨立危險因素。結果提示，血清miR-33a-5p 水平降低與視網膜靜脈阻塞發生和視力預后不良密切相關，可作為預測視網膜靜脈阻塞發生和視力預后的生物標志物。

SMAD7基因定位于人染色體18q21.1，其編碼蛋白是TGF-β信號通路的主要負調節因子，與炎癥性疾病、多種惡性腫瘤的發生密切相關［16］。MONTELEONE等［17］研究發現，在壞死性小腸結腸炎、環境性腸功能障礙、難治性乳糜瀉和巨細胞病毒誘導的結腸炎組織中SMAD7 表達上調，使TGF-β1信號通路受到抑制，而敲除SMAD7 則可恢復TGF-β1信號通路的傳導功能，從而減輕腸道炎癥。已有研究證實，TGF-β1信號通路與視網膜靜脈阻塞的發生、發展密切相關［7］。本研究結果發現，觀察組血清SMAD7 水平高于對照組；視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良者血清SMAD7 水平高于其預后良好者，多因素Logistic回歸分析顯示，血清SMAD7水平升高是視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的獨立危險因素。結果提示，SMAD7 可能通過增強炎癥反應，參與視網膜靜脈阻塞的發生、發展，并可作為預測視網膜靜脈阻塞發生和視力預后的生物標志物。

有研究發現，miR-33a-5p 能夠靶向負調控SMAD7 而抑制血管平滑肌細胞增殖，有望成為心血管疾病的治療靶點［7］。本研究分析發現，視網膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p 水平與血清SMAD7 水平呈負相關，提示miR-33a-5p 可能靶向負調控SMAD7 而介導視網膜靜脈阻塞的發生。ROC 曲線分析發現，血清miR-33a-5p、SMAD7 水平聯合預測視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的AUC高于二者單獨，提示miR-33a-5p、SMAD7 可作為預測視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的血清生物標志物。有研究表明，合并高血壓、高血脂以及有并發癥是視網膜靜脈阻塞視力預后不良的危險因素［18］。本研究多因素Logistic 回歸分析亦證實，合并高血壓、高血脂和有并發癥是視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的獨立危險因素。提示密切關注視網膜靜脈阻塞患者合并癥和并發癥，以便采取針對性干預措施，能夠有效抑制視網膜靜脈阻塞的病情進展。

綜上所述，視網膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p水平降低、血清SMAD7 水平升高；血清miR-33a-5p水平降低、血清SMAD7水平升高是視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良的獨立危險因素；血清miR-33a-5p、SMAD7 水平對視網膜靜脈阻塞患者視力預后不良均有一定預測價值，二者聯合預測價值更高。但miR-33a-5p、SMAD7 參與視網膜靜脈阻塞發生、發展的具體分子機制仍不完全清楚，尚需進一步研究。