基于Fas/FasL 信號通路探索舒芬太尼對急性心肌梗死大鼠心功能和心肌細胞凋亡的影響

金成浩，元順女，樸龍一

首都醫科大學附屬北京同仁醫院麻醉科，北京100730

急性心肌梗死（AMI）是一種常見的心血管疾病，具有高發病率和高病死率的特點［1］。AMI 發生后，由于缺血、缺氧，局部心肌組織壞死，大量心肌細胞凋亡，觸發炎癥反應，促進心肌纖維化，最終導致心臟重構和心力衰竭［2］。因此，抑制或減少心肌細胞凋亡能夠阻止AMI 后的心臟重構并改善心功能。脂肪酸合成酶（Fas）/脂肪酸合成酶配體（FasL）信號通路是細胞凋亡的重要通路，抑制該信號通路激活可抑制心肌細胞凋亡［3］。舒芬太尼屬于μ型阿片受體激動劑，是一種強效的阿片類鎮痛藥，常用于心臟手術的輔助麻醉和麻醉誘導。有研究報道，舒芬太尼對心肌缺血再灌注損傷具有心臟保護作用，可縮小心肌缺血再灌注所致的心肌梗死面積［4］。但舒芬太尼是否通過調控Fas/FasL 信號通路影響心功能和心肌細胞凋亡，目前尚不清楚。2022 年10 月—2023 年6 月，本研究基于Fas/FasL 信號通路探索了舒芬太尼對AMI 大鼠心功能和心肌細胞凋亡的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD 大鼠108 只，清潔級，8 周齡，體質量（200 ± 20）g，購自中國科學院上海藥物研究所，動物生產許可證號：SCXK（滬）2020-0005。所有SD 大鼠于SPF 級動物房內分籠飼養，自由攝食和飲水。飼養環境：溫度18～26 ℃，相對濕度55%～60%，光照12 h/12 h明暗交替，正常通風。本研究經首都醫科大學附屬北京同仁醫院動物倫理委員會批準（批件號：20220401）。舒芬太尼，購自宜昌人福藥業有限責任公司。Fas shRNA 慢病毒和NC shRNA慢病毒，購自山東維真生物科技有限公司。DM IL LED 型熒光顯微鏡，購自德國Leica 公司；SuPerMax 3000FL 型多功能酶標儀，購自上海閃譜生物科技有限公司。TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；Bcl-2、Bax 一抗，購自美國CST 公司；Caspase-3 一抗，購于美國Santa Cruz Biotechnology 公司；GAPDH 一抗及辣根過氧化酶標記的二抗，購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 動物分組與干預 所有SD 大鼠適應性飼養7天，隨機分為對照組、模型組、舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組、舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組、舒芬太尼高劑量 + Fas慢病毒組，每組18只。模型組、舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組、舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組、舒芬太尼高劑量 +Fas 慢病毒組通過冠狀動脈左前降支結扎法制作AMI 模型［5］，對照組除不結扎冠狀動脈左前降支外，其余步驟與AMI 模型相同。結扎成功后，肉眼可見結扎區域以下組織蒼白或發紺，搏動減弱，心電圖出現ST 段持續抬高，即AMI 模型制作成功。舒芬太尼低劑量組和舒芬太尼高劑量組分別于AMI 模型制作成功后24 h 腹腔注射0.1、1 μg/kg舒芬太尼［6］。舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組和舒芬太尼高劑量 + Fas 慢病毒組分別于AMI 模型制作成功后24 h 腹腔注射1 μg/kg 舒芬太尼和尾靜脈注射200 nmol/kg NC shRNA 慢病毒或Fas shRNA 慢病毒。對照組和模型組均腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 血清肌鈣蛋白T 檢測 術后72 h，采集大鼠尾靜脈血1 mL，2 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清，采用ELISA 法檢測血清肌鈣蛋白T。

1.4 心功能檢測 術后72 h，采用超聲心動圖檢測大鼠在3 個連續心動周期中左心室射血分數（LVEF）、左心室縮短分數（LVFS）、左心室舒張末期內徑（LVEDd）和左心室收縮末期內徑（LVESd）。

1.5 血清TNF-α、IL-6 檢測 待大鼠心功能檢測完成后，腹主動脈取血，2 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清。采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6。

1.6 心肌梗死面積檢測 待大鼠采血結束，斷頭處死，留取心臟。隨機選擇6 只大鼠的心臟組織，常規固定、包埋、切片。將切片置于2% TTC 溶液中，37 ℃染色30 min，4%多聚甲醛固定后拍照。采用Image J 軟件分析心肌梗死面積和整個心肌橫斷面面積，計算心肌梗死部分占心肌橫斷面面積的百分比。

1.7 心肌組織病理形態觀察 隨機選擇6 只大鼠的心臟組織，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，HE 染色，脫水、透明，中性樹膠封固。光學顯微鏡下觀察心肌組織病理形態變化。

1.8 細胞凋亡檢測 取上述石蠟切片，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，漂洗后加入蛋白酶K 工作液，再次漂洗后加入TUNEL 檢測液50 μL，37 ℃避光孵育1 h。然后滴加DAPI 避光染核10 min，封片液封片。熒光顯微鏡下拍照計數，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=TUNEL 陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.9 細胞凋亡及Fas/FasL 信號通路相關蛋白表達檢測 取剩余6 只大鼠的心臟組織，液氮下研磨成粉末，加入預冷的RIPA 裂解液冰上裂解，提取組織總蛋白，經BCA 法蛋白定量合格。加入1 × 蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴充分變性。取部分變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas、FasL、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。ECL 發光，暗室內曝光、顯影、定影。凝膠成像系統成像，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.10 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。正態分布的計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌損傷程度和心功能比較 見表1。

表1 各組血清肌鈣蛋白T水平以及LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd比較（± s）

表1 各組血清肌鈣蛋白T水平以及LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與舒芬太尼低劑量組比較，△P＜0.05；與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，▲P＜0.05。

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2.2 各組血清TNF- α、IL-6 水平比較 見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，± s）

表2 各組血清TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與舒芬太尼低劑量組比較，△P＜0.05；與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，▲P＜0.05。

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2.3 各組心肌梗死面積占比比較 對照組、模型組、舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組、舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組、舒芬太尼高劑量 + Fas慢病毒組心肌梗死面積占比分別為0、（32.54 ±3.26）%、（23.58 ± 2.41）%、（8.63 ± 0.86）%、（9.14 ±0.91）%、（27.66 ± 2.77）%。與對照組比較，模型組心肌梗死面積增大（P＜0.05）。與模型組比較，舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組心肌梗死面積減小，并且以舒芬太尼高劑量組心肌梗死面積減小較為明顯（P均＜0.05）。與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，舒芬太尼高劑量 + Fas慢病毒組心肌梗死面積增大（P＜0.05）。

2.4 各組心肌組織病理形態觀察 對照組心肌細胞形態規則，心肌纖維排列整齊，無明顯水腫和炎性細胞浸潤。與對照組比較，模型組心肌細胞形態模糊、紋理消失、排列紊亂、心肌間小血管擴張、細胞數量減少，可見大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，舒芬太尼低劑量組和舒芬太尼高劑量組心肌細胞形態、紋理、排列、血管擴張、細胞數量及炎性細胞浸潤顯著改善，并且以舒芬太尼高劑量組改善較為明顯。舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組心肌細胞形態相對規則，心肌纖維排列相對整齊，水腫和炎性細胞浸潤較輕。與舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組比較，舒芬太尼高劑量 + Fas 慢病毒組心肌細胞形態模糊、紋理消失、排列紊亂、心肌間小血管擴張、細胞數量減少，炎性細胞浸潤明顯。

2.5 各組心肌細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白表達比較 見表3。

表3 各組心肌細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白表達比較（± s）

表3 各組心肌細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白表達比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與舒芬太尼低劑量組比較，△P＜0.05；與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，▲P＜0.05。

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2.6 各組心肌細胞Fas/FasL 信號通路相關蛋白表達比較 見表4。

表4 各組心肌細胞Fas、FasL蛋白相對表達量比較（± s）

表4 各組心肌細胞Fas、FasL蛋白相對表達量比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與舒芬太尼低劑量組比較，△P＜0.05；與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，▲P＜0.05。

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3 討論

AMI 是一種臨床常見的心血管疾病，在世界范圍內具有高發病率和高病死率的特點。AMI的主要表現為心肌大面積壞死、心肌收縮力減弱，從而導致供血不足及其他惡性并發癥的發生。盡管人們在開發新型心臟保護劑方面付出了巨大努力，但成果并不理想，迫切需要闡明AMI 的分子機制，以開發新的治療策略。

AMI發生后，心臟的泵血功能會受到影響，主要原因為心肌細胞缺血缺氧而發生壞死，導致心肌收縮力減弱，心臟射血功能降低，進而影響全身血液供應。肌鈣蛋白T是AMI發生后心肌損傷的生物標志物。LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd 主要反映心臟的收縮和舒張功能。有研究報道，在連續心動周期中，若出現LVEF、LVFS降低，LVEDd、LVESd升高，則提示大鼠心功能出現異常［7］。本研究結果發現，AMI大鼠血清肌鈣蛋白T 水平升高，LVEF、LVFS 降低，LVEDd、LVESd 升高，與既往的研究［7］結果一致，表明AMI 大鼠出現了心功能損傷。AMI 發生后，先天免疫反應被激活，大量炎性細胞因子被釋放，過度炎癥反應會導致心肌形成大量瘢痕組織和纖維化，引起心室重塑，最終影響心功能。其中，TNF-α、IL-6參與炎癥反應，并在AMI 發生后水平升高。有研究報道，大鼠AMI 發生后心肌細胞中TNF-α、IL-6 含量升高，抑制TNF-α、IL-6 則可對AMI 大鼠的心肌細胞起到保護作用［8］。此外，過度的炎癥反應會引起心肌細胞凋亡，而心肌細胞是不可再生細胞，過度凋亡會被纖維組織及成纖維細胞取代，從而破壞心肌的結構和功能。有研究報道，抑制AMI 大鼠心肌細胞凋亡能夠顯著改善心功能，阻止心肌損傷［9］。細胞凋亡過程受多種基因的共同調控，Bax 是促進凋亡基因，Bcl-2 是抑制凋亡基因［10］。Caspases 家族在細胞凋亡過程中發揮重要作用，Caspase-3 是Caspase級聯反應下游最關鍵的促凋亡蛋白，是凋亡的關鍵執行分子［11］。有研究顯示，促進Bcl-2 表達、抑制Bax 表達能夠在一定程度上減輕心肌細胞凋亡，有助于改善左心室功能以及減輕心室重塑［12］。本研究結果顯示，模型組血清TNF-α、IL-6 水平和心肌細胞凋亡率以及Bax、Caspase-3 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調，提示AMI 發生后可引起炎癥反應和心肌細胞凋亡。

阿片類麻醉劑在AMI 動物模型中具有心肌保護作用，不僅能緩解心肌梗死癥狀、減少心肌梗死面積、減輕心肌缺血損傷，還能改善心臟微循環障礙，促進心功能恢復。舒芬太尼是一種在心血管手術中廣泛應用的新型μ型阿片受體激動劑，具有良好的鎮痛效果。此外，舒芬太尼的血流動力學穩定，可發揮心臟保護作用［13］。據報道，舒芬太尼可抑制缺氧復氧誘導的H9C2 細胞凋亡和自噬［14］。舒芬太尼能夠提高缺血再灌注心肌細胞的增殖活性，降低細胞凋亡率［15］。本研究結果顯示，舒芬太尼可降低AMI大鼠血清肌鈣蛋白T 水平，升高LVEF、LVFS，降低LVEDd、LVESd和心肌梗死面積，表明舒芬太尼能夠改善AMI大鼠心功能。此外，舒芬太尼干預后，AMI大鼠血清TNF-α、IL-6 水平和心肌細胞凋亡率以及Bax、Caspase-3 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高，提示舒芬太尼可抑制AMI 大鼠心肌炎癥反應和心肌細胞凋亡，具有心臟保護作用。

Fas/FasL信號通路是介導細胞凋亡的一條重要途徑，該信號通路可促進炎性細胞因子分泌，激發炎癥反應，從而參與免疫逃逸、腫瘤形成和轉移等過程［16］。Fas 是一種典型的死亡受體，而FasL 是結合Fas 的Ⅱ型膜蛋白，兩者均屬于腫瘤壞死因子家族。Fas 與FasL 的相互作用可導致pro-Caspase-8 裂解激活Caspase-8，再通過介導的Caspase 級聯反應激活Caspase-3，從而誘導細胞凋亡。FasL 介導的細胞凋亡與多種病理生理過程密切相關。AMI 發生后，心肌細胞因缺血缺氧而壞死，這可能觸發了Fas/FasL信號通路的激活，一旦Fas與FasL 結合，它們將啟動凋亡信號的傳導，進一步加劇心肌細胞凋亡。此外，細胞凋亡還能影響心肌細胞的修復和再生，從而影響心臟的結構和功能。據報道，正常心肌組織Fas、FasL蛋白表達較低，AMI 發生后其表達明顯上升，抑制Fas、FasL 蛋白表達，可減少Caspase-8、Caspase-3活化［17］。另有研究報道，下調Fas、FasL 表達可減輕炎癥反應，抑制心肌細胞凋亡，改善左心室重塑［18］。本研究結果顯示，Fas、FasL 在模型組心肌組織中高表達，舒芬太尼可顯著下調Fas、FasL 表達，抑制心肌細胞凋亡。Fas 慢病毒轉染可逆轉舒芬太尼對AMI大鼠心肌細胞凋亡的保護作用。提示舒芬太尼可能通過下調Fas、FasL 表達而抑制AMI 大鼠心肌細胞凋亡。

綜上所述，舒芬太尼可改善AMI 大鼠心功能，抑制心肌細胞凋亡，并且1 μg/kg 舒芬太尼的作用效果要優于0.1 μg/kg 舒芬太尼；抑制Fas/FasL 信號通路激活可能是舒芬太尼改善AMI 大鼠心功能的作用機制之一。但舒芬太尼調控Fas/FasL 信號通路的具體分子機制仍不十分清楚，尚需進一步研究。