Ⅱ型鵝星狀病毒VP27 蛋白生物信息學分析

蔣欣芫，吳曉艷，曹 章，趙 靜，張 旭，于天浩，張彥龍

（東北林業大學野生動物與自然保護地學院，黑龍江哈爾濱 150040）

鵝星狀病毒（goose astrovirus，GAstV）屬于星狀病毒科成員，是一種無囊膜、單股正鏈RNA病毒。雛鵝對GAstV 易感，感染后心包、肝、腎等內臟以及關節出現尿酸鹽沉積等癥狀，發病率和病死率均高達50%以上[1]。GAstV 給我國養鵝業帶來了嚴重經濟損失。根據全序列核苷酸多樣性，GAstV 可分為兩個基因群，即GAstV-Ⅰ和GAstV- Ⅱ， 其中GAstV- Ⅱ發病率遠高于GAstV-Ⅰ[2]。GAstV 基因組長度約為7.2 kb，包含1個5'非翻譯區（UTR）、3個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b 和ORF2）、1 個3' UTR 和1 個多聚腺苷酸（Poly A）尾。ORF2 基因編碼的衣殼蛋白由704個氨基酸構成，包括4 個功能域：S、P1、P2 和酸性C 末端結構域。其中，第425～665 位氨基酸屬于P2 結構域，其編碼的VP27 蛋白，又稱刺突蛋白，位于病毒結構表面[3]。已有研究[4-5]表明，刺突蛋白參與細胞表面相關受體的識別及機體的免疫應答，可誘導機體產生中和抗體，是GAstV 的主要保護性抗原蛋白。

自第一例GAstV感染病例在我國被報道以來，該病已傳播至我國各省份，并持續蔓延[6]。由于目前針對GAstV 各蛋白結構、功能和作用機制的研究有限，并且GAstV 具有傳播速度快、突變率高和容易重組的特點，因此尚未研發出針對該病毒安全高效的商品化疫苗。本研究通過生物信息學方法對具有良好免疫原性GAstV-Ⅱ ZYL02 株的VP27蛋白結構與功能進行分析，進一步對其B 細胞抗原表位進行預測，以期為GAstV-Ⅱ疫苗研發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 毒株序列

GAstV-Ⅱ ZYL02 株，由東北林業大學野生動物與自然保護地學院分離并保存，經測序獲得了其基因組序列（GenBank 登錄號OM811460）。該毒株ORF2 基因編碼704 個氨基酸，其中VP27 蛋白的氨基酸序列位于第425～665 位。ZYL02 株VP27基因開放閱讀框推導的氨基酸序列：QVTPSLVYNFQGERQSTTESCSFLVFGIPQADSRSRYNANITFNVGYRGRTSTSFTLGTHNWWAVMTLSQTGVIFAPPAVGTGVCNTLATAIQHLNPELETAVLRVNTSTTSTGGQITELRNRLNIADGDYVISMGDPQGNRSALYFRNSDQKWVWLWAGDSNPGETFQSFKMPVLINWSVSDSQEQYNARVRMVQYANAQQQTLTDPEEDDDPLSDVTSLFDPTAEDETDFHLAVSLKTS。

1.2 方法

1.2.1 VP27 蛋白主要理化特性分析 利用Expasy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在線軟件，分析ZYL02 株VP27 蛋白氨基酸組成、等電點、原子組成及親疏水性等理化性質。

1.2.2 VP27 蛋白亞細胞定位、跨膜結構域、信號肽分析 利用PSORT II Prediction 在線軟件（http://psort.hgc.jp/form2.html），在線分析VP27 蛋白亞細胞定位；利用ProtScale 在線軟件（https://web.expasy.org/protscale/），預測目標蛋白的親疏水性；運 用SignalP 4.1（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM 2.0在線軟件（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）， 分別預測VP27 蛋白是否含有信號肽和跨膜結構域。

1.2.3 VP27 蛋白二、三級結構預測 利用SOPMA 在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html），預測VP27 蛋白二級結構特征，計算其所含的α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲及擴展鏈的數目與百分比；采用Phyer2 在線軟件（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index），建模并預測VP27 蛋白三級結構。

1.2.4 B 細胞表位預測及可視化 運用BepiPred-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/BepiPred-2.0/）和ABCpred（http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/）兩個在線軟件綜合預測潛在B 細胞抗原表位，其中ABCpred 預測肽長度選擇20 aa，閾值設為0.5。將上述預測得到的潛在B 細胞抗原表位通過ToxinPred2（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred2/）、VaxiJen v2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）和IEDB（http://tools.iedb.org/main/）等在線軟件分別進行毒性、抗原性、β-轉角、表面可及性、靈活性和疏水性分析，以期篩選出優勢B 細胞抗原表位，然后使用PyMOL 軟件可視化優勢B 細胞抗原表位。

2 結果與分析

2.1 VP27 蛋白理化性質分析

利用ProtParam 在線軟件對ZYL02 株VP27蛋白進行理化性質分析。結果顯示：該蛋白由20種241 個氨基酸組成，其中Thr 占比最高（10.8%），Cys 占比最低（0.8%）；帶正電荷殘基數（Arg+Lys）共15 個，帶負電荷殘基數（Asp+Glu）共26 個（表1）。蛋白分子式為C1173H1794N324O382S6，分子質量為26.739 45 kDa，理論等電點為4.59，不穩定指數為41.8，脂肪指數為70.37，平均疏水性（GRAVY）為-0.418。根據ProtParam 軟件“不穩定指數大于40 為不穩定蛋白，小于40 為穩定蛋白，GRAVY值在-2～2 范圍內屬于親水性蛋白”的規定，判定VP27 為不穩定的親水蛋白。

表1 ZYL02 株VP27 蛋白氨基酸組成

2.2 VP27 蛋白親疏水性、亞細胞定位、跨膜區及信號肽預測

利用ProtScale 對ZYL02 株VP27 蛋白親疏水性的預測結果（圖1）顯示：該蛋白多肽鏈中第24位氨基酸處疏水值最大，為2.067，第210 位氨基酸處疏水值最小，為-2.767，整條多肽鏈中親水氨基酸殘基數量多于疏水氨基酸殘基。因此，綜合分析VP27 為親水性蛋白，與2.1 中預測結果一致。TMHMM Server v 2.0 和SignalP 4.1 在線軟件預測結果（圖2～3）顯示，VP27 蛋白無跨膜區和信號肽。利用PSORT II Prediction 在線軟件分析VP27蛋白亞細胞定位的結果顯示，其定位于細胞質、細胞核、線粒體以及過氧化物酶體中的可能性分別為69.6%、17.4%、8.7%以及4.3%，即VP27 蛋白定位于細胞質的概率最高。

圖3 ZYL02 株VP27 蛋白信號肽預測結果

2.3 VP27 蛋白二級、三級結構預測

利用SOPMA 在線軟件對ZYL02 株VP27 蛋白二級結構的預測結果（圖4）顯示：VP27 蛋白中101 個氨基酸組成無規卷曲（random coil，Cc），占總氨基酸的41.91%；70 個氨基酸構成延伸鏈（extended strand，Be），約占總氨基酸的29.05%；54 個氨基酸構成α 螺旋（alpha helix，Hh），約占總氨基酸的22.41%；16 個氨基酸構成β 轉角（beta turn，Tt），約占總氨基酸的6.64%。結果表明，VP27 蛋白二級結構的主要構成為無規卷曲，其次是延伸鏈。進一步通過Pyhre 在線軟件以PDB ID 3ts3 為模板進行VP27 蛋白同源建模，預測的模型覆蓋率為79%，置信度為100%。使用PyMOL 軟件對該模型進行了可視化，并對α 螺旋、β 折疊和無規卷曲進行了標記，具體結果見圖5。

圖4 ZYL02 株VP27 蛋白二級結構預測結果

圖5 ZYL02 株VP27 蛋白三級結構的可視化模型

2.4 B 細胞表位預測與表位的三維空間位置分析

為更好地評價由BepiPred-2.0 和ABCpred 在線軟件預測獲得的26 條VP27 蛋白B 細胞表位（表2），利用IEDB 在線軟件從抗原性、β-轉角結構、表面可及性、柔韌性和親水性5 個方面進行預測，分別選取得分前10 位的氨基酸序列（表3），再結合VP27 蛋白的二級結構，以及ToxinPred2 和VaxiJen v2 在線軟件的預測結果綜合分析，共篩選出4 條優勢抗原表位（表2），分別位于26～41 aa（FGIPQADSRSRYNANI）、48～57 aa（RGRTSTSFTL）、111～126 aa（TSTGGQITELRNRLNI）、174～189 aa（PVLINWSVSDSQEQYN）。這些表位具有無毒性，抗原性強，處于β-轉角，表面可及性大和親水性高等特點。隨后，利用PyMOL 軟件將預測的4條優勢抗原表位在三級結構模型中進行可視化（圖6），從而獲得各優勢B 細胞抗原表位的相對位置。

圖6 ZYL02 株VP27 蛋白優勢抗原表位空間結構

表3 ZYL02 株VP27 蛋白IEDB 預測結果

3 討論

自2017 年Zhang 等[7]首次分離到GAstV 以來，我國各養鵝地區均有關于該病毒的報道。因GAstV毒株具有突變率高、容易重組等特點，其感染防控工作面臨較大挑戰?，F階段，人們對GAstV 主要抗原蛋白的結構、功能及其與宿主的作用機制認識有限[7]。本研究利用生物信息學軟件解析了ZYL02 株VP27 蛋白，旨在探究VP27 蛋白中可作為潛在疫苗的肽段，不僅節省了試驗時間和成本，更為制備安全高效的疫苗打下了堅實基礎[8-9]。

VP27 蛋白是構成星狀病毒刺突的部分，具有誘導中和抗體的功能[10]，且本實驗室保存毒株ZYL02 具有良好的免疫原性[11]。GAstV-Ⅱ ZYL02株VP27 蛋白分析結果顯示，該蛋白由241 個氨基酸組成，理論等電點為4.59，不穩定系數為41.8，GRAVY 值為-0.418，因此推測VP27 是不穩定的親水蛋白，這可為病毒蛋白的分離純化試驗提供先驗信息。亞細胞定位結果顯示，該蛋白主要定位于細胞質，無跨膜結構域和信號肽，推測其可能為非分泌型蛋白，提示真核細胞、大腸桿菌、昆蟲細胞-桿狀病毒等多種表達系統都可用于該蛋白的高效表達。二級和三級結構預測結果顯示，無規卷曲占比最高（41.91%）。因無規卷曲相對松散且易發生扭曲盤旋，多突出在蛋白質表面，有利于與抗體結合，所以該結構特點提示VP27 蛋白產生抗原決定簇區域的概率較高[12]。Phyer2 在線軟件以PDB ID 3ts3 為模板構建VP27 蛋白模型，預測的模型覆蓋率為75%，置信度達100%，說明構建的模型質量較好，結構合理可靠。建模結果顯示，該蛋白是由β 鏈緊密堆積形成的疏水核和α-螺旋及無規卷曲圍繞在外側構成，與其他禽星狀病毒結構相似[13]，為后文B 細胞抗原表位預測提供了支撐。B 細胞介導體液免疫和細胞免疫，具有識別多種抗原的作用，因此對B 細胞抗原表位的預測極其重要[14]。在對B 細胞抗原表位的預測中，通過BepiPred-2.0 和ABCpred 在線軟件共預測出26 條抗原表位。本研究根據不同分析方法，將二級結構為無規卷曲和β-轉角的區域，與抗原性強、無毒性和表面可及性大的區域結合分析，綜合得分高的重疊肽段作為篩選抗原表位的優先選項，最終篩選出4 條優勢B 細胞抗原表位，分別位于48～57 aa（RGRTSTSFTL）、26～41 aa（FGIPQADSRSRYNANI）、111～126 aa（TSTGGQITELRNRLNI）、174～189 aa（PVLINWSVSDSQEQYN），優勢B 細胞抗原表位具有更高誘導機體相關免疫應答的概率，可供疫苗設計與研究。已有研究[15]表明，B 淋巴細胞受體（BCR）能識別構象表位和線性表位，且識別位置通常處于抗原分子表面。在三維結構中，利用PyMOL 軟件對篩選出的4 條優勢表位進行定位，發現4 條優勢表位均處于VP27 蛋白的頂端表面突出部分，進一步證實了預測的準確可靠。

綜上所述，本研究利用生物信息學軟件對GAstV-II ZYL02 株VP27 蛋白的特性、結構進行了較為全面系統的分析，并且篩選出4 條基于潛在表位之上的優勢抗原表位，為了解VP27 蛋白的生物學功能以及對GAstV 潛在免疫靶點的研究提供了理論及數據依據，也為研制優質高效的GAstV 疫苗奠定了基礎。