鴿腺病毒通用型實時熒光PCR檢測方法的建立與應用

陳 璐，朱明慧，丁 雨，李 陽，亓麗紅，房立春，蔣文明，6，王靜靜，6，劉華雷，李建亮，于曉慧，6

（1. 山東農業大學，山東泰安 271018；2. 中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；3. 青島農業大學，山東青島 266109；4. 寧夏大學，寧夏銀川 750021；5. 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東濟南 250199；6. 農業農村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032）

禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）為雙股線性DNA 病毒，無囊膜，病毒直徑為70～90 nm，病毒粒子呈二十面體對稱，主要的衣殼蛋白是六鄰體蛋白（Hexon）、五鄰體蛋白（Penton）和纖維蛋白（Fiber）[1-2]。國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將禽腺病毒屬（Aviadenovirus）分為14 個種：禽腺病毒A—E種、鴨腺病毒B種、鴿腺病毒A種（PiAdV-A）、鴿腺病毒B 種（PiAdV-B）[4]、鵝腺病毒A 種、火雞腺病毒B—D 種、鸚鵡腺病毒B 種和獵鷹腺病毒B 種[3]。

鴿腺病毒（pigeon adenovirus，PiAdV）是鴿群中最常見的一種病原體。PiAdV 分為PiAdV-A和PiAdV-B 兩個種。PiAdV-A 種病毒主要引起鴿肝組織彌漫性壞死或突然死亡，病鴿死亡率為10%～13%。該病毒多感染5～6 月齡信鴿，使其采食量下降，比賽成績受影響[5-7]；但其在肉鴿場擴散速度較慢，持續時間長，患病肉鴿常體質量減輕，病程長達3 個月，可突然出現死亡，累積病死率約15%。PiAdV-B 種病毒主要對1 歲齡以下的雛鴿影響較為嚴重，導致雛鴿生長停滯，出現嘔吐、腹瀉、厭食等，偶爾死亡[8]。PiAdV 給我國信鴿和肉鴿養殖業造成了嚴重經濟損失[9]。

對于PiAdV 的診斷主要依靠實驗室檢測。目前，關于PiAdV 檢測方法的研究較少，且并無適用于PiAdV-A 種和PiAdV-B 種病毒的通用型檢測方法。因此，亟需建立能夠同時檢測兩種PiAdV的通用型高通量檢測方法以用于臨床快速診斷。本研究建立了一種特異性強、敏感性高的PiAdV 通用型實時熒光PCR 檢測方法，以期為PiAdV 感染的臨床快速診斷提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸和臨床樣品

1.1.1 病毒核酸 禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）、 新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、鴿冠狀病毒（pigeon coronavirus，PiCoV）、鴿輪狀病毒（pigeon rotavirus，RVA）、PiAdV、鴿圓環病毒（pigeon circovirus，PiCV）和鴿皰疹病毒（pigeon herpesvirus，PiHV）核酸，均由中國動物衛生與流行病學中心禽病監測室保存。

1.1.2 臨床樣品 20 份鴿臨床樣品來自于山東省某鴿棚，由中國動物衛生與流行病學中心禽病監測室保存。

1.2 主要試劑

Fine pure 病毒DNA/RNA 柱式提取試劑盒（離心柱型），購自GENFINE 公司；PrimerTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye）、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0，購自TaKaRa 公司；ProTaqHS 預混型探針法qPCR 試劑盒Ⅲ，購自艾科瑞公司；pEASY-T5 Zero Cloning Kit， 購自TRAN 公司；TIANprep Mini Plasmid Kit，購自TIANGEN 公司。

1.3 樣品處理

剖檢病死鴿，取適量肝臟、脾臟等組織于潔凈的2.0 mL 離心管內；按體積比1:3 加入PBS 及滅菌小鋼珠，置于組織研磨機內充分研磨；反復凍融3 次后，10 000 r/min 離心5 min，收取上清，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 核酸提取

按照Fine pure 病毒DNA/RNA 柱式提取試劑盒（離心柱型）說明書，進行病毒核酸提取，將提取的核酸立即用于PCR 擴增或者于-20 ℃保存。

1.5 引物、探針設計與合成

參考GenBank 中已公布的PiAdV-A 種（GenBank 登錄號NC024474.1、MW286325.1）和PiAdV-B 種（GenBank 登錄號KX673408.1、NC031503.1）病毒pVIII基因序列的共同保守區域，利用Primer express 分析軟件，設計通用型特異性引物和TaqMan 探針（表1），引物與探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 實時熒光PCR 引物和探針信息

1.6 陽性質粒標準品制備

以PiAdV 核酸為模板，利用表1 中PiAdV-F和PiAdV-R 引物進行PCR 擴增，將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；利用TaKaRa 膠回收試劑盒對PCR 產物進行純化回收，并克隆至pEASY-T5 載體，轉化到Trans-109 感受態細胞中，構建重組質粒，測序鑒定無誤后提取細菌質粒。

1.7 標準品質量濃度測定與拷貝數計算

1.7.1 濃度測定 對重組質粒標準品分別進行10、100 倍稀釋后，利用Nano Drop 核酸定量儀分別測量其質量濃度，若質量濃度呈10 倍梯度則測量準確。

1.7.2 拷貝數計算 拷貝數（copies/μL） =（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA length×660）。

1.8 實時熒光PCR 反應體系優化

以重組質粒標準品為模板，按照艾科瑞熒光PCR 試劑盒的說明書配置反應體系，并在此基礎上完成反應體系和退火溫度優化。

1.8.1 探針濃度優化 固定反應體系中引物終濃度不變，分別加入終濃度為0.15、0.20、0.25、0.30 μmol/L 的探針進行試驗，根據實時熒光PCR檢測的Ct 值確定最優探針濃度。

1.8.2 退火溫度優化 將退火溫度分別設置為57、58、59、60 ℃進行試驗，每個溫度做3 個重復，通過比較不同退火溫度下的Ct 值結果確定最佳退火溫度。

1.9 標準曲線建立

將陽性質粒標準品進行10 倍倍比稀釋，選取5 個梯度，進行實時熒光PCR 試驗。以獲得的Ct值為Y 軸，重組質粒標準品拷貝數濃度為X 軸，繪制標準曲線。

1.10 特異性試驗

以鴿群常見的AIV、NDV、PiCoV、RVA、PiCV、PiHV 等病毒DNA 或cDNA 為模板，進行實時熒光PCR 擴增，評價該方法的特異性。

1.11 敏感性試驗

將PiAdV 標準品進行10 倍倍比稀釋，取選不同的稀釋度進行實時熒光PCR 擴增，每個稀釋度做3 份重復。同時利用常規PCR 檢測引物[10-11]，對上述模板進行常規PCR 擴增及瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.12 重復性試驗

選取5 個濃度梯度的陽性質粒標準品，用同批次配置的實時熒光PCR 反應體系進行檢測，重復3 次，計算組內重復變異系數（CV）；再用不同批次配置的實時熒光PCR 反應體系進行檢測，重復3 次，計算組間重復CV 值。Ct 值以平均數±方差（X±SD）的形式表示。

1.13 臨床樣品檢測

利用本研究建立的PiAdV 實時熒光PCR 檢測方法，對20 份鴿臨床樣品進行檢測，并與臨床上常用的常規PCR方法檢測結果及測序結果比較分析。

2 結果

2.1 陽性質粒標準品制備

以PiAdV 核酸為模板，對目的片段進行PCR 擴增（圖1），擴增產物經純化回收后克隆至pEASY-T5 載體，構建了陽性質粒標準品p-PiAdV，經PCR 鑒定結果正確。利用公式計算dsDNA 標準品的拷貝數濃度為5.69×1011copies/μL。

M. DL 2 000 DNA Marker；1. 目的片段；N. 陰性對照。圖1 PiAdV 目的片段擴增結果

2.2 實時熒光PCR 反應體系優化與建立

2.2.1 探針濃度優化 保持其他反應體系不變，以陽性質粒標準品p-PiAdV 為模板，通過使用不同終濃度的探針進行熒光PCR。結果（圖2）顯示，0.15 μmol/L 探針的檢測下限為5.69×102copies/μL，0.20～0.30 μmol/L 探針的檢測下限均為5.69×101copies/μL，故探針濃度選擇0.20 μmol/L。

A—D. 探針濃度依次為0.15、0.20、0.25、0.30 μmol/L。圖2 不同探針濃度最低檢測限的比較結果

2.2.2 退火溫度優化 以5.69×106copies/μL 的陽性質粒標準品p-PiAdV 為模板，在其他條件不變的情況下，將退火溫度分別設置為57、58、59、60 ℃進行實時熒光PCR，每次做3 個重復。結果（表2）顯示，59 ℃時平均Ct 值最小，因此最終選擇最佳退火溫度為59 ℃。

表2 熒光PCR 退火溫度優化結果

2.2.3 反應體系確定 最終確定的一步法實時熒光PCR 反應體系如表3 所示。最佳反應條件：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 35 s，40 個循環。

表3 一步法實時熒光PCR 反應體系

2.3 標準曲線建立

將陽性質粒標準品p-PiAdV 進行10 倍倍比稀釋，取5.69×107～5.69×103copies/μL 的質粒標準品為模板，進行實時熒光PCR 反應，繪制標準曲線（圖3）。標準曲線中Ct 值和重組質粒標準品拷貝數之間呈現良好的線性關系，獲得的曲線方程為Y= -3.571X+ 41.815，相關系數R2= 0.996。

重組質粒標準品拷貝數圖3 PiAdV 實時熒光PCR 標準曲線

2.4 特異性試驗

以鴿群7 種常見的病毒DNA 或cDNA 為模版進行特異性試驗。結果（圖4）顯示，只有PiAdV-A 種和PiAdV-B 種病毒核酸出現特異性擴增曲線，而其他病毒核酸均無特異性擴增曲線。結果表明，建立的熒光PCR 反應特異性良好。

1. PiAdV-A 種病毒核酸；2. PiAdV-B 種病毒核酸；3～8. 依次為AIV、NDV、PiCoV、RVA、PiCV、PiHV 核酸。圖4 PiAdV 實時熒光PCR 特異性試驗結果

2.5 敏感性試驗

以不同稀釋倍數的陽性質粒標準品p-PiAdV為模板，分別用熒光PCR 和普通PCR 方法進行敏感性試驗。結果（圖5～6）顯示，本研究建立的熒光PCR 方法的PiAdV 最低檢測限為5.69×101copies/μL，而常規PCR 為5.69×103copies/μL。結果表明，PiAdV 熒光PCR 檢測方法的敏感性比常規PCR 高100 倍。

1～8. 陽性質粒標準品拷貝數濃度依次為5.69×107～5.69×100 copies/μL。圖5 PiAdV 實時熒光PCR 敏感性試驗結果

M. DL 2 000 DNA Marker；1～8. 陽性質粒標準品拷貝數濃度依次為5.69×107～5.69×100 copies/μL；N. 陰性對照。圖6 PiAdV 常規PCR 靈敏度試驗結果

2.6 重復性試驗

結果（表4）顯示，組內重復各稀釋度標準品間的CV 值為0.11%～1.72%，組間重復各稀釋度標準品間的CV 值為0.08%～0.53%，均小于1.8%。結果表明，該檢測方法具有良好的可重復性。

表4 PiAdV 實時熒光PCR 重復性試驗結果

2.7 臨床樣品檢測

利用本研究建立的PiAdV 通用型實時熒光PCR 方法對20 份臨床疑似PiAdV 感染樣品進行檢測，結果檢出8 份陽性樣品。隨后對8 份陽性PCR 產物進行序列測定，序列比對結果顯示，8 份陽性序列均為PiAdV 基因片段。用常規PCR 方法從上述樣品中檢出3 份陽性樣品，兩種方法的符合率為75.00%，Kappa 值為0.722（表5）。

表5 PiAdV 熒光PCR 與常規PCR 檢測法檢測結果比對結果 單位：份

3 討論

近年來，我國養鴿業逐漸向產業化、規模化發展，鴿子飼養數量逐年增加，人們對鴿群中的疫病也越來越重視[12]。PiAdV 是鴿群中常見的一種病原體，當鴿感染PiAdV 時，主要表現出嘔吐、消化停滯[13]，繼而出現脫水、體溫上升、體質量減輕、排綠色水便或血便等癥狀，嚴重的在2～3 d內急性死亡[14-15]。PiAdV 單獨感染時，死亡率較低，但與其他病原混合感染時，則會導致鴿群死亡率明顯升高，給養鴿業造成了嚴重的經濟損失。

病原的早期診斷是PiAdV 感染防控的關鍵因素[16]。目前，臨床上已有針對PiAdV 的檢測方法，其中病毒分離鑒定法是最可靠的檢測方式，但該方法對樣品的檢測周期較長，不利于大規模檢測[17]；血清中和抗體技術和普通PCR 檢測技術是實驗室診斷較常用的方法，但均要求檢測樣本中的病毒載量較高，且血清中和抗體技術操作環節復雜[18]。此外，國內外僅有基于PiAdV-A 種和PiAdV-B 種病毒單獨的核酸檢測方法，還未有適用于PiAdV 通用的核酸檢測方法。因此，亟需建立針對鴿群PiAdV-A 種和PiAdV-B 種病毒的通用型靈敏特異的高通量快速檢測方法，為開展PiAdV感染的早期診斷提供技術儲備[19]。

本研究基于鴿群PiAdV-A 種和PiAdV-B 種病毒pVIII基因保守序列設計特異性引物及探針，并對其反應體系及反應條件進行優化，建立了PiAdV通用型實時熒光PCR 檢測方法。該方法特異性強、敏感性高、可重復性好。僅對PiAdV 核酸出現特異性擴增曲線；最低檢測限為56.9 copies/μL，比常規PCR 檢測方法的靈敏度高出100 倍；具有良好的重復性，組內重復CV 值為0.11%～1.72%，組間重復CV 值為0.08%～0.53%。

利用本研究建立的PiAdV 通用型實時熒光PCR 檢測方法與常規PCR 方法，同時對20 份臨床疑似PiAdV 感染的樣品進行病原學檢測，熒光PCR 方法檢出8 份陽性樣品，而常規PCR 方法僅檢出3 份陽性樣品。結果提示，本研究所建立的PiAdV 熒光PCR 檢測方法比臨床上常用的常規PCR 檢測方法具有更高的靈敏度，進而具有良好的臨床診斷性能。綜上所述，本研究建立了一種快速、敏感、特異、準確的PiAdV 通用型實時熒光PCR 檢測方法，為PiAdV 感染的早期診斷及綜合防控提供了必要的技術支持。