外泌體提取及提高外泌體產量研究進展

楊艾，魯衛東

外泌體是由脂質雙分子層包裹，與細胞膜融合后釋放到細胞外基質中的多囊體小腔內，直徑為 30 ～ 100 nm[1]、密度為 1.13 ～ 1.21 g/ml[2]的囊泡。外泌體通過在體內游走，與受體細胞結合，進而實現細胞交流、調控近端和遠端細胞微環境等作用，內含 mRNA、DNA、蛋白質等物質[3]。外泌體來源廣泛，主要從體內（血液、唾液等體液）和體外（細胞培養）分離提取[4]。但外泌體具有內在的異質性，到目前為止，在內容和大小方面還不可能產生完全同質的外泌體群體[5]，這給外泌體的提取帶來了巨大困難。

目前的大多數分離技術無法將外泌體與具有相似生物物理特性的脂蛋白和非內泌體途徑衍生的細胞外囊泡完全分離，導致外泌體純度低。因此，如何有效地收集外泌體是當下一個主要問題，這對外泌體的下游分析至關重要。對于不同的目的和應用，可選擇不同的分離方法，現階段主要采用超高速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法等方法分離提取外泌體[6]。超高速離心法是目前應用最廣泛的分離技術，也是外泌體提取和分離的金標準。Johnstone等[7]首次應用該方法分離網織紅細胞組織培養基中的外泌體，Théry 等[8]進行了優化，但由于耗時、成本高，容易對外泌體的結構造成損傷，外泌體易聚集成塊，不利于下游分析[9]，并且超高速離心法獲得的沉淀中除含有外泌體外，還混有其他蛋白質和囊泡[10]。密度梯度離心法通常與超速離心結合使用以提高外泌體的純度，主要有兩種方法，其中一種是使用蔗糖作為培養基，在研究中廣泛使用，但蔗糖溶液的高黏度會降低外泌體的沉積速率，導致分離時間更長[11]。聚合物沉淀的方法通常使用聚乙二醇（PEG）作為介質，PEG是通過將環氧乙烷與水或乙二醇添加而形成的，通過降低外泌體的溶解度，在離心條件下獲得外泌體。聚合物沉淀法相對容易操作，分析時間短，適用于處理大劑量樣品。然而，利用此方法獲取的外泌體純度和回收率相對較低，并且產生的聚合物很難去除，不利于后續的功能實驗分析[6]。超濾方法通常使用具有不同分子量截止值（MWCO）的超濾膜來選擇性地分離樣品。然而，外泌體和超濾膜存在非特異性結合的問題，從而降低了回收率[12]。這些方法缺乏特異性，使得外泌體的分離和純化并不理想。

外泌體缺乏安全穩定的來源也是產量低下的一個主要原因。外泌體主要是從體外的細胞培養基（如腫瘤細胞培養基、免疫細胞培養基、干細胞培養基）中分離得到的。體外細胞培養基中的外泌體含量非常有限，不利于規模化生產，限制了其臨床應用。不同來源的外泌體有著不同的組成，即使是同一來源的外泌體對于受體細胞也會有多重功能，在臨床上不能普適或可控[13]。這些因素直接或間接地導致了外泌體得率較低，因此亟需提高外泌體的產量來解決以上問題。本文對外泌體的形成分泌過程以及在細胞培養時對培養條件改進等方面進行綜述。

1 外泌體形成過程

外泌體形成的具體過程分為 3 個階段：第一階段形成早期內吞體，之后成熟形成晚期內吞體，晚期內吞體向內出芽形成管腔囊泡（ILVs）；第二階段 ILVs 發育成熟進一步形成多囊泡（MVBs）；第三階段，大部分 MVBs 被轉運至溶酶體降解，僅有小部分 MVBs 與質膜融合后以胞吐的形式將外泌體釋放到胞外[14-16]。

從分泌機制可知外泌體的生物發生關鍵步驟在第三階段，近年來對外泌體分泌至胞外的過程，無論是 MVBs 與質膜融合，還是 MVBs 被溶酶體降解的研究，也逐漸增多。

1.1 ILVs 形成階段

外泌體生物發生的核心成分涉及轉運復合物所需的內體運輸分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT），ESCRT 是一種蛋白復合物，主要作用是分選特異的組分進入 ILVs 形成外泌體的前體，ESCRT包含了四種復合體及輔助蛋白（VPS4、VTA1、ALIX 等），也有報道稱外泌體的生物發生涉及 ESCRT 非依賴性途徑，ESCRT 非依賴性途徑通過脂質、神經酰胺等的作用輔助生成 ILVs[17]。外泌體內含物的成分主要為蛋白質、脂質和核酸，蛋白質組成部分包括與膜轉運和融合的相關蛋白如Rab 家族，Rab 蛋白是類 Ras 的小 GTP 酶（GTPase）超家族中最大的分支，它們在 GTP- 和 GDP-結合狀態之間交替，由鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）和 GTPase 激活蛋白（GAPs）促進，能調控囊泡轉運，比如囊泡的出芽、囊泡和細胞內細胞器的運動、囊泡銜接的不同階段，從而促進膜的融合。

Rab5:Q79L 是 Rab5 蛋白的突變體，Barbieri 等[18]報道 Rab5:Q79L 僅促進早期內吞體之間的融合。且 Wegner等[19]研究表明 Rab5:Q79L 的過度表達不利于早期內吞體轉運并導致晚期內吞體擴大。同時根據 Kooijman 等[20]所研究的磷脂酶 D（PLD）將磷脂酰膽堿代謝為磷脂酸（PA），由于酰基鏈附近有一個非常小的帶負電荷的頭部基因，在膜的內部小葉中產生的 PA 可能會誘導負膜曲率，這可能有利于內腔內出芽，以及神經酰胺的錐形結構可誘導膜雙層自發負彎曲，促進膜內陷[21]，局部脂質成分可重組為專門的內胚體區域，誘導膜彎曲并促使 ILVs 形成，該學者發現PA 探針富集在 Rab5:Q79L 早期內吞體的限制膜上，可以進行內體出芽并產生巨大的 MVBs。

Stenmark 等[22]還發現 Rab5:Q79L 的過度表達嚴重減少了合胞體蛋白（syndecan）、溶酶體相關膜蛋白 3（CD63）、突觸融合蛋白（syntenin）和凋亡誘導因子 6 相互作用蛋白（ALIX）的外泌體釋放。與 CD63 一樣，ALIX 和 syntenin是外泌體內最常見的蛋白質。

Baietti 等[23]進一步研究了 syntenin-ALIX 是否支持晚期內吞體膜上的出芽過程。共聚焦顯微鏡顯示用 mCherry（紅色熒光蛋白）熒光標記的 syntenin 和 syndecan 胞內結構域（ICD）廣泛共定位，包括它們與 ALIX 一起“聚集在”用 cerulean（cer）修飾 Rab5:Q79L 的內吞體中。充滿 McHery-syntenin（指示 ILVs）的內吞體中也充滿 CD63。相反，在沒有伴隨的 McHery-syntenin 表達的情況下，CD63主要局限于內吞體的限制膜。這些結果表明，syntenin 通過LYPX(n)L 基序直接與 ALIX 相互作用，類似于逆轉錄病毒蛋白，并支持內吞體膜的腔內出芽。該研究還表明syntenin 的缺失也顯著降低了晚期內吞體的平均大小。這些較小的晚期內吞體意味著 syntenin 可能使 ILVs 難以形成或維持，對晚期內吞體的成熟及與膜融合也有影響。

乙酰肝素酶是一種葡萄糖醛酸酯酶，在血管形成、炎癥、組織發育和腫瘤轉移的過程中均起著重要作用。有學者還發現乙酰肝素酶以濃度依賴性的方式刺激 syntenin-1、syndecan 和某些其他外泌體標志蛋白（如CD63）的分泌，而外泌體 CD9、CD81 和脂筏標記蛋白（flotillin-1）不受影響。相反，內源性乙酰肝素酶含量的降低減少了含syntenin-1 的外泌體的分泌。這說明乙酰肝素酶起到了激活syndecan-syntenin-ALIX 外泌體途徑的作用[24]。

ADP-核糖基化因子（ARF）是一類在真核細胞中廣泛存在的高豐度 N-豆蔻酰化的單體 GTP 結合蛋白，可激活ADP-核糖基化轉移酶。Ghossoub 等[25]表明小 GTPase ADP核糖基化因子 6（ARF6）缺失并沒有阻斷早期或循環內吞體中 CD63 的轉運，而是阻斷晚期內吞體隔間中的 CD63。在 ARF6 缺失的細胞中 MVBs 形態明顯改變，這表明ARF6 在 MVBs 的限制膜上起作用。

1.2 MVBs 與質膜融合階段

ILVs 發育成熟為 MVBs 后，MVBs 與質膜融合后向胞外分泌外泌體主要依賴 Rab 家族和 SNARE 家族的協助作用。

1.2.1 Rab 家族 Rab 家族包括 Rab11、Rab35、Rab27A/B、Rab9 等，其中 Rab27 最具特征[26]。Rab27a 基因可通過其編碼的蛋白參與 T 淋巴細胞、肥大細胞及造血細胞等的顆粒分運輸及胞吐作用。已有研究表明在人非小細胞肺癌細胞系 A549 中轉染 Rab27a 過表達載體，初步建立的 Rab27a過表達細胞系所分離出的外泌體，與對照組相比，典型的外泌體蛋白標記物被鑒定為高表達，即表明外泌體的分泌量增加。EPI64 作為 Rab27a 的 GTP 結合酶激活蛋白，在正常肺癌細胞 A549 中過表達 EPI64 會使外泌體分泌增加，但先在細胞 A549 沉默 Rab27a 后，再過表達的 EPI64 不能使外泌體增加，這說明 EPI64 參與了 Rab27a 介導的外泌體分泌[27]。在黑色素瘤細胞 B16-F10 和 SK-Mel-28 中有效地降低 Rab27a 的表達，導致外泌體分泌減少了 50%[28]，以及在乳腺癌 4T1 和 TS/A 細胞中抑制 Rab27a 的表達會導致外泌體分泌減少[29]。Ostrowski 等[30]通過人 HeLa 細胞系分析 Rab 蛋白在外泌體分泌中的作用，發現 Rab27a或 Rab27b 功能的喪失導致細胞培養上清液中分泌的外泌體數量減少，但既不改變其蛋白含量，也不改變其形態，并且 Rab27a 和 Rab27b 的沉默減少了 MVBs 與質膜的融合。

Rab35 作為 Rab GTPase 家族成員之一，廣泛參與細胞內部囊泡轉運及物質運輸過程。Frühbeis 等[31]在原代少突膠質細胞中，對小 GTPase Rab35 進行了小干擾 RNA（siRNA）沉默，發現外泌體分泌量減少，該研究還通過納米顆粒跟蹤分析顯示，谷氨酸刺激的細胞釋放出更多平均大小為 95 nm 的顆粒，反映了谷氨酸能夠刺激少突膠質細胞釋放外泌體。Hsu 等[32]在中性粒細胞中，通過兩輪 siRNA核連接敲除 Rab35 可以明顯減少細胞裂解液中的 Rab35，并導致外泌體膜部分蛋白脂質蛋白（PLP）恢復顯著降低，說明外泌體的分泌量顯著減少。

1.2.2 SNARE 家族 可溶性 NSF 附著蛋白受體（soluble NSF-attachment protein receptor，SNARE）家族是外泌體分泌中另一個重要的調節分子，是由多種蛋白質組成的復合體。SNARE 蛋白為 Ral-1 的靶蛋白，Ral 是低分子量GTP-結合蛋白超家族的一員，參與多種細胞活動，有研究發現 Ral GTPases 參與了外泌體的分泌，該研究表明外泌體由表皮 Hyp 細胞分泌，并有助于形成一種特殊的表皮結構，即 alae，而 GTPase Ral-1 的缺失會導致 alae 缺陷，當 Ral-1 變得有限時，MVBs 和頂端質膜的融合受到阻礙，以致外泌體分泌減少。并且該研究還表明突觸融合蛋白-5（SYX-5）參與 MVBs 膜和 Ral-1 下游的質膜之間的融合，Ral-1 的活性形式可以在頂端質膜水平激活或募集SYX-5，以促進 MVBs 融合。在缺乏 SYX-5 的情況下，MVBs 外膜不能再與質膜融合[33]。囊泡相關的膜蛋白 7（VAMP7）是一種 v-SNARE 蛋白，作為 SNARE 家族的一員，在 K562 細胞中，VAMP7 是包含乙酰膽堿酯酶的外泌體分泌至胞外過程的必需組分。在 MDCK 細胞中抑制VAMP7 的表達，可阻止分泌型溶酶體的釋放，并抑制外泌體分泌至胞外[34-35]。

1.3 MVBs 被溶酶體降解階段

盡管 MVBs 形成后會分為兩個階段，但多數的 MVBs會與溶酶體融合被降解，這是導致外泌體產量低下的關鍵原因，因此阻斷或減少溶酶體降解 MVBs，增加 MVBs 與質膜的融合率使其更多地向胞外釋放外泌體，成為提高外泌體產量的有效途徑。

沉默調節蛋白 1（SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的脫乙酰化酶，在細胞代謝、氧化應激等方面作用顯著。Latifkar 等[36]發現敲除 SIRT1 導致外泌體數量增加了 3 倍以上。SIRT1 的缺失增加了乳腺癌細胞中 MVBs的大小，這是由于溶酶體功能失調造成，SIRT1 缺失使質子泵功能不良，溶酶體無法維持降解內容物時的低 pH 值，因此溶酶體中降解的 MVBs 會與質膜融合向細胞外釋放外泌體。該研究表明浸潤性乳腺癌細胞中 SIRT1 的缺失限制了溶酶體酸化并使 MVBs 重新導向與細胞表面融合，從而增加了外泌體的分泌。

Ca2+也與溶酶體降解有關，溶酶體胞外分泌受突出結合蛋白 VII（synaptotagmin VII）調控，它是位于溶酶體上的Ca2+結合蛋白 synaptotagmin 家族的成員。Synaptotagmins在其胞質區域包含兩個 Ca2+域，它們可以結合磷脂響應Ca2+，是 SNARE 復合物的組成部分。有多項研究表明胞質 Ca2+水平的升高會刺激外泌體分泌，Ca2+調節的溶酶體胞吐是一個普遍存在的過程[37-39]。IP3（三磷酸肌醇）作為參與 G 蛋白偶聯受體介導的信號轉導的第二信使，可以促使胞庫釋放 Ca2+，增加胞質 Ca2+的濃度，Ca2+通過 IP3敏感的 Ca2+通道部分促進 MVBs 的產生[40]。莫能菌素（MON）是一種膜滲透性鈉離子載體，作用于酸性的胞內細胞器，如內核體和溶酶體。MON 能誘導 Ca2+的產生。鈣依賴機制參與了 MON 刺激外泌體釋放，因其通過改變囊泡膜上的質子梯度作用于酸性室，導致 Ca2+向胞質內移動，故 MON 不僅促使大量 MVBs 的產生，而且還增加了外泌體的分泌。氯喹作為常用的抗瘧疾藥也能增加外泌體的分泌，其增加外泌體分泌有兩個原因，一是通過增加細胞內Ca2+的濃度，刺激外泌體的釋放[41]；二是氯喹具有弱堿性，通過中和溶酶體 pH 可阻斷溶酶體降解[42]。Xu 等[43]將氯喹與乳腺癌細胞 MDA-MB-231、SUM159PT 共孵育 40 ～48 h，收集外泌體進行 Western blot 實驗，發現氯喹具有刺激外泌體分泌的作用。巴弗洛霉素 A 也是可以改變液泡腔室 pH 值的藥物，Alvarez-Erviti 等[44]表明用巴弗洛霉素 A或 V1Vo-ATPase（膜蛋白復合物）抑制劑處理細胞時，外泌體的釋放水平提高，該研究表明 MVBs 是進入溶酶體降解途徑還是發生質膜融合是由囊泡內的 pH 環境決定的。

除了以上關于外泌體分泌的生物發展三階段，與外泌體結構相似的脂質體，同樣也可促進外泌體的分泌。Emam等[45]受 Elsabahy 和 Wooley[46]報道的納米材料可以誘導多種細胞產生細胞因子的啟發，結合脂質體作為納米材料，以一種物理化學依賴的方式與細胞表面相互作用，從而刺激細胞產生外泌體。研究顯示脂質體與細胞共培養可提高外泌體產量。該研究采用薄膜水合法制備了多種脂質體，并將不同濃度的脂質體制劑與 4 種癌細胞進行共培養，所有被試癌細胞系均能以依賴于細胞類型和時間的方式分泌外泌體，共培養 48 h 后，B16BL6 癌細胞株表現出最高的外泌體產量。隨著中性或陽離子修飾的空白脂質體（NL 或 CL）磷脂濃度的增加，所有細胞株的外泌體分泌量均增加。在相同的實驗條件下，陽離子修飾的空白脂質體（CL1）比中性空白脂質體（NL）表現出更強的外泌體分泌刺激活性，而中性空白脂質體的聚乙二醇化會抑制外泌體的分泌。表明外泌體分泌受脂質體的刺激/抑制作用取決于其劑量、表面電荷、膜流動性和 PEG 修飾，以及癌細胞的類型和活力。雖然該研究對脂質體刺激外泌體分泌的潛在機制尚不明確，但可能也與細胞內 Ca2+水平的變化或引起細胞膜去極化有關。Ca2+對外泌體的影響并不是單方面，往往也是結合 Rab 家族及 SNARE 家族共同起到作用。

2 細胞培養過程

外泌體主要從細胞培養基中提取得到，所以培養基條件以及對細胞的預處理與外泌體產量也有直接關聯。

2.1 細胞接種密度

外泌體由活體細胞分泌得到，當活細胞數量越多時，分泌的外泌體也越多，但 Patel 等[47]研究表明外泌體的產生取決于細胞接種密度，而不是細胞傳代。高密度接種細胞容易出現生長抑制，而通過以低密度接種干細胞且僅使用低傳代，并且提高收集頻次可以提高總產量。

2.2 三維培養

MSCs 的三維培養主要通過細胞間聚集或細胞與生物材料間的黏附實現。Kim 等[48]采用懸滴法（3D-HD）和聚甲基丙烯酸 2-羥基乙酯（poly-HEMA）涂層法（3D-PH），將 3D 球體中骨髓間充質干細胞（MSCs）產生外泌體的效率與不同條件下單層培養的效率進行比較，結果顯示以上所述的兩種 3D 培養類型，MSCs 產生的外泌體明顯多于在傳統單層培養（2D）中獲得的外泌體。研究者認為這種現象是由細胞變為非黏附的圓形形態引起的。且該研究同樣表明無論是 3D 培養還是 2D 培養，當增加細胞培養密度時，外泌體產量會減少。

2.3 缺氧和缺血

缺氧是指將細胞培養在 1% ～ 5% O2的微環境中。King等[49]發現暴露在缺氧（1% O2）條件下，乳腺癌細胞分泌的外泌體比正常對照組高 1.41 倍。而暴露在 0.1% 的 O2條件下的乳腺癌細胞，與正常組相比，要高出 2 倍。研究者認為乳腺癌細胞外泌體的分泌量與缺氧程度成正比。

缺血預處理是指在短時間內剝奪特定器官或組織的血液供應，然后再進行一段時間的再灌注恢復過程，通過內源性保護途徑減輕再灌注對缺血組織的損傷。Davidson 等[50]表明缺血預處理后，人臍靜脈內皮細胞和離體灌注大鼠心臟的外泌體分泌量均較正常對照組高出約 3 倍，通過 NTA觀察到外泌體的大小并未有明顯變化。

3 展望

外泌體從最初被認為是細胞產生的“廢物”到隨著廣泛的深入研究，其各種生物功能正在不斷地被探索挖掘。目前外泌體在多種器官及組織損傷修復中有巨大潛力，在皮膚再生抗衰老、腫瘤治療、藥物載體等多方面，外泌體都發揮著至關重要的作用，展現出良好的臨床轉化應用前景。雖然目前外泌體領域發展迅速，但仍存在著許多障礙：①現有分離方法大多數都不規范，更像是對所分離的體系進行濃縮，且操作方法均耗時耗力，不可擴展；②外泌體的形成及分泌至胞外的機制尚未有統一定論，這對于想要精準定位于外泌體分泌作用靶點存在一定的阻礙；③細胞培養過程中外泌體產量有限，最佳的接種密度和培養基條件仍需不斷探索，這些都是推動外泌體廣泛應用的挑戰。若想要增加外泌體的醫學應用，提高產量是至關重要的一步，產量的高效增加將會支持外泌體相關分析及其作為藥物載體應用的基礎研究的擴展。隨著研究人員對外泌體得率的探索，提高外泌體產量的方法一定會不斷地被開發，進而推進外泌體的臨床應用。