CRISPR/Cas12a技術在動物疫病檢測方面的應用

孔玉方 , 王慧煜 , 袁向芬 , 許曉琳 , 吳紹強

(中國檢驗檢疫科學研究院 動物檢驗與檢疫研究所 , 北京 大興 100176)

為加強我國國門生物安全,快速檢測技術成為當下遏制外來動物疫病傳入我國的有效方法之一。傳統的病毒檢測需要進行病毒的分離培養,細菌檢測需要經過增菌擴大培養后鑒定,比較耗時費力,無法滿足動物疫病的現場快速篩檢。近期,隨著核酸擴增技術結合簇狀規則間隔的短回文重復序列及其相關蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and associated protein,CRISPR/Cas)系統檢測敏感度和特異性的提升以及檢測時間的縮短,該方法逐漸被應用于動物疫病的檢測領域。

CRISPR-Cas系統為規律成簇的間隔短回文重復序列,是存在于古生菌和細菌中的適應性免疫系統[1],能夠抵抗外來病菌的入侵,還具有“記憶性”,可以抵抗相同病菌的RNA或DNA的再次入侵,切斷病菌入侵路徑,使其無法進行復制和表達。近年來,研究人員發現CRISPR及其相關的Cas12、Cas13和Cas14蛋白在小向導RNA(Small guide RNA,sgRNA)的引導下,不僅可以裂解特異的靶標序列,還可非特異性切割單鏈DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)或單鏈RNA(Single-stranded RNA,ssRNA),可基于上述原理設計特異性報告探針用于核酸的檢測。因樣本中靶病毒或細菌含量較少,研究者們通常將CRISPR/Cas系統與聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)、重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification,RPA)和環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)相關技術結合,實現靶標核酸含量增加的目的,使檢測信號擴大,從而提高CRISPR/Cas系統檢測的敏感性和特異性[2]。本文主要針對CRISPR/Cas12a結合核酸擴增技術在動物疫病檢測中的應用進行綜述,闡明該系統目前在檢測中存在的問題,并對未來應用場景進行展望,以期為我國動物疫病的防治提供強有力的技術支撐,為我國進境動物把好國門生物安全關卡,防止外來動物疫病的入侵。

1 CRISPR/Cas12a檢測原理

CRISPR/Cas系統大致分為2個大類和5個亞型,作為第2類V型CRISPR/Cas系統的Cas12a含有催化結構域RuvC,Cas12a蛋白可以利用RuvC結構域識別靶標核酸中的前間隔序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif,PAM),在sgRNA介導下與RPA產生的靶標DNA形成三元復合體,sgRNA-Cas12a三元復合物通過識別富含T的PAM序列特異性切割雙鏈DNA(Double-stranded DNA,dsDNA)或ssDNA,激活并開始非特異性切割ssDNA兩端修飾的羧基熒光素-馬來酰亞胺,6-異構體(FAM maleimide,6-isomer,FAM)熒光顯色基團和黑洞猝滅劑-1(Black hole quencher 1,BHQ1)猝滅基團[3-5],切斷后的熒光報告分子中的熒光顯色基團和猝滅基團分離,在特定波長的光源照射下可產生熒光信號。當含有靶標基因時,生物素作為報告分子,非特異性切割ssDNA兩端修飾的FAM熒光顯色基團和Biotin生物素基團,膠體金標記抗FAM抗體可以與FAM熒光顯色基團結合,質控線(C線)中的鏈霉親和素與生物素基團結合顯色,抗FAM的二抗與膠體金-FAM熒光顯色基團復合物結合,檢測線(T線)顯色,最終通過免疫層析試紙條實現檢測結果的可視化(圖1)[6-7]。該方法相較于傳統的核酸檢測方法具有無需特殊的儀器設備、操作簡單、檢測速度快、靈敏度高等優點(表1)[8]。目前,該技術已應用于新冠病毒[9]、食品生物安全[10]、動植物病毒[11-12]以及轉基因[13]等多個檢測領域。

表1 基于CRISPR/Cas12a系統的核酸檢測技術與傳統核酸檢測技術的比較

圖1 恒溫擴增和CRISPR/Cas12a可視化過程示意圖[7]

2 CRISPR/Cas12a在動物疫病檢測方面的應用

2.1 病毒疾病 非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一種急性、烈性和高度接觸性病毒性傳染病,可感染不同日齡和不同品種的家豬和野豬,病死率高達100%,給養豬業造成數以百億的經濟損失。目前,ASF尚無有效的商品化疫苗和治療方法,只能通過快速精準的診斷和撲殺等手段來控制該病的傳播。因此,開發高效快速的檢測技術對ASF的預防和控制意義重大。目前,市售的非洲豬瘟檢測試劑盒需要依賴大型儀器設備和專業操作人員,不能滿足現場大批量樣品的快速篩查。池進進[14]利用重組酶、DNA聚合酶和RPA,在37 ℃恒

溫條件下即可擴增DNA,與CRISPR/Cas12a的切割反應相結合,建立了不依賴專業操作人員和大型昂貴儀器設備的ASFV檢測方法,實現了熒光檢測僅需30 min、可視化試紙條檢測僅需20 min,2種方法的檢測限均可達到10 copies/μL。Lu等[15]利用CRISPR/Cas12a技術,在ASFV保守區域設計了較為合適的sgRNA,將RPA技術與免疫層析試紙條技術相結合,該方法不依賴傳統的PCR儀進行擴增就能夠快速檢測到ASFV,可準確檢測出豬臨床樣品中的ASFV,靈敏度也較常規qPCR高。Wang等[16]采用ASFV保守基因p72設計了多條sgRNA,并篩選出幾個高效的sgRNA用于ASFV的檢測,結果顯示,該檢測技術的敏感性較商業化試劑盒提高了約10倍,且與其他病毒無交叉反應。He等[17]開發了一種高通量、全溶液相和等溫CRISPR/Cas12a的ASFV檢測系統,能夠有效區分具有緊密匹配序列的核酸靶點,該系統僅靠1個墨盒和熒光計,在沒有核酸擴增的情況下,2 h內ASFV的檢測極限(Limit of detection,LoD)為1 pM,Cas12a/crRNA/ASFV DNA復合物在37 ℃這種生理溫度下高度穩定,可以繼續切割ssDNA,將LoD提高100 fM,適用于無設備儀器工作環境的基層工作人員對ASFV的篩查工作。

非洲馬瘟(African horse sickness,AHS)是由非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)引起的馬屬動物疫病,對馬的致死率達90%以上,是所有馬類疾病中最嚴重致命的一種[18]。雖然我國迄今為止還沒有AHS疫情的發生,但隨著我國賽馬相關產業的發展,馬屬動物貿易往來日趨頻繁,增加了AHS的傳入風險。因此,為防止AHS的傳入,建立快速檢測AHS的方法尤為重要。黃超華等[19]基于實時重組酶介導的恒溫擴增(Real-time recombinase-aid amplification,RT-RAA)和CRISPR/Cas12a特異性sgRNA,結合側向層析試紙條建立了一種AHSV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可視化快速檢測方法,該方法的最低檢測限為2.16×101copies/μL,與世界動物衛生組織(World Organisation for Animal Health,WOAH)推薦的RT-qPCR檢測結果高度一致,比較適用于口岸或野外現場AHSV的快速篩查。

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病,幼齡豬易感,死亡率高達100%。高效快速的現場大規模篩查是預防該病的重要舉措。目前,國內外該病最常用的核酸檢測方法是逆轉錄聚合酶鏈工反應(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測技術,該方法需要專業人員操作,無法滿足現場檢測的要求。胡輕輕[20]利用CRISPR/Cas12a能夠特異性切割目的基因和非特異性切割熒光報告分子的特點,建立了現場檢測PRV的Cas12a核酸體系和CRISPR/Cas12a與側向層析試紙條相結合的核酸檢測體系。Cas12a熒光檢測體系與PCR擴增結合,雖延長了檢測時間,但靈敏度和特異性都有了很大提高;Cas12a熒光檢測體系與試紙條結合后,結果肉眼可觀,無需檢測儀器,易于野外和現場檢測。與實驗室常用的RT-PCR相比,Cas12a熒光檢測體系耗時短、成本低,為豬偽狂犬病的早期預防和診斷提供了技術支持。

豬圓環病毒病(Porcine circovirus diseases,PCVD)是由豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCVs)引起的一系列豬傳染性疾病的統稱,包括豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)、斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaning multisystcmic wasting syndrome,PMWS)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)、仔豬先天性震顫(Congenital tremors,CT)、豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)和腸炎。豬圓環病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是豬圓環病毒病的主要病原,該病毒的傳播給國內外養豬業造成了重大的經濟損失,快速檢測對PCV2的凈化具有重要意義。范樂佳[21]利用CRISPR/Cas12a自身特性與RAA結合,通過RAA技術擴增PCV2核酸再進行CRISPR/Cas12a檢測,因檢測體系中加入ssDNA報告分子,其檢測結果可通過藍光照射或試紙條判讀,且均可在30 min內獲取準確結果。該檢測體系為PCV2的凈化提供了一種可行的技術手段。

2.2 細菌疾病 結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是一種通過氣溶膠傳播的可引起人獸共患病的細菌。2018年,全球約有160萬人死于該細菌感染,而且該菌特別容易產生耐藥。對于結核分枝桿菌的早期快速檢測也是預防和治療該菌感染的關鍵。2018年,Ai等[22]在Chen等[23]建立的一種DNA核酸內切酶靶向CRISPR反式報告(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter,DETECTR)方法的基礎上,將該方法與Cas12a和RPA技術結合,用于結核病的檢測,結果發現,基于CRISPR的活動性結核病的診斷方法,具有接近單拷貝的靈敏度,并且還具有同時檢測與藥物反應相關的多個位點的潛力,這對結核病的防治意義重大。Jia等[24]開發了一種新型的結核病診斷檢測平臺,稱為基于CRISPR-Cas12a生物傳感器系統的結核分枝桿菌多重交叉置換擴增技術(Mycobacteriumtuberculosismultiple cross displacement amplification technique with CRISPR-Cas12a-based biosensing system,MTB-MCDA-CRISPR),通過CRISPR/Cas12a的檢測對MCDA結果進行解碼,從而產生簡單的視覺熒光信號讀數,LoD為40 fg/反應,并且不與非結核分支桿菌菌株和其他物種發生交叉反應?？傊?MTB-MCDA-CRISPR檢測是一種很有前景且有效的結核病感染診斷、監測和預防工具。

布魯氏菌病和類鼻疽伯克霍爾德菌病是2種人獸共患傳染病,均具有傳播性強和致病率高的特點,嚴重威脅人類的生命安全?？焖倬珳实貦z測病原體,是防止疫情擴散、降低人民感染風險和減少我國養殖業經濟損失的有效手段。徐健皓[25]建立了檢測布魯氏菌和類鼻疽伯克霍爾德菌的RPA檢測技術,最低可檢測出50fg/反應的羊布魯氏菌基因組DNA和100 fg/反應的類鼻疽伯克霍爾德菌基因組DNA,且所有檢測均可在10 min內完成,將RPA與CRISPR/Cas12a結合檢測羊布魯氏菌基因組DNA和類鼻疽伯克霍爾德菌基因組DNA時,最低檢測限分別為5 fg/反應和20 fg/反應,所需檢測時間為40 min;雖然檢測時間延長了,但檢測細菌的靈敏度提高了很多。該檢測技術僅需金屬浴或者小巧輕便的加熱器就可以在野外或者現場實現對細菌的快速檢測,為布魯氏菌病和類鼻疽伯克霍爾德菌病的防治提供了新方法和新思路。

2.3 寄生蟲疾病 隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一類寄生于人和多種動物胃腸道的病原。微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum,C.parvum)是最常見的蟲種,其中II d亞型是最常見的亞型。最常被報道的微孢子蟲種是畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi,E.bieneusi)。隱孢子蟲除感染人外,還會感染家養畜禽、野生動物和伴侶動物等。感染這些腸道原蟲后,免疫功能較強的個體一般為無癥狀感染者;而免疫功能不健全的個體嚴重時可導致死亡。這些病原對畜牧業的健康發展和人類的生命安全造成了極大的威脅。余復昌[26]建立的RPA-CRISPR/Cas12a可以快速檢測樣品中的C.parvumIId和E.bieneusi特異性核酸片段,最低可以分別檢測到1.9×10-18M的重組質?；蛎靠思S便10個卵囊和3.7 copies/μL的E.bieneusiDNA,并且不與常見的腸道原蟲發生交叉反應,表明該檢測方法比較適用于臨床大批量樣品的檢測,對寄生蟲病的防控也具有一定的指導意義。Yu等[27]通過整合重組聚合酶擴增和Cas12a/crRNA反式切割系統,在藍光下通過肉眼即可觀察熒光試紙條檢測結果,LoD達到單個拷貝數的C.parvum60kDa糖蛋白,并且與細小梭菌或其他常見腸道寄生原生動物無交叉反應。

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的一種最為嚴重的人獸共患寄生蟲病,2021年,全球有2.47億例瘧疾病例,61.9萬人死于瘧疾。雖然2021年6月世界衛生組織(World Health Organization,WHO)宣布我國通過了消除瘧疾的認證,但是境外輸入瘧疾的風險依然存在[28-30]。對人體危害最大的是惡性瘧原蟲,常用的檢測方法有外周血涂片染色鏡檢法、酶聯免疫吸附法、PCR和RT-PCR等,這些方法存在耗時和操作繁瑣等缺陷。黃維益等[31]開發了一種簡單快速檢測惡性瘧原蟲的方法,以惡性瘧原蟲18S rRNA基因作為靶標序列,建立了RAA-CRISPR/Cas12a系統的恒溫熒光快速檢測惡性瘧原蟲的方法,可以檢測出1 copies/μL的含惡性瘧原蟲3D7株18S rRNA基因的質粒;用該方法檢測50份臨床樣本的結果與巢式PCR一致性達100%,檢測稀釋后的臨床樣本,最低檢測限為50個瘧原蟲/μL。Wei等[32]開發并優化了一種基于RPA和CRISPR/Cas12a對瘧原蟲分離株進行檢測的平臺,結果顯示,瘧原蟲基因組質粒的LoD為1 copies/μL,干血點的LoD為3.11～7.27個瘧原蟲/μL,且與血源性病原體無交叉反應。RPA-CRISPR/Cas12a平臺檢測瘧原蟲和惡性瘧原蟲的準確率分別為98.68%和94.74%,與巢式PCR的結果一致,優于qPCR的結果,該平臺不需要核酸擴增反應的儀器或只需要最少的儀器,結果可以肉眼讀取。與類似的診斷方法相比,該平臺在降低檢測要求的同時提高了反應速度。綜上結果表明,該方法有望用于惡性瘧原蟲的快速檢測和風險監測[32]。CRISPR/Cas12a技術在動物疫病檢測中的應用如表2所示。

表2 CRISPR/Cas12a結合RPA擴增技術在動物疫病檢測中的應用

3 小結與展望

CRISPR/Cas12a技術在動物疫病檢測中展現出了良好的應用前景。該技術與各種核酸擴增技術的結合,提高了檢測方法的靈敏度和特異性,且無需昂貴的儀器設備和專業人員就可實現現場的快速檢測。但CRISPR/Cas12a技術也存在一定的缺陷,單獨使用Cas12a進行檢測的靈敏度較低,識別病原的難度較大,需要聯合等溫擴增等技術來提高模板量。但等溫擴增技術的缺陷也隨之呈現,如酶的工作效率、引物的用量和反應體系是否達到最佳配比等;CRISPR/Cas12a的sgRNA序列需設計在特定的PAM后,有時能夠滿足此設計條件的情況有限;RAA結合CRISPR/Cas12a系統提高了檢測的靈敏度,但當將核酸擴增產物加入Cas12a的切割體系中時,開蓋容易造成氣溶膠的污染,導致假陽性結果的出現。相信未來通過不斷的充分利用Cas12a的反式切割活性,簡化核酸擴增的步驟,可以使CRISPR/Cas12a技術成為最為普遍的核酸檢測技術?？傊?CRISPR/Cas12a技術在動物疫病檢測方面的優勢值得進一步挖掘和探索,相信在不久的將來也可以實現該技術的現場快速定量檢測,為我國的國門生物安全保障提供強有力的技術支撐。