豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體和豬瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比較分析

馬紅偉 , 潘華春 , 楊書敏 , 張 可 , 楊 紅 , 藺 肖 , 阮坤祥 , 李家奎

(1.華中農業大學動物科學與動物醫學學院 , 湖北 武漢430070 ; 2. 普萊柯生物工程股份有限公司 , 河南 洛陽 471000 ;3.襄陽傲農雪生畜牧養殖有限公司 , 湖北 襄陽 441000)

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)和豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)感染廣泛存在于養豬業中,構成當前危害養豬業發展的重要傳染病。豬瘟(Classical swine fever,CSF)亦為所有養殖場必須通過疫苗免疫進行防控的重要病毒性疾病[1-3]。在臨床實踐中,PCV2和Mhp可共同引發豬呼吸疾病綜合征(Porcine respiratory disease syndrome,PRDC),Chen等[4]研究證實,Mhp與PCV2之間存在協同感染關系,Mhp能夠加劇PCV2相關性肺臟病變的嚴重程度,增加PCV2在組織中的病毒載量。大量研究證實,養殖場內PCV2和Mhp的感染嚴重損害了養殖經濟效益,阻礙了畜牧業的健康發展[5-6]。

目前,疫苗免疫是有效控制豬傳染病的手段之一。然而,復雜的免疫程序不僅對豬只造成較大的生理應激,同時也增加了養殖工人的負擔。因此,在保持疫苗免疫類型不減少的前提下,如何降低免疫次數并仍可達到理想的免疫效果,成為需要深入研究的科學問題。隨著養豬場規模化程度的不斷擴大和非洲豬瘟感染的持續存在,聯合免疫成為當前養豬業的研究熱點。為了獲得最佳免疫方案,研究人員根據生產實際進行不斷地探索。朱巧艷等[7]通過使用圓支二聯疫苗作為稀釋液稀釋豬瘟活疫苗免疫仔豬,發現聯合免疫與單獨使用圓支二聯疫苗免疫的效果相當。陳昌海等[8]通過聯合使用豬瘟活疫苗和豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗免疫豬只,發現聯合免疫不僅不影響抗體產生,而且能夠維持抗體在豬群個體間的穩定分布。翟路峰等[9]使用副豬嗜血桿菌滅活疫苗作為稀釋液稀釋豬瘟活疫苗免疫仔豬,發現聯合免疫組的中和抗體水平與單獨免疫組無顯著差異,為簡化疫苗免疫程序提供了實質性的臨床參考依據。車巧林等[10]研究發現,在使用圓環-支原體二聯疫苗免疫豬只后,PCV2抗原對豬Mhp免疫產生了增強作用。陳昌海等[11]研究發現,PCV2疫苗和CSF活疫苗的聯合免疫不會影響相應抗體的產生,并促進了這2種疫苗抗體在豬群中的穩定分布。綜上所述,聯合免疫在豬場免疫中具有降低人工成本,提高經濟效益的重要意義,且簡化了免疫程序。

值得關注的是,目前尚未見到關于將豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體和豬瘟疫苗采用聯合免疫的方式,在懷孕后期母豬中免疫,并在其所產的仔豬中進行免疫的大規模田間研究報道。本試驗將豬圓環病毒2型基因工程疫苗與豬肺炎支原體滅活疫苗混合作為稀釋液稀釋豬瘟活疫苗,對產前1個月左右的母豬進行免疫,并對其所產仔豬于21日齡時同時免疫這3種疫苗,以母豬單獨接受圓-支二聯苗和豬瘟活疫苗免疫為對照組,通過監測免疫后臨床指標、生產性能和持續性抗體水平,評估聯合免疫與傳統免疫的實際免疫效果,旨在為優化疫苗免疫程序提供可靠的臨床參考依據。

1 材料與方法

1.1 疫苗 試驗疫苗由普萊柯生物工程股份有限公司提供,對照品圓-支二聯疫苗購自洛陽惠中生物技術有限公司。疫苗信息見表1。

表1 疫苗信息

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗分組 從襄陽傲農雪生畜牧養殖有限公司選取364 頭處于產前1個月的四胎次健康三元母豬,做好耳標,隨機分為A組(240 頭,聯合免疫組:圓柯欣、柯喘寧和穩柯健3種疫苗聯合免疫)和B組(124 頭,對照組:圓-支二聯疫苗和穩柯健疫苗分別免疫)。試驗期間豬只的飼養、管理和保健按公司日常管理程序進行。

1.2.2 疫苗免疫方案 試驗從母豬產前1個月免疫疫苗開始,到仔豬50日齡時結束,持續77 d。A組(聯合免疫組)所有母豬在產前27 d 聯合免疫穩柯健、圓柯欣和柯喘寧,母豬生產后,其所產仔豬在21日齡時聯合免疫穩柯健、圓柯欣和柯喘寧;B組所有母豬在產前34 d免疫穩柯健,產前27 d免疫圓-支二聯疫苗,其所產仔豬在14日齡免疫圓-支二聯疫苗,28日齡免疫穩柯健。所有仔豬在1日齡進行偽狂犬病活疫苗(普寧)滴鼻免疫并注射保健針,7日齡免疫高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株),35日齡時注射偽狂犬病活疫苗(普寧)(表2)。

表2 疫苗免疫方案

1.2.3 樣品采集和指標分析

1.2.3.1 臨床指標 觀察、記錄并統計疫苗免疫后2個組母豬體溫、應激(嘔吐、發燒、精神沉郁)、采食和哺乳情況,仔豬體溫、應激(嘔吐、發燒、精神沉郁)、采食和呼吸道疾病發生情況。

1.2.3.2 生產性能 統計分析2個組母豬的窩產健仔數和出生健仔均重,仔豬的日增重和死淘率。

1.2.3.3 持續性抗體水平 采集 A組和B組的母豬和仔豬的血液(表3),靜置2～3 h,3 000 r/min離心15 min分離血清,委托第三方專業檢測機構洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司,對免疫后豬只抗體進行檢測,并出具檢測報告。用阻斷率(Percentage inhibition,PI)值表示CSFV抗體陽性率,樣品光密度(Optical density,OD)值與陽性對照品OD值的比值(Sample/Positive,S/P)表示PCV2抗體水平。

表3 血液樣本采集時間和數量

1.3 數據分析 使用SPSS 26.0軟件中的單因素ANOVA檢驗對各組的ELISA檢測結果平均值進行差異顯著性比較。用Excel進行作圖,數據結果以“平均值±標準差(Mean±SD)”方式表示。

2 結果

2.1 臨床指標分析 免疫后2個組母豬采食和哺乳情況均正常,未出現免疫應激和其他嚴重副反應,所有豬只體溫均正常。免疫疫苗后,除A組有1頭仔豬出現昏厥,B組有5 頭仔豬出現輕微嘔吐情況外,其他仔豬均未出現嚴重的免疫應激情況,且出現免疫應激的仔豬在緊急采取冷水沖頭后,癥狀很快得到緩解;在試驗期間內,2個組仔豬免疫后整體精神狀態良好,采食情況正常,體溫正常,均未出現咳嗽和喘氣等呼吸道疾病。

2.2 生產性能分析 結果如表4所示,A組和B組母豬的窩產健仔數、出生健仔均重分別是12.29頭/窩、1.37 kg/頭和12.32頭/窩、1.38 kg/頭,基本一致;A組和B組仔豬出生至23日齡死淘率、出生至50日齡死淘率分別為3.77%、5.11%和4.07%、5.43%。

表4 各組母豬和仔豬的生產性能

2.3 母豬CSFV抗體陽性率檢測 結果如表5和圖1所示,A組和B組母豬在產前免疫豬瘟活疫苗,2個組母豬的CSFV抗體陽性率在生產當天(0 d)、生產第14 天(14 d)、生產第21 天(21 d)和生產第35 天(35 d)均無明顯差異(P>0.05),且均高于70%,遠高于保護標準>40%[12];2個組母豬的整體免疫保護率均在90%以上,且無明顯差異(P>0.05),說明該豬瘟活疫苗免疫原性很好,均能刺激豬只產生合格的中和抗體;SD值表示標準差,體現的是群體內個體間抗體效價的差異程度,2個組母豬在免疫后的幾次檢測中,A組母豬的CSFV抗體SD值均要小于B組。

圖1 各組母豬豬瘟病毒抗體陽性率變化趨勢

表5 各組母豬豬瘟病毒抗體陽性率和免疫保護率

2.4 母豬PCV2抗體檢測 結果如表6和圖2所示,在生產當天(0 d)時,A組母豬的PCV2抗體S/P值極顯著高于B組(P<0.01);在生產第14 天(14 d)時,A組母豬的PCV2抗體S/P值顯著高于B組(P<0.05);在生產第21 天(21 d)和生產第35天(35 d)時,2個組無顯著差異(P>0.05);除生產第35天(35 d)外,A組母豬各監測時間點的PCV2抗體SD值均小于B組母豬。

圖2 各組母豬圓環病毒2型抗體變化趨勢

表6 各組母豬豬圓環病毒2型抗體水平和免疫保護率

2.5 仔豬CSFV抗體檢測 結果如表7和圖3所示,A組和B組仔豬的CSFV母源抗體陽性率在14日齡均遠高于規定標準[12],維持在非常高的水平,且A組仔豬的CSFV母源抗體陽性率顯著高于B組(P<0.05);A組和B組仔豬在21、35和50日齡的CSFV抗體陽性率無顯著差異(P>0.05),但均高于規定標準[12];A組和B組在整個試驗周期中的免疫保護率均達到100%。

圖3 各組仔豬豬瘟病毒抗體陽性率變化趨勢

表7 各組仔豬豬瘟病毒抗體陽性率和免疫保護率

2.6 仔豬PCV2抗體檢測 結果如表8和圖4所示,A組和B組仔豬各階段PCV2抗體S/P值均>0.50,表明仔豬均處于穩定或良好的免疫狀態;在整個監測期間,A組仔豬PCV2抗體平均值在14和21日齡均顯著高于B組(P<0.05);21日齡時,B組仔豬的PCV2抗體平均值出現明顯的下降,疫苗免疫保護率為91.67%(11/12),2個組其他日齡仔豬的抗體免疫保護率均達100%。A組仔豬PCV2抗體水平表現得更為穩定。

圖4 各組仔豬圓環病毒2型抗體變化趨勢

表8 各組仔豬圓環病毒2型抗體水平和免疫保護率

3 討論

在本試驗中,A組(聯合免疫組)與B組(對照組)豬只被分別飼養在兩棟獨立且相鄰的圈舍中,由專職員工進行飼養。同時,試驗數據的統計不影響豬場正常的生產經營和管理,養殖過程按照豬場正常的流程化制度進行。在整個試驗周期中,豬場未發生烈性傳染病和嚴重消化系統疾病,可最大程度排除其他因素對本次試驗結果的干擾。在本試驗中,A組(聯合免疫組)的仔豬在接受疫苗免疫時總應激次數僅有1次,明顯低于B組(對照組)總應激次數5次;2個組母豬的窩產健仔數和出生健仔均重無差異。但在仔豬23日齡斷奶時,A組仔豬的死淘率較B組仔豬低0.3%,且A組仔豬斷奶均重比B組仔豬多160 g/頭,A組仔豬相對于B組仔豬在死淘率和生長速度方面略顯優勢,這與陳昌海等[11]的試驗結果相符。A組仔豬采取聯合免疫,1次完成3種疫苗的免疫,而B組仔豬則采取2次免疫,豬只的應激次數較A組大,可能是B組仔豬死淘率增加和生長速度略微降低的原因之一。以每頭母豬每年產仔2.5 胎次,每胎產仔豬12頭為例,1個萬頭母豬養殖場,仔豬23日齡斷奶死淘率降低0.3%來計算,若采用聯合免疫策略,每年可增加存活仔豬約900 頭,因此,規模養殖集約化生產中,聯合免疫策略具有提高經濟效益的潛力。

本試驗期間,A組和B組母豬均在產前1個月接受豬瘟活疫苗免疫,2個組母豬的CSFV抗體陽性率無明顯差異。值得注意的是,仔豬在14日齡時,A組仔豬的CSFV母源抗體陽性率顯著高于B組仔豬,高水平的母源抗體可能預示著更強的免疫保護效力,然而在仔豬21、35和50日齡3個階段,2個組仔豬的CSFV抗體陽性率并未顯示出明顯差異,而且豬瘟活疫苗對仔豬的免疫保護率均維持在極高的水平,這說明A組仔豬在21日齡采取聯合免疫豬瘟活疫苗,與B組仔豬在28日齡采取的單獨免疫豬瘟活疫苗,2種免疫方案對誘導仔豬產生自身CSFV抗體并無明顯差別。

張敬峰等[13]等研究發現,豬圓環病毒的感染會對豬的免疫系統造成損害,從而抑制豬瘟活疫苗的免疫應答,而PCV2陽性場,免疫PCV2疫苗能夠明顯增強CSF活疫苗的免疫效果。研究還發現,豬只從免疫PCV2疫苗到形成自身強大免疫保護所需的時間為14 d[9,10,13],而在仔豬21日齡后,PCV2母源抗體陽性率下降加快,因此建議仔豬在21日齡之前免疫PCV2疫苗[14-16]。在本試驗中,A組和B組母豬均在產前27 d免疫PCV2疫苗,均成功誘導了高水平的PCV2抗體。然而,在仔豬14和21日齡時,A組母豬所產仔豬獲得的PCV2母源抗體要顯著高于B組仔豬,表明A組母豬免疫PCV2疫苗后產生的PCV2抗體顯著高于B組。高水平的母源抗體預示著更強的免疫保護,推測是B組仔豬在14日齡免疫PCV2疫苗,高水平的PCV2母源抗體可能干擾了外源性PCV2疫苗在體內的正常增殖所致。但是,在仔豬35和50日齡2個階段,A組和B組仔豬PCV2抗體均維持在良好的抗體保護水平,且兩組無顯著差異,表明針對該PCV2疫苗,聯合免疫與單獨免疫對誘導豬只產生高水平的PCV2抗體保護效果是相似的。這一發現與車巧林等[10]和陳昌海等[11]研究結論一致。同時本試驗也發現,母豬在產前27 d免疫PCV2疫苗,仔豬在21日齡免疫PCV2疫苗是合理且可行的,與相關研究結論一致[17-18]。

大量研究證實,在仔豬7～21日齡期間進行豬肺炎支原體疫苗免疫,能夠有效控制豬只在早期感染支原體肺炎,進而提升生產性能[19]。Takeuti等[20]研究發現,對母豬定期免疫支原體疫苗可降低豬群的感染壓力,減少向環境排放細菌的數量,從而降低對仔豬的感染風險。Wallgren等[21]和Arsenakis等[22]研究表明,在母豬妊娠后期(至少在產前4周)免疫支原體疫苗,有助于減少仔豬斷奶時豬肺炎支原體的定殖,顯著減少由支原體引起的仔豬呼吸道疾病。由于豬肺炎支原體的免疫逃逸和滯后的血清學反應特性,通常在感染后3～8 周才能檢測到豬肺炎支原體的特異性抗體[23]。研究發現,支原體肺炎感染主要局限于呼吸道,很少進入血液和淋巴循環系統,即使機體產生了抗體,體液中的高水平抗體也無法直接與病原體發生中和作用[24]。因此,目前市場上售賣的多款針對豬肺炎支原體的抗體檢測試劑盒無法區分母源抗體和疫苗抗體[1],豬肺炎支原體抗體檢測試劑盒基本上不作為豬場支原體肺炎疫苗保護的評估標準。在本次試驗中,盡管未進行支原體抗體水平的相關監測,但通過對豬只咳嗽和氣喘等呼吸道癥狀的觀察,發現在整個試驗期間,2個組仔豬在呼吸道疾病方面均未出現異常情況。

綜上所述,本試驗對母豬及所產仔豬進行CSFV和PCV2抗體檢測,結合仔豬臨床呼吸道癥狀觀察,發現豬瘟活疫苗(穩柯健)、豬圓環病毒2型基因工程疫苗(圓柯欣)和豬肺炎支原體滅活疫苗(柯喘寧)這3種疫苗可以采取聯合免疫方案,彼此之間并不產生干擾。鑒于非洲豬瘟大環境和規模養殖集約化趨勢下,本試驗在豬場原有免疫基礎上進一步優化豬群免疫程序,在不影響規模化養殖場的正常生產運營前提下,進行了大規模的田間研究,取得了良好的效果。本試驗通過簡化免疫程序,降低豬只與人和物的接觸,減低感染風險,這對于提高豬場的生產效益具有切實的現實意義。