豬鏈球菌靶向DC重組蛋白DC3pep-SDZ對斑馬魚的免疫保護性分析

于恩遠 , 榮睿璠 , 曾 君 , 趙瑞利 , 郭海悅 , 張東超 , 胡 燁 , 李 穎 , 王心如

(1. 天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室 , 天津 西青 300392 ;2. 天津市動物疫病預(yù)防控制中心 , 天津 北辰 300402)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)主要致病血清型為2型(SS2)、3型(SS3)、7型(SS7)和9型(SS9)等[1-3]。為了開發(fā)具有型間交叉保護效果的SS亞單位疫苗,本課題組前期選取了SS2、SS3和SS9中高度保守的分泌型DNA核酸酶A(Secretory DNA nuclease A,SsnA)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLDH)和高親和力鋅攝取系統(tǒng)蛋白(High-affinity zinc uptake system protein,ZnuA)3種毒力因子作為保護性抗原,利用生物信息學(xué)軟件篩選得到了優(yōu)勢的B細(xì)胞和輔助T(Helper T,Th)細(xì)胞表位,將這些優(yōu)勢表位與樹突狀細(xì)胞靶向肽(Dendritic cell targeting peptide,DC3pep)氨基酸序列串聯(lián),構(gòu)建并制備了靶向樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)的多表位重組蛋白DC3pep-SDZ[1]。

斑馬魚(Daniorerio,Zebrafish)是目前SS相關(guān)研究中常用的模式生物之一[4],由于斑馬魚與哺乳動物基因同源性較高,有著完整特異性的先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng),當(dāng)魚體感染細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原體后可以釋放一系列炎性細(xì)胞因子[5]。Pressley等[6]報道了用遲緩愛德華菌感染斑馬魚后,魚體IL-1β和TNF-a基因的表達量顯著上調(diào)。Rodríguez等[7]檢測顯示,被嗜水氣單胞菌感染的斑馬魚腎臟中TNF-α和IFN-γ基因的表達量上調(diào)。

為了探究本課題組前期構(gòu)建的SS多細(xì)胞表位靶向DC重組蛋白DC3pep-SDZ對致病型SS感染斑馬魚的免疫保護效果,本試驗采用了與構(gòu)建重組蛋白DC3pep-SDZ相同的方法構(gòu)建了不含DC3pep的對照重組蛋白SDZ,將制備的2種重組蛋白分別免疫斑馬魚,攻擊致病型SS2、SS3和SS9,計算存活率,采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色法探究重組蛋白DC3pep-SDZ對斑馬魚感染SS后產(chǎn)生的免疫保護效果,采用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)檢測SS3攻擊斑馬魚后的炎性細(xì)胞因子表達量,以期為后續(xù)SS重組亞單位疫苗的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Todd-Hewitt肉湯(Todd-Hewitt broth,THB)粉末,購自青島海博生物技術(shù)有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG),購自翌圣生物科技(上海)有限公司;二甲苯,購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate,MS-222),購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;2×ExTaqMix,購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司;伊紅、蘇木精、焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)水和磷酸鹽緩沖液等,均購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzol總RNA提取試劑,購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 主要儀器 熒光倒置顯微鏡,Nikon尼康精機(上海)有限公司產(chǎn)品;JXFSTPRP-CL-24冷凍研磨儀,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;超微量分光光度計,賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;iMax酶標(biāo)儀、凝膠成像分析儀和熒光定量PCR儀,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.3 菌株和實驗動物 SS2(ZY05719)、SS3(TJ1806)和SS9(TJ0102)分離株,由天津農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)實驗室保存;原核表達載體pET28a-SDZ和感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3),由上海捷瑞生物工程有限公司構(gòu)建。健康成年AB系野生型斑馬魚(體長2.5～3.5 cm),由天津農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)實驗室繁殖飼養(yǎng),本試驗經(jīng)天津農(nóng)學(xué)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:2021LLSC07)。

1.4 試驗方法

1.4.1 重組質(zhì)粒pET28a-SDZ的構(gòu)建 將重組蛋白DC3pep-SDZ氨基酸序列[1]中N端的DC3pep和與之相連的首個GGGG柔性短肽序列刪除,即獲得重組蛋白SDZ的氨基酸序列。采用參考文獻[1]中的方法,用ProtParam在線分析重組蛋白SDZ氨基酸序列理化性質(zhì)后將氨基酸序列轉(zhuǎn)化為核苷酸序列并優(yōu)化,構(gòu)建原核表達載體pET28a-SDZ并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)。

1.4.2 免疫原的制備 采用參考文獻[1]中的方法制備重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ。將pET28a-DC3pep-SDZ/BL21(DE3)和pET28a-SDZ/BL21(DE3)擴大培養(yǎng),于600 nm波長處檢測菌液的吸光度(Optical density,OD)約為0.5時,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo),6 h時采用SDS-PAGE分析誘導(dǎo)產(chǎn)物表達情況,Western blot鑒定誘導(dǎo)產(chǎn)物可溶性[封閉:5%脫脂奶粉4 ℃過夜;一抗:小鼠抗6×His單克隆抗體(1∶5 000),孵育90 min;二抗:山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶3 000),孵育60 min]。將上清中的產(chǎn)物利用親和層析鎳柱純化和超濾濃縮,采用SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物,超微量分光光度計測定重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ濃度并分別調(diào)整至1 mg/mL,置于4 ℃待用。

1.4.3 SS的復(fù)壯和鑒定 取復(fù)蘇的SS ZY05719、TJ1806和TJ0102接種于THB培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)后收集菌體,調(diào)整菌液濃度(ZY05719:3.5×1010CFU/mL、TJ1806:4.2×109CFU/mL、TJ0102:4.4×109CFU/mL)。隨機選取15尾斑馬魚,使用MS-222(55 μg/L)麻醉后隨機分為3個組:第1組、第2組和第3組,每組5尾,每尾分別腹腔注射10 μL ZY05719、TJ1806和TJ0102菌液,注射后12～24 h觀察斑馬魚發(fā)病情況,從瀕死斑馬魚腦內(nèi)分離細(xì)菌接種于THB平板并擴大培養(yǎng)。取菌懸液利用PCR擴增SS特異性莢膜基因cps,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL):cDNA 1 μL,2×ExTaqMix 10 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 7 μL;反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;30個循環(huán)(94 ℃ 1 min,55 ℃ 90 s,72 ℃ 1 min);72 ℃延伸 10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。

表1 SS cps基因引物信息

1.4.4 斑馬魚半數(shù)致死量(Median lethal dose,LD50)的測定 選取190尾斑馬魚隨機分為4個大組,包括3個試驗組(ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組)和PBS對照組,3個試驗組每組各60尾魚,PBS對照組10尾魚。每個試驗組再根據(jù)菌液稀釋梯度將斑馬魚隨機分為100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5組共6個小組,每小組10尾,麻醉后每尾腹腔接種10 μL與組名對應(yīng)的稀釋度的菌液(100組每尾斑馬魚接種ZY05719、TJ1806和TJ0102細(xì)菌數(shù)分別為1.9×109CFU、1.1×109CFU和1.4×109CFU);PBS對照組每尾腹腔接種10 μL PBS,按照Reed-Muench法[8]計算LD50。

1.4.5 重組蛋白免疫保護效果評價 選取180尾斑馬魚隨機分為3個大組,分別為重組蛋白DC3pep-SDZ組、重組蛋白SDZ組和PBS對照組,每組60尾。麻醉后3個大組斑馬魚每尾分別腹腔注射10 μL(500 mg/mL)重組蛋白DC3pep-SDZ、10 μL(500 mg/mL)重組蛋白SDZ和10 μL PBS。一共進行3次免疫,每次免疫間隔10 d。在第3次免疫后10 d,每個大組隨機分為3個小組(ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組),每個小組20尾魚,分別取5倍LD50劑量的ZY05719、TJ1806和TJ0102菌懸液以每尾10 μL的劑量分別腹腔注射攻擊3個小組,攻擊后連續(xù)觀察7 d,每日觀察斑馬魚存活情況,計算存活率。

1.4.6 斑馬魚腦組織病理學(xué)檢查 在ZY05719、TJ1806和TJ0102攻擊后24 h,隨機選取重組蛋白SDZ組、重組蛋白DC3pep-SDZ組和PBS對照組中被ZY05719、TJ1806和TJ0102攻擊的斑馬魚各2尾,取出腦組織置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h以上,參考Yang等[9]方法制作病理切片,H.E.染色后鏡檢觀察。

1.4.7 斑馬魚腦組織炎性細(xì)胞因子相對表達量檢測 在TJ1806攻擊后24 h,取重組蛋白SDZ組、重組蛋白DC3pep-SDZ組和PBS對照組斑馬魚腦組織,放入無RNase的EP管中,利用TRIzol法提取RNA,合成cDNA,RT-qPCR檢測白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、干擾素γ(Interferon gamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)mRNA的相對表達量。各炎性細(xì)胞因子基因序列參照參考文獻[10],引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物信息見表2。

表2 斑馬魚炎性細(xì)胞因子基因引物信息

RT-qPCR反應(yīng)體系(25 μL):2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 1 μL,添加RNase-free ddH2O至25 μL;反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;39個循環(huán)(95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s);60 ℃ 60 s,95 ℃ 30 s,60 ℃ 15 s。

1.4.8 統(tǒng)計分析 使用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用方差分析和卡方檢驗進行數(shù)據(jù)比較分析,數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05為差異性顯著,P<0.01為差異性極顯著,P<0.001為差異性極其顯著。

2 結(jié)果

2.1 免疫原的制備 本課題組前期構(gòu)建的重組蛋白DC3pep-SDZ分子式為C1429H2209N429O517S2,分子質(zhì)量為44 kDa,理論等電點(Isoelectric point,pI)為4.65,親水性總平均數(shù)(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.462,屬于親水性蛋白[1]。重組蛋白SDZ氨基酸序列理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,分子式為C1360H2116N410O500S2,分子質(zhì)量為42 kDa,pI為4.5,GRAVY為-0.4436,同樣屬于親水性蛋白。pET28a-SDZ/BL21(DE3)、pET28a-DC3pep-SDZ/BL21(DE3)誘導(dǎo)后蛋白大量表達(圖1A),重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ主要以可溶性蛋白表達于上清液中(圖1B和1C),將上清液純化后得到了高純度重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ(圖1D)。

圖1 重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ的表達、可溶性分析和純化鑒定

2.2 SS的復(fù)壯和鑒定 從瀕死斑馬魚腦內(nèi)分離的3株SS的PCR鑒定結(jié)果顯示,分別擴增出了SS2、SS3和SS9對應(yīng)的特異性cps基因,陽性條帶大小分別為557、1 273和300 bp(圖2)。

圖2 cps基因的PCR擴增

2.3 斑馬魚LD50的測定 結(jié)果顯示,ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組的最小菌液稀釋度的100組斑馬魚在感染SS 24 h內(nèi)已出現(xiàn)發(fā)病和死亡,死亡數(shù)在36 h內(nèi)達到高峰,10-1、10-2、10-3、10-4和10-5組斑馬魚則在96 h內(nèi)均陸續(xù)出現(xiàn)病變和死亡,PBS對照組斑馬魚無病變和死亡情況出現(xiàn)(表3),計算得出ZY05719、TJ1806和TJ0102對斑馬魚的LD50分別為8.71×104、1.1×106和4.47×105CFU。

表3 斑馬魚LD50測定結(jié)果

2.4 重組蛋白免疫保護效果評價 攻毒后7 d重組蛋白DC3pep-SDZ組、重組蛋白SDZ組和PBS對照組的斑馬魚存活率結(jié)果如圖3所示,PBS對照組所有斑馬魚48 h內(nèi)全部感染死亡,重組蛋白DC3pep-SDZ組和重組蛋白SDZ組中ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組3個小組存活率分別為50.0%、65.0%和60.0%,45.0%、47.3%和45.0%。重組蛋白DC3pep-SDZ組和重組蛋白SDZ組之間無顯著差異(P>0.05),但與PBS對照組相比較均差異極其顯著(P<0.001)。結(jié)果表明,重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ對SS2、SS3和SS9攻擊可以產(chǎn)生一定的交叉免疫保護力。

圖3 斑馬魚存活率

2.5 斑馬魚腦組織病理學(xué)檢查 PBS對照組(圖4A)被3株SS攻擊后腦組織均有紅細(xì)胞壞死、溶解并形成了不同程度的微血栓,且顆粒細(xì)胞層水腫,胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化,特別是ZY05719攻擊組的顆粒細(xì)胞層損傷較為嚴(yán)重,空泡數(shù)量明顯增多,TJ1806攻擊組的腦組織分子層明顯水腫、結(jié)構(gòu)松散紊亂,水平細(xì)胞和星形細(xì)胞數(shù)量減少;重組蛋白SDZ組(圖4B)中的ZY05719攻擊組的腦外顆粒層出現(xiàn)少量空泡;而重組蛋白DC3pep-SDZ組(圖4C)的ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組3個小組腦顆粒細(xì)胞層的細(xì)胞均沒有產(chǎn)生明顯的病變,細(xì)胞形態(tài)正常且顆粒層邊界清晰。結(jié)果表明,重組蛋白SDZ組對SS3和SS9攻擊產(chǎn)生了保護效果,重組蛋白DC3pep-SDZ對SS2、SS3和SS9攻擊均產(chǎn)生了一定的保護效果。

圖4 斑馬魚腦組織病理學(xué)檢測(H.E.染色,200×)

2.6 斑馬魚腦組織炎性因子相對表達量檢測 TJ1806攻擊后24 h,重組蛋白DC3pep-SDZ組促炎性細(xì)胞因子與PBS對照組相比較,IL-6、TNF-α和IFN-γmRNA表達量分別極顯著(P<0.01)、極其顯著(P<0.001)和極顯著(P<0.01)下調(diào),與重組蛋白SDZ組相比較,IL-6和TNF-αmRNA表達量分別極顯著(P<0.01)和顯著下調(diào)(P<0.05)(圖5A);重組蛋白DC3pep-SDZ組抗炎性細(xì)胞因子與PBS對照組相比較,IL-10和TGF-β1 mRNA表達量分別極顯著(P<0.01)和極其顯著(P<0.001)上調(diào),與重組蛋白SDZ組相比較,IL-10和TGF-β1 mRNA表達量分別不顯著(P>0.05)和顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5B)。結(jié)果表明,免疫重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ都能夠減輕斑馬魚感染SS3后的腦部炎癥反應(yīng),但重組蛋白DC3pep-SDZ減輕感染癥狀和緩解炎癥反應(yīng)的效果更好。

圖5 斑馬魚腦組織炎性細(xì)胞因子mRNA相對表達量

4 討論

斑馬魚是研究遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、血管生物學(xué)和疾病建模方面常用的模式動物,具有體型小、飼養(yǎng)成本較低、遺傳操作簡便、胚胎透明、發(fā)育周期全透明、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、發(fā)育迅速和易于管理操作等優(yōu)點[11-12]。由于斑馬魚對SS易感,Neely等[13]早先建立了SS斑馬魚感染模型,后來我國陸承平等[14]也采用單一純系A(chǔ)B斑馬魚作為動物模型研究SS的致病性并進行溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)對斑馬魚的免疫試驗。近年來,孔里程[15]將SS的三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、MRP和DLDH三個毒力因子的B細(xì)胞表位進行串聯(lián),原核表達后免疫斑馬魚,證實了多B細(xì)胞表位蛋白可以對斑馬魚機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,具有一定的保護作用?；诖?本試驗將構(gòu)建了含有B和Th細(xì)胞表位的靶向DC細(xì)胞重組蛋白DC3pep-SDZ免疫斑馬魚,評價重組蛋白DC3pep-SDZ對SS2、SS3和SS9的免疫保護效果。

在重組蛋白免疫保護效果評價試驗中,重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ對3種分型SS的感染都能表現(xiàn)出一定的交叉保護力,這驗證了本課題組前期篩選的保護性抗原SsnA、DLDH和ZnuA的B和Th細(xì)胞表位的有效性。在存活率計算和H.E染色試驗后,礙于對斑馬魚采血等技術(shù)操作限制,本試驗沒有檢測魚體相關(guān)抗體水平的變化,后續(xù)研究將把重組蛋白DC3pep-SDZ和佐劑混合制備亞單位疫苗,免疫小鼠和仔豬,采用計算存活率、檢測血清中特異性抗體水平、細(xì)胞因子濃度以及臟器和血液載菌量等方法全面評價亞單位疫苗DC3pep-SDZ的保護效果。

SS的細(xì)胞壁成分屬于病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMP)之一,能被Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)識別[16],激活DC信號傳導(dǎo)的同時觸發(fā)IL-6的分泌,從而引發(fā)機體炎癥[10]。在檢測SS3感染斑馬魚腦組織炎性細(xì)胞因子試驗中,重組蛋白DC3pep-SDZ組促炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-αmRNA表達量顯著低于重組蛋白SDZ組,表明了免疫靶向DC策略的重組蛋白相較于純表位重組蛋白可以更有效地緩解炎癥,此結(jié)果符合設(shè)想,但機制目前還不清楚。研究表明,斑馬魚感染SS2后可以通過刺激TLR2和髓樣分化因子(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號通路觸發(fā)促炎性細(xì)胞因子IL-6等的分泌,進而加深腦膜炎的炎癥反應(yīng)[10],因此后續(xù)研究還將檢測這些觸發(fā)炎性細(xì)胞因子表達的相關(guān)信號通路的變化,分析免疫靶向DC重組蛋白較非靶向DC重組蛋白更有效緩解炎癥反應(yīng)的相關(guān)機制。