舒脈膠囊干預大鼠髂動脈球囊損傷后的炎癥作用機制

郭 卉 呂春燕 焦琳茜 謝書睿 徐旭英

下肢動脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans,ASO)是常見的周圍血管病之一,該病是由于下肢動脈粥樣硬化斑塊形成導致血管內膜增厚、管腔狹窄或閉塞使得肢體供血不足而發生病變的一種疾病。ASO影響著全球超過2.3億成年人,是一個全球性的公共衛生問題[1]。其帶來的各種傷害嚴重影響了患者的生活質量,尤其是對身體功能的傷害,除此之外ASO高額的醫療費用對于患者來說更是雪上加霜[2]。介入術破環了血管原有的結構,導致新的理化反應,造成介入術后再狹窄的發生,其成因與內膜增生、血管彈力回縮、血栓形成和炎性反應息息相關[3]。其中核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是啟動炎性反應的關鍵因子,通過抑制NF-κB的活性來減少白細胞介素-6(interlenkin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α的產生,降低炎性反應[4,5]。前期研究表明舒脈膠囊能有效抑制大鼠髂動脈球囊損傷后血管內膜的增生,降低介入術后再狹窄發生的風險,然而其是否通過干預炎性反應以達到抑制血管內膜增生的目的尚未得到驗證[6, 7]。本研究采用大鼠髂動脈球囊損傷模型,探討舒脈膠囊干預大鼠髂動脈球囊損傷后的炎癥作用。

材料與方法

1.實驗動物:所有動物實驗和程序均經首都醫科大學附屬北京中醫醫院動物保護倫理學委員會批準(BJTCM-R-2021-11-02)。選取SPF級6周齡健康雄性SD大鼠18只,由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供,體質量為200±20g,飼養于SPF級動物室,溫度23～26℃,日溫差≤3℃,相對濕度40%～70%,房間空氣壓差梯度20～50Pa,12h明暗交替飼養,常規正常飲食,適應性飼養7天。動物生產許可證編號:SCXK(京)2019-0010。

2.藥物與試劑:舒脈膠囊(京藥制字Z20053323; 批號 2141201),主要成分:雞血藤、當歸、黃芪、丹參、枸杞子、首烏藤、川芎、山楂、制水蛭、山藥、陳皮、澤瀉、石菖蒲、玄參等,膠囊含原藥材0.4克/粒。肝素鈉購自北京索萊寶科技有限公司,注射用青霉素鈉購自山西省芮城縣紅寶獸藥有限責任公司,硫酸慶大霉素注射液購自上海全宇生物科技(駐馬店)動物藥業有限公司,戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司,生理氯化鈉溶液購自四川科倫藥業股份有限公司,4%多聚甲醛購自蘭杰柯科技有限公司。

3.儀器:1.5mm×15.0mm球囊購自廣東博邁醫療科技股份有限公司,指引導絲購自美國Boston Science公司,8-0非吸收性外科縫線和5-0非吸收性外科縫線均購自揚州富達醫療器械有限公司。石蠟包埋機、HistoCore MULTICUT切片機、全自動染色機、正置顯微鏡和掃片儀均購自德國Leica公司。

4.大鼠髂動脈球囊損傷模型分組:適應性喂養7天后,采用隨機數字表法將30只SD大鼠分為5組,分別為假手術組、模型組、舒脈膠囊低劑量組、舒脈膠囊中劑量組和舒脈膠囊高劑量,每組6只。

5.造模:假手術組大鼠沿左髂動脈走行逐層切開皮膚及組織并分離髂動脈和股動脈,其余各組均用球囊對大鼠髂動脈進行損傷以建立下肢動脈再狹窄模型。球囊損傷模型:術前無需禁食與禁水,用1%戊巴比妥鈉(50ml/kg)進行麻醉,尾靜脈用留置針注射肝素鈉溶液(100U/100g),可根據實驗進程需要補充注射肝素鈉溶液;沿大鼠左髂動脈走行依次切開皮膚層、筋膜層和肌肉層,分離并充分暴露股動脈,用眼科剪給股動脈做V型切口,導絲穿過球囊做指引進入股動脈中,將球囊送至腹主動脈后,用肝素鈉溶液作為擴充介質,給予6個大氣壓使得球囊擴張并且牽拉球囊至血管切口處,重復牽拉5次造成髂動脈內膜機械性損傷;撤出球囊及導絲,用8-0縫線縫合血管切口,5-0縫線逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚,慶大霉素溶液沖洗手術區域,腹腔注射青霉素40000U預防感染。

6.給藥:術后第1天,假手術組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃,每300g大鼠體質量給予1ml藥液,1次/天。根據《藥理實驗方法學》將成人每日服用劑量與大鼠劑量進行換算,所得劑量為大鼠中等劑量,將其1/2中等劑量定為低劑量,2倍中等劑量定為高劑量[6, 8]。舒脈膠囊低劑量組給予0.0324g/ml舒脈膠囊0.9%氯化鈉溶液灌胃,舒脈膠囊中劑量組給予0.0648g/ml舒脈膠囊0.9%氯化鈉溶液灌胃,舒脈膠囊高劑量組給予0.1296g/ml舒脈膠囊0.9%氯化鈉溶液灌胃。

7.取材:術后14天,1%戊巴比妥鈉(50ml/kg)進行麻醉,打開大鼠腹腔進行腹主動脈采血,離心機4℃下1940×g,離心15min,離心結束后取血清分裝凍存于-80℃冰箱。采血結束后,用0.9%氯化鈉溶液沖洗3遍后用4%多聚甲醛沖洗血管腔,穩定血管形態并迅速取出左髂動脈,將血管均勻分成兩份,其中一份血管放入4%多聚甲醛中進行固定,另一份放入液氮中保存后移至-80℃冰箱保存。

8.生存狀況及行為學觀察:實驗期間觀察各組大鼠生存狀況、行為活動、傷口愈合、感染情況及體征,根據疾病臨床表現以及Fontaine和Rutherford的分級和分類方法對大鼠術后狀態進行評估。

9.血管組織形態學觀察:標本石蠟包埋后進行彈力纖維染色,觀察血管組織形態。根據彈力纖維染色結果計算內膜面積、中膜面積和內膜面積/中膜面積。

10.ELISA法檢測血清IL-6水平:取大鼠血清,嚴格按照試劑盒說明書操作,檢測IL-6,計算樣本實際濃度。

11.免疫組化染色:觀察血管壁IL-6和NF-κB水平。每張切片選擇5個高倍視野(×400),分別計算血管內膜和中膜的IL-6和NF-κB p65的單位面積陽性平均光密度值。

12.蛋白免疫印跡:觀察血管組織中NF-κB含量。提取血管組織蛋白,進行蛋白定量后,完成電泳、轉膜、封閉及孵育抗體等操作,選取β-actin 作為內參,孵育一抗(NF-κB,1∶1 000;β -actin,1∶1 000)、二抗(HRP-Goat anti rabbit IgG,1∶10000),曝光后得到條帶,用Image J軟件進行分析灰度值。

13.統計學方法:應用SPSS 26.0與GraphPad Prism9.0進行統計學分析及做圖,結果采用單因素方差分析,組間比較選用Tukey法檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.各組生存狀況及行為學觀察結果:30只大鼠手術結束后,無死亡,無跛行,無紅腫,無滲出,創緣平整。術后第1天,30只大鼠進食量少;行動遲緩;術側皮色:各組術側下肢與各組健側下肢比較皮色較白;術側皮溫:各組術側下肢與各組健側下肢比較皮色較涼。術后第2天,活躍程度:假手術組>模型組=舒脈膠囊低劑量組=舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組;墊料濕潤度:假手術組>模型組=舒脈膠囊低劑量組=舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組;糞便色深淺:假手術組=模型組=舒脈膠囊低劑量組=舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組。術后第7天,各組活動如常;各組瘡面完全愈合;活躍程度:假手術組>舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組=模型組;墊料濕潤度:假手術組>舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組=模型組;糞便色深淺:舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組>模型組>假手術組;術側皮色白:模型組>舒脈膠囊低劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊高劑量組,假手術組皮色正常;術側皮溫低:除假手術組外,其余各組術側下肢與健側下肢相比皮溫較涼,模型組>舒脈膠囊低劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊高劑量組。術后14天,無跛行、壞疽及紅腫出現;活躍程度:假手術組>舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組>模型組;墊料濕潤度:假手術組>舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組>模型組;糞便色深淺:舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組>模型組=假手術組;術側皮色白:模型組>舒脈膠囊低劑量組>舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組,假手術組皮色正常;術側皮溫低:假手術組雙下肢皮溫正常,模型組>舒脈膠囊低劑量組>舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組。術后14天內,30只大鼠無明顯情緒變化,性情溫順。

2．血管形態學觀察:彈力纖維染色結果可見假手術組內膜光滑,無增厚現象;與假手術組比較,模型組血管內膜明顯增厚,管腔狹窄,舒脈膠囊低劑量組、舒脈膠囊中劑量組和舒脈膠囊高劑量組的血管內膜都有不同程度的增厚,詳見圖1。

圖1 各組大鼠左髂動脈橫斷面切片圖(彈力纖維染色)

術后第14天,與假手術組比較,模型組內膜面積明顯增加,差異有統計學意義(P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組內膜面積明顯增加,差異有統計學意義(P<0.01),舒脈膠囊中、高劑量組內膜面積明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05);模型組內膜面積/中膜面積明顯增加,差異有統計學意義(P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組內膜面積/中膜面積明顯增加,差異有統計學意義(P<0.001)。術后第14天,與模型組比較,舒脈膠囊低、中和高劑量組內膜面積增加減少,差異有統計學意義 (P<0.05);舒脈膠囊低劑量組內膜面積/中膜面積明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05);舒脈膠囊中、高劑量組內膜面積/中膜面積減少,差異有統計學意義 (P<0.001),詳見表1。

表1 各組彈力纖維染色內膜面積、中膜面積和內膜面積/中膜面積的比較

3.各組大鼠血清中IL-6水平比較:術后14天,與假手術組(20.22±4.75pg/ml)比較,模型組IL-6含量(692.56±130.28pg/ml)顯著升高,差異有統計學意義 (P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組IL-6含量(217.60±4.70pg/ml)升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,舒脈膠囊低劑量組、舒脈膠囊中劑量組(48.97±17.13pg/ml)和舒脈膠囊高劑量組(18.73±7.95pg/ml)IL-6含量降低,差異有統計學意義 (P<0.0001);與舒脈膠囊低劑量組比較,舒脈膠囊中、高劑量組IL-6含量降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

4.大鼠左髂動脈血管組織的免疫組織化學實驗結果:術后14天,與假手術組比較,模型組IL-6含量顯著升高,差異有統計學意義 (P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組IL-6含量升高,差異有統計學意義 (P<0.01),舒脈膠囊中劑量組IL-6含量升高,差異有統計學意義 (P<0.05);與模型組比較,舒脈膠囊低劑、中和高劑量組IL-6含量降低,差異有統計學意義 (P<0.0001);與舒脈膠囊低劑量組比較,舒脈膠囊高劑量組IL-6含量降低,差異有統計學意義 (P<0.05)。術后14天,與假手術組比較,模型組NF-κB含量顯著升高,差異有統計學意義 (P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組IL-6含量升高,差異有統計學意義 (P<0.05);與模型組比較,舒脈膠囊低、中和高劑量組IL-6含量降低,差異有統計學意義(P<0.0001),詳見圖2。

圖2 各組大鼠左髂動脈血管組織中的IL-6和NF-κB的免疫組織化學分析

5.大鼠左髂動脈血管組織中NF-κB蛋白表達比較:術后14天,與假手術組比較,模型組NF-κB蛋白含量顯著升高,差異有統計學意義 (P<0.001),舒脈膠囊低劑量組NF-κB蛋白含量升高,差異有統計學意義 (P<0.05);與模型組比較,舒脈膠囊中劑量組和舒脈膠囊高劑量組NF-κB蛋白含量降低,差異有統計學意義 (P<0.05),舒脈膠囊高劑量組NF-κB蛋白含量降低,差異有統計學意義 (P<0.01),詳見圖3。

圖3 各組大鼠左髂動脈血管組織中NF-κB比較

討 論

血管腔內手術治療能啟動炎性反應,炎性反應是介入術后再狹窄形成的重要原因之一。球囊擴張或支架置入導致斑塊破裂、內皮剝脫、中層撕裂,激活了循環中血小板和白細胞,從而激活了炎性反應。NF-κB是參與先天免疫和炎癥的關鍵轉錄因子家族,也參與腫瘤的發生和發展[9, 10]。細胞因子是炎性細胞釋放的主要信號分子,參與多種功能。促炎性細胞因子IL-6參與炎性分子的合成,與IL-6受體結合,導致NF-κB和JAKs-STAT途徑的激活[11]。NF-κB 的活化導致 NF-κB抑制劑的磷酸化和降解,隨后 NF-κB 的核易位和許多促炎趨化因子和細胞因子(如 IL-1、IL-6、IL-8和前列腺素E)的上調,進一步促進炎性反應[12]。NF-κB通路可加速細胞增殖,抑制細胞凋亡,促進細胞遷移和侵襲,誘導血管內膜增生,加速管腔再次狹窄[13,14]。

研究發現,舒脈膠囊能有效降低了血液中甘油三酯含量,增加下肢血液灌注量,建立側支循環,明顯改善肢體血流情況,抑制機體炎性反應的發生,降低再狹窄的風險,能有效緩解患肢寒涼、酸麻脹痛和間接性跛行等臨床癥狀[15～17]。舒脈膠囊的誕生離不開名老中醫房芝萱和王玉章在臨床上的辛勤耕耘,它是中醫智慧的結晶。舒脈膠囊由生黃芪、丹參、當歸、雞血藤、首烏藤、川芎、水蛭、桂枝、陳皮、山藥和元參等組成,組方以黃芪為君,取其補氣生血之效;當歸配元參為臣藥助力補益氣血;雞血藤、水蛭和首烏藤三藥相配為佐藥,疏通血脈。其組方之精妙是“補、生、通和活”四效皆有之,諸藥合用發揮健脾益腎、活血通絡之效,臨床治療下肢動脈硬化閉塞癥、下肢動脈介入術后再狹窄和下肢靜脈曲張都有著不錯的療效。

本研究發現,舒脈膠囊能有效減輕患者炎性反應,減低介入術后再狹窄發生的風險[17]。本研究結果顯示,舒脈膠囊能有效改善球囊損傷大鼠的肢體血運狀況,模型組的NF-κB p65表達與其余各組比較明顯增加,NF-κB p65活化后表達明顯增加。IL-6是NF-κB p65下游炎性細胞因子,在模型組的表達中也明顯增加,二者存在一致性。NF-κB p65和IL-6在舒脈膠囊低、中和高劑量組的表達明顯減少,各組間存在差異性。本研究結果顯示,舒脈膠囊抑制介入術后再狹窄炎性反應,其機制可能與干預NF-κB p65通路的活化有關,但相關靶點和具體機制需要更深入的研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。