低葉酸聯合甲氨蝶呤誘導神經管畸形胎鼠的神經組織轉錄組學分析

王 芳 李建婷 謝 秋 張 霆

神經管畸形(neural tube defects, NTDs) 是由于胚胎發育過程中神經管閉合不全引起的出生缺陷,主要表現為無腦兒、脊柱裂及腦膨出。NTDs發生率高,后果嚴重。流行病學研究表明,母親在孕期和圍孕期補充葉酸可以降低后代患NTDs的風險[1,2]。實驗研究證明,葉酸缺乏可通過影響胚胎表觀遺傳修飾的改變導致NTDs的發生,然而機制還不完全清楚[3,4]。小鼠的神經管閉合過程在細胞、組織、基因及代謝水平上與人類相似,是被用于研究NTDs的最廣泛的模式動物。本研究擬在前期建立的低葉酸聯合甲氨喋呤誘導NTDs小鼠模型的基礎上,檢測小鼠胚胎神經發育關鍵時期(受孕9.5天)腦組織和脊髓組織基因的表達變化,分析尋找差異表達基因及可能影響神經發育的差異轉錄因子基因,為進一步闡明葉酸預防NTDs的機制提供理論依據[5]。

材料與方法

1.實驗材料:采用物體特定病原體(SPF)級、6～8周齡的健康雌性ICR小鼠(體質量為18～22g)及健康雄性ICR小鼠(體質量為20～22g),均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。低葉酸飼料及正常飼料購自北京科澳協力飼料有限公司,甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)購自美國Sigma公司,0.9%氯化鈉溶液購自中國大冢制藥有限公司,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)購自美國Gibco公司,RNA文庫制備試劑盒(TruSeq RNA sample Preparation kit V2)購自美國Illumina生物技術公司,核酸片段篩選試劑盒(Agencourt SPRIselect Reagent Kit)和核酸純化試劑盒(Agencourt AMPure XP)購自美國Beckman Coulter公司,反轉錄酶(SuperScriptⅣ)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

2.NTDs胎鼠模型制備:將雌性小鼠分為正常飼喂組(對照組)與低葉酸聯合MTX誘導NTDs組(低葉酸聯合MTX實驗組),對照組的雌性小鼠及全部雄性小鼠均提供正常繁殖飼料喂養,低葉酸聯合MTX實驗組小鼠采用特制低葉酸飼料。小鼠喂養4周后,按雌雄比例2∶1交配過夜,于次日8:00時觀察到陰道栓,指定為受孕0.5天;受孕7.5天時以1.5mg/kg用量對低葉酸聯合MTX實驗組雌性小鼠腹腔注射MTX,對照組雌性小鼠使用等劑量0.9%氯化鈉溶液進行腹腔注射;至受孕9.5天,對妊娠小鼠實施頸椎脫白處死,取出胎鼠,詳細NTDs胎鼠模型建立方法參考課題組既往報道[5]。

3.組織樣本收集:取出胎鼠后置于預冷的PBS中,其中對照組選取發育正常胎鼠,低葉酸聯合MTX實驗組選取NTDs表型明顯的胎鼠,解剖其神經組織,自前腦嘴端至后腦微端,盡可能地分離中胚層或非神經組織,胎腦、脊髓組織分別收集于液氮中保存備用。

4.總RNA提取:采用TRIzol法提取總RNA,用DnaseⅠ消化DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測和Agilent 2100檢測RNA完整度;Nanodrop檢測RNA的濃度和純度。瓊脂糖凝膠電泳圖3條rRNA帶清晰可見,RNA完整性RIN≥6.5,RNA濃度≥100ng/μl,總量≥2μg,A260/A280為1.8～2.2。則RNA質量滿足建庫要求。提取的RNA于-80℃凍存,用于后續文庫制備和測序。

圖1 對照組和低葉酸聯合MTX實驗組受孕9.5天胎鼠外觀

圖2 低葉酸聯合MTX實驗組NTDs胎鼠腦組織DEGs

圖3 低葉酸聯合MTX實驗組NTDs胎鼠脊髓組織差異表達基因

5.文庫制備與測序:文庫制備以及測序由安諾優達基因科技(北京)有限公司完成。cDNA文庫的構建方法參照美國Illumina生物技術公司的樣品制備試劑盒說明書,文庫構建完成后使用Qubit3.0和Agilent 2100分別檢測文庫濃度與文庫片段長度。濃度>5ng/μl,且片段長度集中為300～400bp,為庫檢合格。利用Illumina HiSeq2500平臺,以2×150bp雙端測序模式進行高通量測序,并使用TrimGalore法對原始測序數據過濾,得到高質量的Clean Data。使用HISAT2軟件將過濾和質量控制后的序列和參考基因組進行比對,利用FPKM(Fragments per Kilobase per Million Mapped Fragments)方法對已知的基因和轉錄本進行表達定量。

6.差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)分析:采用DESeq軟件分析低葉酸聯合MTX實驗組與對照組的差異表達基因。Type為篩選結果,滿足P<0.05且|log2(fold change)|>1的為差異基因。其中log2(fold change) >1標記為上調基因(up);log2(fold change)<-1標記為下調基因(down),不滿足上述條件的為非顯著差異表達基因。

7.差異表達基因的GO (gene ontology)分析:基于篩選出的DEGs,采用R包 cluster Profiler對差異表達基因進行基因功能分類分析,來全面描述生物體中基因和基因產物的屬性。GO是國際標準化的基因功能分類體系,GO總共有3類,分別描述基因的生物學過程(biological process, BP)、細胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)。本研究按照此3類對差異表達基因進行篩選。

8.差異表達轉錄因子基因分析:轉錄因子(transcription factor,TF)是一群能與基因5′-端上游特定序列專一性結合,從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子。選取篩選出的DEGs,通過與動物物種AnimalTFDB(Animal Transcription Factor DataBase)比較,預測DEGs是否是差異表達轉錄因子基因,以及所屬的轉錄因子家族。

9.統計學方法:應用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行統計分析。組間均數比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.低葉酸聯合MTX誘導小鼠NTDs模型構建情況:通過對適齡母鼠喂養低葉酸飼料,并在受孕7.5天時對母鼠進行腹腔注射MTX,可成功誘導出具有明顯NTDs表型的胎鼠。受孕9.5天取出胎鼠,通過體式顯微鏡觀察可見:對照組胎鼠外觀上較為飽滿圓潤,各腦室發育良好,神經管已完全閉合;低葉酸聯合MTX實驗組表現出脊柱裂、腦裂等,提示NTDs的表型,詳見圖1。

2.低葉酸聯合MTX實驗組NTDs胎鼠的腦組織基因表達分析:對低葉酸聯合MTX實驗組和對照組的胎鼠腦組織轉錄組分別進行測序、分析,使用DESeq軟件確定DEGs。結果顯示,低葉酸聯合MTX實驗組與對照組比較,共有939個DEGs,其中406個顯著上調,533個顯著下調,P<0.05,DEGs火山圖詳見圖2A。

從BP、CC和MF 3類對差異表達的上調和下調基因進行篩選、分析,結果顯示按CC分類,上調的基因主要是細胞、細胞器及蛋白復合物的基因,下調的基因主要是細胞、細胞器及細胞膜的基因,下調的基因和上調的基因在該分類基本一致;按BP分類,上調的基因主要是細胞過程、生物調節、發育過程及代謝過程的基因,下調的基因和上調的基因在該分類基本一致;按MF分類,上調的基因主要是蛋白結合、轉錄調節活性、分子功能調節因子及催化活性的基因,下調的基因和上調的基因在該分類一致,詳見圖2B。

差異轉錄因子分析顯示,篩選出的DEGs,通過與Animal TFDB數據庫比較,預測腦組織中有191個基因屬于差異表達轉錄因子基因,其中104個顯著上調,87個顯著下調,P<0.05,通過與蛋白家族比對,發現轉錄因子主要聚焦在Homeobox、zf-C2H2、bHLH、STAT等家族,結果詳見圖2C。

3.低葉酸聯合MTX實驗組NTDs胎鼠的脊髓組織基因表達分析:對低葉酸聯合MTX實驗組和對照組的胎鼠脊髓組織轉錄組分別進行測序、分析,使用DESeq軟件確定DEGs。結果顯示,低葉酸聯合MTX實驗組與對照組比較,共有879個DEGs,其中268個顯著上調,611個顯著下調,P<0.05,DEGs火山圖詳見圖3A。

從BP、CC和MF3類對差異表達的上調和下調基因進行篩選、分析,結果顯示按CC分類,上調和下調的基因主要是細胞、細胞器及蛋白復合物等的基因;按BP分類,上調和下調的基因主要是細胞過程、生物調節及發育過程的基因;按MF分類,上調和下調的基因主要是蛋白結合、轉錄調節活性、分子功能調節因子及催化活性的基因。脊髓組織DEGs與腦組織的基本一致,詳細結果詳見圖3B。

差異轉錄因子分析顯示,脊髓組織中有195個基因屬于差異表達轉錄因子基因,其中41個顯著上調,154個顯著下調,P<0.05,通過與蛋白家族比對,發現轉錄因子主要聚焦在zf-C2H2、bHLH、Homeobox、STAT等家族,結果詳見圖3C。

4.低葉酸聯合MTX實驗組NTDs胎鼠的腦和脊髓組織DEGs比較分析:比較兩種組織中的DEGs發現,9.5天的NTDs胎鼠的腦組織和脊髓組織的DEGs分別有939、879個,其中有185個DEGs同時在腦組織和脊髓組織中的轉錄表達受到影響。對比兩種組織中預測的差異轉錄因子發現,在腦組織和脊髓組織中分別有的191、195個差異轉錄因子中,有31個為相同的轉錄因子,結果詳見圖4。

圖4 低葉酸聯合MTX實驗組NTDs胎鼠的腦和脊髓組織DEGs對比圖

討 論

葉酸在體內經酶催化生成活性的四氫葉酸,四氫葉酸作為一碳基團轉移酶的輔酶,參與堿基的合成、氨基酸之間的相互轉化以及DNA和蛋白質等多種物質的甲基化,進而影響體內多種與發育相關的基因和通路的調控。胎兒早期生長發育中,對核酸和蛋白質的合成需求最為旺盛,這一階段如果葉酸缺乏,對胎兒發育的影響更為嚴重。

MTX作為抗葉酸類抗代謝藥,可抑制有生理活性的四氫葉酸合成。本研究使用的小鼠模型采用低葉酸飲食喂養,模擬動物體內低葉酸的生理環境,神經管閉合關鍵期在孕鼠腹腔注射MTX,既排除了單純葉酸缺乏飼喂并不能導致小鼠NTDs的不足,又排除了單純NTX誘導小鼠NTDs不能更好模擬體內葉酸缺乏生理狀態的缺陷[5]。因此在該動物模型基礎上檢測胚胎神經發育關鍵時期腦組織和脊髓組織基因的表達變化,對推論低葉酸環境可能影響人胚胎期神經組織發育的功能基因及轉錄因子的參考意義較大。

本研究選取受孕9.5天胎鼠腦組織和脊髓組織,轉錄組測序結果直接反映了神經管發育當時基因轉錄表達變化,而不是神經管發育完成狀態下的情況。通常小鼠神經管發育時期為7.5～10.5天。從受孕7.5天開始出現神經板;受孕8天,后腦和頸部交界的第一閉合點以拉鏈方式同時向頭側方向和尾側方向進行,分別形成將來的腦和脊髓;受孕9天,位于中前腦和中腦的第二閉合點向頭尾兩端閉合;位于前腦喙末端的第三閉合點單向閉合[6]。本研究在受孕7.5天通過腹腔注射MTX進行誘導NTDs,并在受孕9.5天可以觀察到神經管正常完整發育外觀以及畸形外觀時取材,能更準確反映發育階段的即時情況。與同類型畸形胎鼠研究取材時間10.5、11.5、13.5天比較,能更好地反映發育當時的情況[4,7,8]。

RNA-seq結果顯示,低葉酸聯合MTX實驗組轉錄組學發生明顯改變,DEGs功能主要與神經細胞發育、轉錄調節有關。腦組織DEGs功能不論是按BP、CC還是MF進行分類,DEGs的上調和下調基因出現同時富集在同一生物學功能的情況,說明該生物學功能的基因出現了表達的紊亂。脊髓組織DEGs功能在各分類中結果與腦組織的相似。該結果反映出低葉酸聯合MTX同時影響胎鼠腦組織和脊髓組織的發育,并且產生了相似的影響。

葉酸代謝對細胞中發生的甲基化反應至關重要,包括DNA和組蛋白甲基化。DNA甲基化是由葉酸代謝產生的一碳基團作為甲基供體來源,可以調控基因的表達及沉默,參與胚胎發育及多種疾病的進展,是表觀遺傳修飾研究中最廣泛、最具特征的一類。組蛋白甲基化也是葉酸代謝產生的一碳基團作為甲基供體來源,研究表明大量與組蛋白H3第79位賴氨酸二甲基化(H3K79me2)相結合的基因處于轉錄激活的狀態,H3K79me2對基因的轉錄調控發揮著激活作用[9]。在全基因組范圍內有280個發育相關的基因在人胚胎干細胞中接受H3K79me2的調控。研究還表明,葉酸還可以影響組蛋白乙酰化水平,從而影響下游基因的轉錄和表達[10]。因此葉酸通過表觀遺傳修飾作用對基因的轉錄和表達的影響相當廣泛。在本實驗研究中,實驗組與對照組比較,腦、脊髓組織基因轉錄組分別有939、879個DEGs,受影響的基因數量較多。其中分別有191、195個基因屬于差異表達轉錄因子基因。

在腦組織和脊髓組織的差異表達轉錄因子基因中,通過與蛋白家族比較,發現轉錄因子主要聚焦在zf-C2H2、bHLH、Homeobox、STAT等轉錄因子家族。因轉錄因子家族涉及到轉錄因子數量較多,還需要后續進一步深入的研究。課題組的另一項通過抑制葉酸代謝物參與DNA合成誘導小鼠NTDs的研究結果發現,bHLH 家族的一員Hes3表達異常,同時有研究發現,該轉錄因子與神經管的發育密切相關[11,12]。本研究僅是在低葉酸飼喂聯合MTX誘導的小鼠NTDs模型的基礎上,對可能影響的神經組織發育的功能基因及轉錄因子的初步探索,可為NTDs發生機制的研究提供思路。

綜上所述,低葉酸聯合MTX能夠引起胎鼠神經組織基因組的轉錄改變,DEGs主要是以神經細胞發育、轉錄調節基因為主,葉酸可能通過調節功能相關基因的表達來影響胚胎神經組織的發育,但其具體機制尚有待于進一步探討。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。