納米顆粒介導(dǎo)冷凍消融治療腫瘤的研究進(jìn)展

王輔明， 楊繼金

冷凍消融術(shù)是一種常見的腫瘤微創(chuàng)治療方式，具有手術(shù)操作簡單，花費較少，術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)勢，對于一些中晚期腫瘤患者還可以聯(lián)合其他治療手段實現(xiàn)綜合治療［1-3］。冷凍消融術(shù)發(fā)展至今仍然存在腫瘤細(xì)胞殺滅不徹底、復(fù)發(fā)率高、可能損傷周圍正常組織以及具有爭議性的安全消融邊緣等問題。 如何盡可能殺死消融區(qū)域內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，又盡量減少損傷周圍正常組織，是冷凍消融術(shù)進(jìn)一步發(fā)展亟待突破的難點。 隨著納米科學(xué)的迅猛發(fā)展，大量研究表明將特異性的納米顆粒通過不同方式加載到消融靶區(qū)，可以顯著提高該冷凍效率或保護(hù)周圍正常組織，通過調(diào)整納米顆粒的分布和濃度，可以實現(xiàn)操縱消融區(qū)域的形狀以確保可以完全消融腫瘤，同時實現(xiàn)靶向投遞各種藥物，增強顯像能力等。 本文主要回顧幾種常見的應(yīng)用于介導(dǎo)冷凍消融術(shù)的納米顆粒及主要作用機(jī)制，有助于更加全面地了解這種治療模式，為以后的實驗研究以及再下一步實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化打牢基礎(chǔ)。

1 納米顆粒介導(dǎo)冷凍消融的主要作用機(jī)制

中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所低溫生物醫(yī)學(xué)實驗室于2004 年率先提出了納米冷凍手術(shù)這個概念，并一直致力于相關(guān)納米材料的開發(fā)研究［4］。介導(dǎo)冷凍消融的納米材料按照基質(zhì)類型大致可分為4大類：金屬、有機(jī)物、液態(tài)金屬和復(fù)合材料。 主要作用原理為向目標(biāo)區(qū)域加載不同功能的納米顆粒，實現(xiàn)以下幾個目的：①提升冷凍效率，擴(kuò)大有效消融范圍，保護(hù)周圍健康組織；②負(fù)載各種藥物，靶向投遞到目標(biāo)區(qū)域，聯(lián)合其他治療手段；③充當(dāng)圖形增敏劑，提高消融過程中圖像的精準(zhǔn)度。 主要作用機(jī)制為：

1.1 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，改變滲透性

冷凍消融治療過程中細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成可以誘導(dǎo)細(xì)胞脫水、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)相變從而殺死活細(xì)胞［5-6］。在冷凍過程中臨界冰核是冰晶形成的關(guān)鍵初始步驟，Bai 等［7］的實驗研究認(rèn)為，小于臨界冰核（8 nm）的氧化石墨烯納米材料抑制冰晶的形成，而大于臨界冰核（11 nm）的氧化石墨烯納米片則促進(jìn)冰晶的生長。 因此納米顆粒的尺寸大小對冰晶的生長速率具有重要意義，同時還需要考慮納米顆粒的表面積， 這和納米顆粒的熱傳遞能力直接相關(guān)，金屬納米顆粒通常會比其他類型的納米材料熱導(dǎo)率更高。 納米顆粒由于EPR 效應(yīng)（實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)）而聚集在腫瘤組織周圍并進(jìn)入細(xì)胞，可以有效增加細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的效率。 金、銀、氧化鎂以及四氧化三鐵等納米顆粒均可以通過充當(dāng)冰結(jié)晶的核來提高細(xì)胞內(nèi)、外冰晶的形成速率，另外四氧化三鐵納米顆粒在冷熱循環(huán)后， 除了可以增加冰晶的形成還能明顯提高細(xì)胞脫水的發(fā)生率［8-9］。不同的金屬納米材質(zhì)、尺寸、形狀都會影響冷凍效率的改變。 利用這些納米顆粒增強冰晶生長的能力，同時配合應(yīng)用具有低熱傳遞效率的聚合物或脂質(zhì)納米顆粒（例如相變材料），或者具有低溫保護(hù)作用的二甲基亞砜的水懸浮液，可以實現(xiàn)操縱冰球的生成形狀，可以完全覆蓋不規(guī)則形狀的腫瘤，同時最大限度保護(hù)周圍正常健康組織［10-12］。 冰晶的形成和生成形狀跟納米材料表面的官能團(tuán)也有關(guān)系，官能團(tuán)的位置不同，納米顆粒既可以表現(xiàn)為增強也可以表現(xiàn)為抑制冰晶的生長，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)形成鋒利的冰晶可以直接損傷細(xì)胞器和細(xì)胞膜，有利于提高冷凍效率。 殼聚糖修飾的纖維素納米材料（CS-CNC）對比其他納米顆粒表現(xiàn)出更高的冷凍性能，就是因為其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)形成了細(xì)長銳利的冰晶［13］。 冷凍過程中細(xì)胞是否發(fā)生壞死和冰結(jié)晶過程中細(xì)胞膜的流動性和滲透性密切相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外結(jié)晶時，細(xì)胞膜的滲透梯度失去平衡而出現(xiàn)致死性的脫水［14］。 在細(xì)胞中普遍存在一種水通道蛋白，可以一定程度平衡細(xì)胞滲透性的改變，當(dāng)體內(nèi)細(xì)胞遭遇低溫時會形成更多的水通道蛋白，以適應(yīng)細(xì)胞低溫過程中滲透性的改變。 很多癌細(xì)胞都存在水通道蛋白，水通道蛋白過度表達(dá)也被認(rèn)為是腫瘤不良預(yù)后的指標(biāo)之一。 因此一些納米材料具有水通道蛋白抑制劑的功能，可以有效的輔助冷凍消融手術(shù)，增強冷凍消融的效率［15］。 另外一些特定尺寸和電荷的納米顆粒可以通過物理結(jié)合吸附在細(xì)胞膜上從而改變膜的性能，改變其流動性和滲透性，從而增加細(xì)胞對低溫的敏感性。 納米顆粒本身的親水性或者疏水性也可以直接影響細(xì)胞膜的滲透性，比如兩親性的金納米顆粒能夠嵌入腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)雙層內(nèi)并直接影響膜局部滲透性［16-17］。

1.2 負(fù)載其他藥物，實現(xiàn)綜合治療

基于納米顆粒可修飾的特性，可以設(shè)計各種納米顆粒負(fù)載各種藥物進(jìn)行靶向遞送，使得目標(biāo)區(qū)域達(dá)到有效藥物濃度，完成治療目的同時避免出現(xiàn)全身不良反應(yīng)。Goel 等［18］的研究認(rèn)為通過用TNF-α 和硫醇衍生的聚乙二醇標(biāo)記的金納米顆粒選擇性地將TNF-α 遞送至腫瘤，可以顯著提高冰球內(nèi)細(xì)胞致死溫度的閾值，幾乎可以完全殺死冰球范圍內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，也減少了TNF-α 的全身毒性作用。 針對腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的化學(xué)耐藥性，饒偉團(tuán)隊研究負(fù)載有阿霉素的gnDOX 納米顆粒， 冷凍消融過程中低溫響應(yīng)確保了藥物的緩釋，展示了克服腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的化學(xué)耐藥性，顯著提高乳腺癌整體治療效率的強大潛力［19］。Wang 等［20］合成的HCPN-CG 低溫響應(yīng)納米顆粒負(fù)載化療藥物伊立替康和光熱劑吲哚菁綠，在低于12℃的環(huán)境下釋放伊立替康，光熱劑吲哚菁綠在近紅外激光照射下實現(xiàn)復(fù)溫， 該研究模擬冷凍消融的凍融過程， 實驗表明在體內(nèi)外均能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞生長。新型納米材料，比如具有相變特性的液態(tài)金屬（例如熔點約為29.8℃的鎵），低溫時液態(tài)到固態(tài)的相變過程增加導(dǎo)熱性，而且鎵納米顆粒尖銳的突起可以直接刺破腫瘤細(xì)胞，利用液態(tài)金屬平臺建立“冰”（冷凍消融）和“火”（光熱療法）的雙重?zé)o創(chuàng)療法，針對黑色素瘤治療取得重大研究進(jìn)展［21］。 由于冷凍消融是一種基于低溫的消融手段，更有可能保留抗原的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并激活全身免疫效應(yīng)，這已經(jīng)是臨床醫(yī)師達(dá)成的共識［22-25］。 最近的研究還發(fā)現(xiàn)一些帶有各種官能團(tuán)（例如羧基、羥基或胺等）的納米材料，可以從消融的腫瘤細(xì)胞中捕獲腫瘤相關(guān)抗原和DAMPs（損傷相關(guān)的分子模式），并遞送到抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)而到達(dá)淋巴結(jié)激活T 細(xì)胞［22，26-28］。 如何將冷凍消融與免疫治療有效聯(lián)合，一直是臨床研究冷凍消融術(shù)的熱點，而通過納米顆粒實現(xiàn)聯(lián)合免疫治療的相關(guān)研究目前幾乎沒有。

1.3 增強顯像功能，實現(xiàn)多模態(tài)成像

納米技術(shù)很早就被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)影像學(xué)領(lǐng)域，圖像顯示更加清晰，支持三維動態(tài)成像的同時可以充分獲得目標(biāo)組織的功能影像［29］。 氧化鐵納米顆粒具有光學(xué)、磁性、聲學(xué)和結(jié)構(gòu)特性，早已作為圖像增敏劑被應(yīng)用于MRI［30-31］。 納米顆粒因為EPR 效應(yīng)停留在腫瘤區(qū)域，有著相較于其他小分子造影劑半衰期更長的優(yōu)勢。 在冷凍消融治療過程中，能否清晰看到腫瘤邊緣對于實現(xiàn)完全消融至關(guān)重要。 金屬納米顆粒除了具有調(diào)節(jié)冷凍效率的功能，在臨床應(yīng)用中還被廣泛研究作為CT 成像的造影劑［22，32-35］，其他非金屬類型的納米顆粒則可以通過負(fù)載造影劑（例如釓、碘油）來增強顯像能力。 除了傳統(tǒng)的影像成像方式之外，非傳統(tǒng)的成像方式，例如NIR（近紅外光）、熒光成像或使用金納米顆粒的表面增強拉曼散射，目前被認(rèn)為也是可行的，而且具有更好的時空分辨率、靈敏度和信號特異性。 一些復(fù)合的納米顆粒還可以表現(xiàn)出多模態(tài)的顯像增強， 雙金屬納米顆粒（例如氧化鐵- 金納米顆粒）可以同時增強MRI 和CT 的顯像功能，負(fù)載釓和黑色素的二氧化硅納米顆粒可以同時實現(xiàn)增強MRI 和熒光成像［36］。另外納米顆粒可以通過配體修飾， 目前研究普遍采用葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子受體（EGFR）和糖蛋白從而獲得特異性的靶向結(jié)合特定腫瘤細(xì)胞的能力［37］。殼聚糖修飾的纖維素納米顆粒（CS-CNC），具有特異性結(jié)合CD44 抗原的能力， 研究表明可以明顯增強對于CD44 抗原高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的冷凍效率［13］。目前大量復(fù)合功能的納米顆粒不斷在被研究開發(fā)應(yīng)用到冷凍治療中，既可以增強冷凍效率，又能提高成像能力，這對于實現(xiàn)腫瘤的完全消融，尤其對于特殊位置的病灶尤為重要［38-39］。

2 小結(jié)與展望

當(dāng)前的研究表明，納米顆粒介導(dǎo)冷凍消融的治療模式已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是仍然處于初級階段，普遍停留在體外細(xì)胞實驗、動物模型實驗等，鮮有相關(guān)的臨床試驗研究報道。 制約這種手術(shù)模式實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的主要原因在于：①這些納米顆粒的加載方式一般為直接穿刺或者靜脈注射，腫瘤周圍豐富的血供必然會帶走部分納米顆粒，納米顆粒靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞能力目前也不盡如人意，因此在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)納米顆粒很難形成滿意的分布濃度和精準(zhǔn)度；②使用納米顆粒后的增益效果缺乏詳盡的機(jī)制研究，大量實驗研究結(jié)果均表現(xiàn)出納米顆粒帶來的明確增益效果，但是普遍缺乏詳盡的機(jī)制層面的研究，主要關(guān)注的是納米顆粒介導(dǎo)的降溫速率或者細(xì)胞致死溫度閾值的變化，對于納米顆粒本身直接影響細(xì)胞、組織的機(jī)制研究不夠；③納米顆粒的生物相容性以及毒性仍然不確定，納米顆粒能否投入臨床應(yīng)用首先需要考慮生物相容性和毒性問題，對于一些金屬為基質(zhì)的納米顆粒，過量金屬離子長期滯留機(jī)體可能會帶來潛在風(fēng)險。 最新生物可降解納米材料氧化鎂和天然纖維素納米顆粒的出現(xiàn)在一定程度上解決了生物相容性和毒性的問題，進(jìn)一步研究有望在下一步可以嘗試推向臨床試驗。

基于納米材料的設(shè)計和合成構(gòu)建的腫瘤靶向診療一體化納米平臺，是當(dāng)前乃至未來一段時間腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。 冷凍消融術(shù)是一種依賴精準(zhǔn)的影像引導(dǎo)的局部治療手段，通過多功能的納米材料可以完美融入腫瘤診療一體化體系，多模態(tài)成像有助于準(zhǔn)確顯示腫瘤邊緣幫助實現(xiàn)完全消融，同時可以聯(lián)合光熱療法、光動力療法、磁熱療法、化學(xué)藥物療法等實現(xiàn)綜合治療。 多種成像模式的相互補充，多種治療手段的相互聯(lián)合，最大程度發(fā)揮各自優(yōu)勢，彌補劣勢，從而實現(xiàn)有效精準(zhǔn)治療腫瘤的目的。

隨著納米科學(xué)的迅猛發(fā)展，各種新型多功能的納米顆粒層出不窮，如何更好地應(yīng)用于介導(dǎo)冷凍消融，需要我們繼續(xù)致力于提高納米顆粒腫瘤靶向性和示蹤性的研究，提高特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力是納米顆粒發(fā)揮其效能的保證，而示蹤性不僅僅局限于傳統(tǒng)影像學(xué)圖像的增強，可以更多研究聯(lián)合熒光、近紅外光成像等其他成像模式，更進(jìn)一步在未來可以嘗試融合AI 識別， 實現(xiàn)智能規(guī)劃冷凍針的穿刺路徑和置針方案。 另外，構(gòu)建能準(zhǔn)確模擬人體不同器官結(jié)構(gòu)和組織成分的體外模型，對于驗證納米顆粒的效能至關(guān)重要，是基礎(chǔ)實驗研究到臨床試驗最后實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的橋梁，這也是我們下一步實驗研究需要積極努力突破的課題之一。

綜上所述，納米顆粒介導(dǎo)冷凍消融作為一門跨學(xué)科領(lǐng)域，如何能夠?qū)⑦@種治療模式真正實現(xiàn)應(yīng)用于臨床，突破冷凍治療的應(yīng)用瓶頸，需要多個學(xué)科領(lǐng)域的共同努力。 隨著研究的不斷深入，相信在不遠(yuǎn)的未來一定會給腫瘤治療帶來新的希望。