可視化微球研究進展

楊延杰， 馬靖嶔， 顏志平

在過去的數(shù)十年里，微球作為一種新的栓塞材料進入了人們的視線。 微球本身可以直接作為栓塞材料進行栓塞治療，也可以搭載化療藥物制成載藥微球，還可以搭載放射性核素進行選擇性內放射治療。 目前臨床上使用的微球材料大多是高分子聚合物，由于這些材料都無法在X 線照射下顯影，所以在進行經(jīng)血管途徑的介入手術時無法在數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）下觀察到微球在血管中的分布， 術后也無法通過CT 觀察微球在體內的分布。 同時，由于微球體積過小，術后在超聲上也無法觀察微球在體內的分布。 除此以外，由于微球不含氫原子，術后也無法通過MRI 觀察到微球在體內的分布。 這些都加大了介入放射科醫(yī)師經(jīng)血管途徑栓塞治療的難度，同時也無法對栓塞后微球的分布進行有效評估。 目前針對微球可視化已經(jīng)有學者進行了諸多探索，本文就微球可視化的方法展開論述。

1 微球概述

微球呈球形，表面光滑，大小均一，并具有獨特的網(wǎng)狀結構，其粒徑一般在30～1 200 μm 之間［1-2］。在臨床上，微球可以有效阻斷靶血管的血流，使病灶血管被阻斷從而缺血壞死，或者栓塞異常出血的血管達到止血的目的。 制備微球的載體材料很多，主要分為合成聚合物和天然材料：合成聚合物包括聚乙二醇、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、聚乳酸-羥基乙酸等；天然材料包括淀粉、海藻酸鹽、卡拉膠和紋狀芽孢桿菌等［2］。微球因為其表面光滑、不易聚集、粒徑統(tǒng)一，具有壓縮性、彈性和一定硬度，較大的比表面積利于負載藥物等優(yōu)點成為最常用的栓塞材料之一［3］。

以肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization， TACE）為例，與傳統(tǒng)碘化油乳劑能進入腫瘤組織內不同， 微球只能栓塞腫瘤血管。研究發(fā)現(xiàn)，越近腫瘤末梢血管栓塞效果越好，所以介入放射科醫(yī)師應根據(jù)不同腫瘤血管和不同血供程度選擇不同粒徑微球［4］。 從動物實驗和臨床經(jīng)驗來看［5］，與碘化油相比，相對獨立的微球減少了聚集，分布更加均勻且有規(guī)律［6］。傳統(tǒng)的TACE 中液態(tài)碘化油混合化療藥物而成的乳化液存在的乳化不均勻、瘤內存留時間較短等缺點，而載藥微球可以吸附藥物和實現(xiàn)緩釋，具有良好的懸浮性和生物相容性。 實驗研究表明，含載藥微球的TACE 具有安全的藥代動力學特性，并能在動物模型中有效殺傷腫瘤［7］。除了上述微粒類栓塞材料外，還有具有放射性核素的內照射微球， 如釔-90 微球可以輻射β 射線，近距離殺死腫瘤細胞［4］。

2 微球示蹤

微球不能在DSA 下直接顯影，只能將造影劑與微球懸浮液混合以監(jiān)測和間接引導栓塞［8］。 簡單地將造影劑與微球混合缺乏一級鍵的形成，這樣會導致造影劑的泄漏， 不僅會損害微球的物理力學性能，還會導致全身毒性或非靶點栓塞等并發(fā)癥［9］。此外，懸浮液中的造影劑雖然可視，但也不能準確反映靶組織內微球和藥物的最終分布，因為造影劑在血液中有流動性和分散性［10-11］。 盡管使用微球栓塞的療效得到了臨床的普遍認可，但由于無法實時監(jiān)測載藥微球的栓塞過程，這可能會對栓塞效果造成一定的影響。 所以將顯影材料融入微球本身，才可能會有更準確的栓塞和藥物的空間定位。

據(jù)臨床醫(yī)師的經(jīng)驗推測，在栓塞過程中使用直接可視化微球（無論是空白微球，還是載藥微球）將提供許多技術優(yōu)勢。 首先，通過常規(guī)X 線透視或CT成像等可直觀了解可視化微球在體內靶器官內的真實空間分布。 這使得可視化微球可作為一種研究工具，在不進行病理組織學分析的情況下獲取微球的真實空間分布信息，這些信息可以讓介入科醫(yī)師更好地理解栓塞生物學以及特定栓塞技術對微球空間分布的影響［6］。其次，通過了解靶器官內微球的空間分布，可以讓術者在手術過程中獲得有用的實時術中反饋，幫助優(yōu)化栓塞過程或者達到理想的栓塞終點。 在載藥微球裝載造影材料的情況下，化療藥和造影劑包含在微球中并隨著時間的推移緩慢釋放，可以提供關于微球分布和靶組織內預期局部藥物濃度的有用信息，以指導后續(xù)治療。 例如，對于劑量不足的組織或者部位后續(xù)可以再次靶向補充給藥。 可視化微球的這些優(yōu)點可以優(yōu)化、個性化以及改進血管栓塞技術，這與顏志平等［4］學者提出的精細栓塞理念不謀而合。

3 微球可視化示蹤技術

3.1 磁共振成像（MRI）可視化微球

MRI 因其高組織分辨率和無電離輻射的特點，作為DSA 的一種可能的部分替代或輔助成像方式受到越來越多的關注［12］。 MRI 造影劑的作用是增加其周圍組織水分子中氫質子的弛豫速率，通過引入造影劑可以顯著增強靶向目標區(qū)域與組織背景的對比，從而提高成像靈敏度。 制備MRI 成像可視化微球， 主要是通過在微球的基材中加入順磁性、超順磁性物質，賦予微球一定MR 對比性。 順磁性物質主要指一些鑭系元素，而超順磁性物質多為鐵氧化物。

3.1.1 超順磁性物質標記 隨著納米生物醫(yī)學的發(fā)展，納米氧化鐵作為MR 顯影劑已經(jīng)被批準臨床使用。 Gupta 等［13］將納米氧化鐵顆粒包埋于玻璃微球中，使用導管將微球注射到7 只兔子的9 個VX2腫瘤中。 結果在瘤兔模型中，普通微球不產生明顯的影像對比，而氧化鐵標記的玻璃微球產生了磁敏感引起的偶極類型變化，由此產生的影像在空間范圍隨著微球劑量的增加而增加。 這種微球可以在MRI 中實時驗證栓塞位置和檢測肝外分流。 Wang等［14］將納米氧化鐵顆粒包埋于殼聚糖微球中用于栓塞兔右腎動脈，18 周后，這些顆粒在T2 加權圖像上仍然可見。 Lee 等［15］將納米氧化鐵顆粒包埋于Embosphere 微球中用于栓塞兔VX2 腫瘤， 通過病理學染色的形式觀察微球的分布，他們發(fā)現(xiàn)無論是100～300 μm 的微球還是300～500 μm 的微球，它們的MRI 和組織病理學均呈陽性相關。 除了空白微球，Li 等［12］在正常兔腎中驗證了包埋納米氧化鐵顆粒的PVA 阿霉素載藥微球， 對正常兔腎動脈的活體評估顯示納米氧化鐵PVA 載藥微球具有MRI 顯影、栓塞治療和化療的功能。 Kim 等［16］開發(fā)了搭載氨萘非特的海藻酸鹽微球，除了其核心包埋的氧化鐵納米顆粒用于成像，該微球還可以持續(xù)釋放化療藥物。

3.1.2 順磁性物質標記 釓對比劑是MRI 常用的T1 加權造影劑，釓是順磁性最強的原子，與一些碳氫有機大分子螯合而穩(wěn)定存在。Cilliers 等［17］將釓螯合物共價偶聯(lián)在PVA 微球表面制成了釓標記的PVA 微球。 他們將微球注射到內徑為0.6 mm 的毛細血管中，以模擬肝癌栓塞過程。 實驗結果表明，微球存在區(qū)域的圖像與沒有微球的周圍區(qū)域有顯著差異。 van Elk 等［18］對釓劑標記的微球進行了改良，研究者將釓標記的空白微球替換為了溫度敏感性阿霉素載藥微球。 他們先將溫度敏感脂質體封裝在海藻酸鹽微球中，將MRI 顯影劑以及脂質體摻入微球中，使得微球同時具備顯影和觸發(fā)藥物釋放的功能。在新西蘭大白兔耳廓VX2 腫瘤的體內實驗中對該微球的適用性進行了評價，實驗結果表明，微球MRI 示蹤和藥物釋放的效果均良好。

3.2 X 線可視化微球

在微球內或表面加入不透射線的物質，可以使微球在X 線下顯影。 根據(jù)這個原理，許多X 線可視化微球被開發(fā)了出來，這種微球內包埋或表面包被的X 線下顯影物質有碘化物、鉭、硫酸鋇等。

3.2.1 碘標記

碘化物：碘的原子系數(shù)大，吸收X 線性能強，而且結構穩(wěn)定，毒副作用小，因此碘化物被廣泛運用于臨床作為對比劑。 Yang 等［19］將碘己醇與PVA 微球結合，制作了可視化微球。 后續(xù)的大鼠肝臟栓塞實驗表明， 這種微球栓塞性能和空白的PVA 微球相當，但是其擁有獨特的CT 成像能力。Duran 等［20］采用交替反應法制備了吸附有三碘代芐基的PVA 水凝膠微球，所得的單個微球在其整個內部結構中表現(xiàn)出均勻的碘分布， 所有微球具有一致的不透射線性。Sharma 等［21］進一步進行動物實驗驗證了這一理論，他們將新型三碘代芐基微球注入豬模型的肝葉動脈進行栓塞，在栓塞過程中DSA 透視下，這種微球可以讓術者觀察到靶動脈的栓塞情況，也能觀察到反流和導管錯位等情況； 但Sharma 還是建議將可視化微球與造影劑一起混用，便于更好地觀察微球的方向和流速。 隨后的CT 掃描證實，在90 d 內微球持續(xù)可顯影。 Levy 等［22］將碘化物共價結合PVA栓塞微球用于3 例肝腫瘤患者的栓塞手術。此微球可以通過DSA、增強/非增強錐形束CT（cone-beam CT，CBCT）、常規(guī)CT、熒光透視、常規(guī)X 線片觀察到， 并且可以清晰顯示出腫瘤某一部分內缺乏栓塞微球，從而提示腫瘤內潛在治療不足的風險。在上述碘化物微球空白微球的基礎上，王文煥［23］利用雙乳化（W/O/W）制備得到了碘代聚氨酯阿霉素載藥微球，其有較高的藥物負載量及良好的藥物釋放能力，在2 個月的釋放周期內累積釋放率最高可達80%。 另外有研究發(fā)現(xiàn)， 通過載藥微球CT 上的HU 值來預測估計肝臟中的藥物劑量， 結果表明阿霉素劑量與CT 上的HU 值成正比［24］。除了阿霉素，Choi 等［25］將索拉非尼包埋于聚碳酸酯微球中，用2，3，5-三碘苯甲酸作為顯影材料， 制作了載有索拉非尼的可視化載藥微球。在大鼠肝癌模型中，這種微球有良好的持續(xù)釋放藥物作用， 能追蹤藥物的具體位置，同時全身不良反應也較口服給藥減少。

碘化油：碘化油作為臨床使用藥物，生物相容性高， 能長期積聚于肝細胞癌組織中， 而在正常組織中卻很少積聚或很快被排泄掉；同時其具有不透光性，可以在X 線和CT 中被檢測到。Sharma 等［6］用PVA 水凝膠微球負載碘化油，經(jīng)導管用此微球栓塞豬肝臟和腎臟， 并通過術中透視和CT 評估空間分布。 栓塞過程中的CT 成像顯示可見栓塞動脈的數(shù)量和大小呈劑量依賴性關系，但在DSA 下顯影能力仍不足。 最后通過病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)，靶組織內微球分布的影像學特征與顯微鏡、 顯微CT 下微球分布的病理組織學特征密切相關。 與上述碘化油標記的空白微球不同，Dreher 等［26］在PVA 水凝膠微球負載碘化油使其不透射線， 同時裝載了阿霉素，并將其輸注到正常豬肝臟和腎臟中。 栓塞后使用DSA和CT 評估，70～150 μm 和100～300 μm 的微球均提供了足夠的圖像對比度。 在離體的microCT 掃描中， 研究者發(fā)現(xiàn)70～150 μm 的微球會到達更遠的位置， 進入組織的深部， 其微球空間頻率遠大于100～300 μm 的微球。他們還發(fā)現(xiàn)，在CBCT 血管重建下，碘造影劑和微球的混懸液與含碘化油的微球進行示蹤相比， 最終微球定位會顯示出不同的結果， 這突出了碘造影劑混懸液示蹤微球的局限性。栓塞后即刻檢測微球周圍的藥物濃度，發(fā)現(xiàn)藥物可以保持較高濃度。

3.2.2 鋇標記 早在20 世紀80 年代末，就有學者嘗試過將BaSO4包在聚合物顆粒中，如聚甲基丙烯酸羥乙酯和聚甲基丙烯酸甲酯，使這些聚合物可以成像［27］。Barnett 等［28］開發(fā)了兩種基于海藻酸鹽的硫酸鋇和硫酸鉍微膠囊。在小鼠和兔體內移植后可以識別出單個膠囊， 且在2 周內對比度沒有顯著變化。 Dreher 等［26］嘗試在海藻酸鈉微球中加入BaSO4納米顆粒，但他們發(fā)現(xiàn)BaSO4分散不均勻，靠近微球的邊緣；BaSO4濃度小幅度增加就會導致微球表面變脆， 進而導致微球破裂。 為了解決這個問題，Wang 等［29］使用一步液滴微流控技術制備含有原位合成BaSO4納米粒子的海藻酸鹽微球。 體外實驗證實， 海藻酸鹽微球負載BaSO4在透視下完全可見，并且BaSO4的分散性得到了改善。 根據(jù)后續(xù)的動物實驗，該微球在兔腎栓塞后1.5 h 透視可見，14 d 后CT 仍可檢測到。 病理學研究顯示，它們的栓塞效果相比商品化的海藻酸鈣微球沒有降低。 盡管如此，海藻酸鹽微球本身是離子型，因此在體內長期不穩(wěn)定， 不能以可控的方式降解。 為了解決這個難題，Vogt 等［27］通過簡單的一步法制備了由聚乙二醇和均勻分散的硫酸鋇組成的微球，體外實驗表明穩(wěn)定性優(yōu)于海藻酸鹽BaSO4微球，但遺憾的是他們沒有能夠再進行體內實驗。 Li 等［30］用BaSO4采用乳化交聯(lián)法成功制備了聚乙烯醇/殼聚糖栓塞微球，體外和兔耳的評估均表明該微球在X 線透視下清晰可見。在栓塞15 d 后，因有效的血管閉塞而導致兔耳進行性缺血性壞死。 病理學結果還證實，栓塞作用還導致栓塞兔耳內皮細胞的異常變化。 這些均表明該可視化微球栓塞效果良好。 Yi 等［31］采用一種新的溶液干燥法制備了以透明質酸鈉和1，4-丁二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑的BaSO4微球， 研究者在比格犬中進行腎栓塞，在栓塞過程中他們清楚地觀察到了微球隨著血液流動進入腎臟。 栓塞3 周后，CTA 圖像上仍然能看到可視化微球， 經(jīng)過3D 重建顯示栓塞的腎臟已經(jīng)消失，表明該微球栓塞性能和顯影性能均良好。

3.2.3 鉭標記 鉭是使微球不透射線的另一種可視材料。 早在1991 年，Thanoo 等［32］就研發(fā)出了負載有鉭的有機硅微球作為栓塞微球。 Horikawa 等［33］將PVA 和三丙烯酸明膠微球懸浮液與鉭粉末一起浸泡得到了鉭標記微球。 在豬腎動脈栓塞中，這些微球在透視下顯影良好，能夠顯示出節(jié)段動脈和弓形動脈以及小葉間動脈。Zeng 等［34］一步電噴涂法可用于制備負載鉭納米粒子的海藻酸鈣微球，鉭納米顆粒均勻地包埋在海藻酸鈣基質中。 在隨后的兔腎栓塞實驗和術后4 周的X 線透視、CT 掃描實驗中該微球均顯影，表明其具有用于實時成像和長期評估的潛力。 同時，研究者還發(fā)現(xiàn)這種微球還可以搭載阿霉素形成“三合一”的載藥微球。

3.3 超聲可視化微球

超聲造影劑由懸浮液中的封裝微氣泡組成，臨床上使用最廣泛的造影劑由1～5 μm 的顆粒組成，由磷脂外殼包裹的六氟化硫或八氟丙烷［35］。 低溶解度的氣芯和外殼允許這些微氣泡在循環(huán)中持續(xù)數(shù)分鐘，氣泡在溶解后數(shù)分鐘內被呼出機體，殼物質由肝臟代謝［36］。 由于顆粒粒徑太小，加之顯影時間過短，所以超聲顯影微球通常不用于栓塞微球定位。

3.4 熒光成像可視化微球

熒光微球表面光滑、無雜質，有利于其在生物和醫(yī)學領域的應用。Deng 等［37］采用熒光成像技術研究熒光微球在小鼠體內的分布。 他們將溶于二甲基亞砜的紅色熒光素標記的羅丹明B 異硫氰酸酯（rhodamine B 5-isothiocyanate，RBITC）加入到海藻酸鈉溶液中, 經(jīng)過攪拌、 透析、 凍干后， 用干燥的RBITC 標記的海藻酸鈉來制備RBITC 標記的海藻酸鈉微球。 將RBITC 標記微球灌入小鼠胃中，熒光成像系統(tǒng)在設定時間點觀察到了微球在小鼠胃、十二指腸、空腸、回腸和結腸組織中的分布。 Foulds 等［38］使用直徑為10 μm 含有熒光染料的聚苯乙烯微球，這種微球的吸收和發(fā)射光譜可以通過裝有熒光素血管造影過濾器的眼底照相機在體內可視化。 在微球遞送到眼外動脈后，立即用裝有熒光素血管造影濾光片的眼底相機檢查， 發(fā)現(xiàn)熒光微球是可見的。Khalin 等［39］為了使單個微球在體內可視化，用十八烷基羅丹明B 和高氟化四苯硼酸鹽通過納米沉淀法組裝于聚甲基丙烯酸甲酯中。 這種微球具有巨大的疏水抵消離子，使熒光團不聚集。 經(jīng)股動脈將這些微球注射入小鼠體內，通過雙光子顯微鏡進行實時觀察，可以在小鼠所有的腦血管系統(tǒng)中清楚檢測到微球的分布。 但上述熒光微球在體內的顯影時間均有限，會很快在血管中被清除，不能作為栓塞微球長期定位的參考。

3.5 放射性核素可視化微球

放射性示蹤法是將可探測的放射性核素添入化學、生物或物理系統(tǒng)中，標記研究材料，以便追蹤發(fā)生的過程、 運行狀況或研究物質結構等的手段。Patil 等［40］用還原的锝-99m（99mTc）直接標記載有卡維地洛的微球，在新西蘭大白兔體內進行了單劑量鼻內注射微球的研究。 他們通過使用放射性示蹤劑和伽馬閃爍掃描的非侵入性技術來評估微球的沉積和清除模式。

3.6 多模態(tài)可視化微球

在臨床工作中，將多種具有互補特點的顯影方式結合進行多重顯影診斷，對提高疾病診斷率具有重要意義。 在設計可視化微球時，可將敏感度較高的造影方式（如超聲造影、PET 造影）和空間分辨率高的造影方式（如MRI 造影、CT 造影）結合。這種多模態(tài)成像微球允許使用多種臨床成像技術實現(xiàn)成像，多種成像技術的結合可以相輔相成，互相彌補缺點。

3.6.1 超聲和MRI 多模態(tài)成像微球 如前文所述，超聲成像微球擁有術中即刻顯影定位的能力，但顯影時間較短，不適用于長期標記微球。 許多研究者嘗試開發(fā)多模態(tài)超聲顯影微球來增強超聲微球的長期顯影能力。宋晟［41］構建了全氟己烷/氧化鐵磁性納米顆粒復合微球，通過微球內部充填全氟己烷獲得超聲顯影能力，通過微球外殼的氧化鐵納米磁性顆粒獲得MRI 顯影能力。 體外實驗中，這種微球表現(xiàn)出良好的磁共振/超聲雙重顯影性能。體內實驗表明，這種多模態(tài)微球與大鼠肝細胞和腎細胞均有良好的生物相容性。 在大鼠肝臟內，多模態(tài)微球可以進行MRI/超聲雙重顯影，超聲造影增強持續(xù)時間為10 min，其MRI 造影增強45 d 內消失。

3.6.2 X 線和MRI 多模式成像微球 為了達到X線和MRI 的雙重成像模式， 許多研究者嘗試將不透射線的物質和磁性納米顆粒同時加入到微球中。Hagit 等［42］用碘化單體2，3，5-三碘苯甲酸鹽組成微球核心，用磁性納米粒子組成微球外殼，構成了多模式成像微球。他們用這種微球成功栓塞大鼠腎臟，X 線透視和MRI T2 加權成像均觀察到信號改變。Bartling 等［43］也采用這種微球成功栓塞了兔腎腫瘤模型，在DSA 引導的栓塞過程中可以在不添加造影劑的情況下檢測到微球， 栓塞后可以從DSA、CT、MRI 三種途徑檢查微球分布的位置，且在所有成像模式中微球的定位都非常吻合。Sommer 等［44］將不同濃度硫酸鋇和固定濃度的氧化鐵嵌入到Embozene微球，用于制作多模態(tài)可視化微球。 該微球通過動脈途徑運送到豬腎，栓塞過程中可以清晰看見微球的走向， 術后同樣可以通過X 線、CT 和MRI 檢查微球分布的位置。 Stampfl 等［45］在此基礎上，同時將不同濃度的碘和硫酸鋇及固定濃度的氧化鐵嵌入Embozene 微球內制得多模態(tài)栓塞微球，實現(xiàn)X 線、CT 和MRI 的多模態(tài)成像。在豬肝栓塞后，相比于空白Embozene 微球，可在CT 上觀察到顆粒可視性的顯著變化，在T1 和T2 加權MRI 上也能觀察到。 與Embozene 微球不同，卡拉膠微球結構蓬松，內為多孔的海綿狀結構，有利于負載藥物。 Liu 等［46］使用親水相互作用法和包埋法，將碘海醇和氧化鐵顆粒負載于卡拉膠微球中。 小鼠、犬類和兔子的體內外實驗證明， 該微球不僅在DSA 和MRI 下實現(xiàn)了優(yōu)異的成像能力和生物降解性，其也具有阿霉素載藥和可控釋放的能力。

3.6.3 SPECT 和MRI 多模式成像微球 放射性同位素166Ho 是一種用于治療的高能β 射線同位素，但它也會發(fā)射可用于SPECT 的初級γ 光子。 此外，作為一種稀土元素，由于它具有順磁性，所以它可以通過MRI 進行成像，從而能夠可視化其在肝臟中的分布，并量化其在腫瘤中的吸收劑量［47］。 這種微球可以同時治療和觀察肝臟腫瘤的病變，具有很大的研究價值。

3.6.4 熒光和MRI 多模式成像微球 宋晟［41］用近紅外熒光分子-聚左旋賴氨酸和氧化鐵磁性納米顆粒構成了熒光/MRI 多模式成像微球。在胰蛋白酶表達的細胞組中復合微球表現(xiàn)出強烈的熒光顯影性能，同時具備MRI 造影能力；在不含胰蛋白酶的對照細胞組中，復合微球不表達熒光顯影性能，并具有較弱的MRI 顯影強度。

4 結語

使用微球治療富血管腫瘤是一種有效手段，但無論是微球栓塞還是放射性微球血管內近程放療都存在一個很大的缺陷——對靶組織內微球的空間和時間的分布缺乏了解。 為了解決這一缺點，臨床工作者研發(fā)出了許多可示蹤微球，這些微球可以通過常規(guī)X 線、B 超、CT、MRI 可視化， 可以在經(jīng)導管栓塞過程中在體內檢測到，以揭示靶組織內栓塞物質的真實空間分布。 這些實時的術中反饋，有助于確定最佳的栓塞終點，從而實現(xiàn)更個體化、精細化的治療。 同時，在術后也可以根據(jù)微球的分布來精確地制定后續(xù)的治療計劃。