宏基因組測序技術（mNGS）對肺泡灌洗液病原的診斷價值

李加雄，金曉菲，盧惠倫

（廣東省深圳市龍崗區第二人民醫院呼吸內科，廣東 深圳 518000）

肺部感染是臨床上常見的疾病之一，其治療的關鍵在于迅速準確地確定病原體，以便選擇合適的抗生素治療方案[1]。傳統的病原體檢測方法，如涂片染色、傳統培養法和PCR 檢測，雖然具有一定的準確性，但仍存在較多局限性，包括檢測周期長、部分病原體難以培養、漏檢率較高等問題[2-3]。mNGS 作為一種高通量測序方法，已經在病原體檢測領域顯示出潛在的優勢[4]。本研究旨在評估mNGS 技術在肺泡灌洗液樣本中用于病原體檢測的診斷價值，比較其與傳統方法的檢出率，并分析mNGS 檢測結果對肺部感染患者臨床治療的指導作用。通過對病原體的快速、全面檢測，希望能夠提高肺部感染的早期診斷率，減少不必要的抗生素使用，改善患者的預后。現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

研究納入2021 年5 月至2023 年5 月期間收治的86例行支氣管肺泡灌洗的肺部感染患者為研究對象。納入標準：年齡在18 歲以上；伴有急性肺部感染癥狀，包括但不限于發熱、咳嗽、呼吸急促等；需要進行支氣管肺泡灌洗以明確病原體的診斷；患者或其法定監護人已簽署知情同意書并同意參加研究。排除標準：已明確診斷為非感染性肺部疾病，如支氣管哮喘、肺部腫瘤等；患有免疫抑制性疾病，如艾滋病、白血病等；已接受抗生素治療超過48 h 的患者；曾經接受過肺移植或免疫抑制治療的患者；存在嚴重的心臟、肝臟、腎臟或其他重要器官功能不全的患者；無法提供足夠的肺泡灌洗液樣本的患者。86 例患者的男女比例為49/37；年齡37 ～78（54.38±13.27）歲；病程4 ～16（7.81±2.32）d；嚴重程度：輕度、中度和重度患者比例為31/42/13。

1.2 檢測方法

1.2.1 mNGS 檢測 回收10 mL 左右中段灌洗液置入滅菌容器，在56℃環境下對灌洗液進行干浴滅菌，取600 μL破壁，通過磁珠法提取核酸，嚴格遵循制造商的操作說明，以分離并純化DNA 和RNA。獲得DNA/RNA 后構建文庫，以便進行高通量測序。這包括將核酸片段逐漸連接到測序適配器上，形成文庫。文庫構建過程包括末端修復、A 尾加在3’末端、連接適配器和PCR 擴增等步驟。構建的文庫隨后被送入Illumina MiSeq 平臺高通量測序儀，進行測序。在測序儀中，DNA/RNA 片段的堿基序列被逐一讀取。獲得測序數據后，進行一系列生物信息學分析，包括質量控制、序列比對、物種鑒定和功能注釋，識別樣本中的病原體，確定其種屬、亞種和潛在的耐藥基因，并列出覆蓋度、Reads 數、測序深度等參數。

1.2.2 傳統方法檢測 回收10 mL 左右中段灌洗液進行離心處理，將顆粒物分離出來獲得上清液，取1/2 上清液制備涂片，予以Wright-吉姆薩染色，以可視化細菌、真菌或細胞。取1/2 上清液進行細菌或真菌的傳統培養，行細菌培養時將樣本接種到麥康凱瓊脂、哥倫比亞血瓊脂、巧克力瓊脂平板上，并在35℃條件下孵育，以促進病原體的生長。行真菌培養時則將樣本接種到沙保羅瓊脂平板上，置于35℃培養箱中培養。培養后觀察培養基上的菌落形成，并在自動質譜檢測系統上進一步鑒定菌株。

1.3 觀察指標

（1）比較兩種檢測方法的總檢測準確率、混合感染檢測準確率、耶氏肺孢子菌及結核分枝桿菌檢測準確率。（2）對比mNGS 陽性組與陰性組患者的預后指標，包括抗生素調整率、CRP 水平、平均住院時間、機械通氣時間等。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 比較病原菌檢出情況

最終診斷結果為陽性65 例，陰性21 例，其中混合感染共計49 例；共檢出164 株病原體，其中耶氏肺孢子菌、結核分枝桿菌比例為13/7。mNGS 的總檢測準確率明顯高于傳統檢測方法（P＜0.05）；在耶氏肺孢子菌檢測準確率的比較上，mNGS 檢測的準確率均明顯高于傳統檢測方法（P＜0.05），但在結核分枝桿菌檢測準確率的比較上，mNGS 與傳統檢測方法差異無統計學意義（P＞0.05）；在真菌、細菌混合感染的檢測準確率比較上，mNGS 檢測明顯高于傳統檢測方法（P＜0.05）。詳見表1 ～4。

表1 mNGS 檢測結果（例）

表2 mNGS 檢測結果（例）

表3 傳統方法檢測結果（例）

表4 傳統方法檢測結果（例）

2.2 比較mNGS 陽性組與陰性組基線資料

mNGS 陽性組與陰性組的基線資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 兩組基線資料對比

2.3 比較mNGS 陽性組與陰性組預后指標

在抗生素調整率、CRP 水平、平均住院時間、機械通氣時間等預后指標的比較上，mNGS 陽性組與陰性組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表6。

表6 兩組預后指標對比

3 討論

肺部感染患者由于病情反復，加之對抗生素藥物的濫用，其體內病原微生物也會隨之出現變化，隨著疾病的進一步發展，會對患者肺部組織產生嚴重損害，直接影響其生活質量，嚴重情況下還會導致患者死亡[5]?，F階段，肺部感染性疾病已發展成為常見的致死性疾病之一。肺部感染的病原體較為復雜，通?；旌狭思毦?、真菌、病毒以及寄生蟲等，予以早期針對性治療往往會收獲較為理想的治療效果[6]。但僅憑患者體征、臨床表現及影像學表現難以在早期快速、準確診斷，因此，需通過實驗室檢測進行輔助診斷，以明確具體的病原體感染類型及疾病嚴重程度，避免出現誤診情況[7]。同時早期明確診斷也是指導抗感染藥科學應用的重要依據，對改善患者病情大有裨益。

傳統涂片染色方法的靈敏度和特異性有限，對于病原體種類和數量的檢測準確性不高；傳統培養法雖然可以培養出部分病原體，但是所需時間較長，且部分病原體難以培養；PCR 檢測雖然具有較高的靈敏度和特異性，但是需要針對不同的病原體分別設計不同的引物，且對于部分病原體可能無法檢測[8]。因此，對于肺部感染的病原體檢測，需要一種更快速、更準確的方法。近年來，隨著分子生物學技術的發展，mNGS 技術為病原體檢測提供了新的途徑。mNGS 是一種高通量測序方法，可以對樣本進行全面的基因測序，從而檢測出其中的病原體種類和基因序列。與傳統的檢測方法相比，mNGS 具有更高的靈敏度和特異性，可以檢測出更多的病原體種類和基因序列，且檢測時間較短[9]。因此，mNGS 技術的發展為肺部感染的病原體檢測提供了新的可能性。

本研究結果顯示，最終診斷結果為陽性65 例，陰性21 例，其中混合感染共計49 例；共檢出164 株病原體，其中耶氏肺孢子菌、結核分枝桿菌比例為13/7。mNGS的總檢測準確率明顯高于傳統檢測方法（P＜0.05）。這個結果表明，mNGS 在病原體檢測中的總體性能優于傳統方法。這主要歸功于mNGS 采用的高通量測序技術，使其能夠全面、快速、準確地檢測出病原體。此外，mNGS 無需培養或染色，避免了傳統方法中存在的漏檢或誤診的可能性，也是提高總體準確率的重要原因之一[10]。在耶氏肺孢子菌檢測準確率的比較上，mNGS 檢測的準確率明顯高于傳統檢測方法（P＜0.05）。這表明mNGS 在耶氏肺孢子菌的檢測上具有更高的準確性。這可能是因為耶氏肺孢子菌是一種難以培養的病原體，傳統方法存在一定的漏檢率。而mNGS 采用高通量測序技術，能夠直接檢測出病原體基因序列，提高了檢出率和準確性。但在結核分枝桿菌檢測準確率的比較上，mNGS 與傳統檢測方法差異無統計學意義（P＞0.05）。這個結果表明，mNGS 在結核分枝桿菌的檢測上與傳統方法相比沒有明顯優勢。這可能是因為結核分枝桿菌是一種常見的病原體，傳統方法已經具有一定的檢出率和準確性。此外，結核分枝桿菌的基因序列較為復雜，可能給mNGS 的檢測帶來一定的難度。在真菌、細菌混合感染的檢測準確率比較上，mNGS 檢測明顯高于傳統檢測方法（P＜0.05）。這表明mNGS 在混合感染的檢測上具有更高的準確性。這可能是因為真菌和細菌的檢測需要不同的方法，傳統方法可能存在一定的交叉干擾或漏檢率。而mNGS 能夠同時對多種病原體進行檢測，提高了檢出率和準確性。此外，mNGS 的生物信息學分析能夠對測序數據進行深入挖掘和分析，更容易識別出不同的病原體種類和基因序列，也是提高混合感染檢出率的重要原因之一[11]。總之，mNGS 在肺部感染病原體檢測中具有全面、快速、準確的優點，能夠提高總體檢測準確率和特定病原體檢測準確率。其主要優勢在于采用了高通量測序技術和生物信息學分析方法，避免了傳統方法中存在的漏檢或誤診的可能性，并能夠同時對多種病原體進行檢測。這些優勢對于肺部感染患者的早期診斷具有重要意義。在抗生素調整率、CRP 水平、平均住院時間、機械通氣時間等預后指標的比較上，mNGS 陽性組與陰性組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。表明mNGS 技術在指導個體化治療方案調整方面發揮了重要作用。通過mNGS 檢測出的病原體陽性患者需要進行更多的抗生素調整。由于mNGS 能夠準確檢測出病原體種類和基因序列，醫生可以根據檢測結果選擇正確的抗生素種類和劑量，避免抗生素濫用和耐藥性的產生，從而更好地治療肺部感染，提高治療效果和改善患者的預后[12]。因此，mNGS 對抗生素調整具有積極的指導作用。CRP 是炎癥反應的重要指標之一，mNGS 能夠準確檢測出病原體，從而有助于醫生更好地判斷炎癥反應的程度和治療效果，以便及時調整治療方案。此外，由于mNGS 能夠準確檢測出病原體種類和基因序列，醫生可以更好地了解病情和治療效果，從而制定更加個性化的治療方案。這也可能導致機械通氣及住院時間的延長，體現了差異化治療理念，有效避免了因漏誤診導致的疾病進一步惡化。

綜上所述，mNGS 技術在肺泡灌洗液樣本中用于病原體檢測具有較高的診斷價值，能夠提高陽性檢出率并對肺部感染患者的臨床治療產生積極的指導作用，有助于改善患者預后。