紫花苜蓿CNGC基因家族成員鑒定及分析

摘要： 環核苷酸門控通道（CNGC）基因家族作為非選擇性陽離子通道基因家族之一，在植物信號轉導、生長發育和環境脅迫等生理過程中發揮著重要作用。本研究利用生物信息學手段和轉錄組數據對紫花苜蓿CNGC家族成員的進化關系、基因結構、保守基序、順式作用元件、染色體定位、共線性關系以及基因表達進行分析。結果表明，紫花苜蓿MsCNGC基因家族成員有16個，在染色體上不均勻分布，存在片段重復，大多數蛋白定位于細胞質膜。系統發育樹將MsCNGCs為4個亞家族。基因結構和保守基序分析表明，都含有cNMP/CNBD和ITP功能域。順式作用元件分析表明，MsCNGCs基因含有許多與非生物或生物脅迫和激素響應元件。MsCNGC4和MsCNGC7.2蛋白之間存在互作。MsCNGC基因具有組織表達特異性。MsCNGC基因對干旱、鹽和激素等非生物脅迫均有顯著的響應，為進一步研究MsCNGC基因在調控非生物脅迫過程中的潛在功能提供了理論依據。

關鍵詞： 紫花苜蓿；CNGC基因家族；全基因組；系統進化；基因結構；非生物脅迫

中圖分類號：S512.6 """文獻標識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0588-11

Identification and Analysis of CNGC Gene Family Members in Alfalfa

LI Xiao-hong1， WANG Xiao-tong1， MA Xu-xia1， CAI Wen-qi1， FENG Xue-li1，

MA Meng-fan1， LI Shu-xia1，2，3*

（1.College of Forestry and Prataculture， Ningxia University， Yinchuan， Ningxia 750021， China; 2.Ningxia Grassland and Animal

Husbandry Engineering Technology Research Center， Yinchuan， Ningxia 750021， China; 3.Key Laboratory for Model Innovation

in Forage Production Efficiency， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Yinchuan， Ningxia 750021， China）

Abstract： The cyclic nucleotide-gated channels （CNGCs） gene family functions as one of the non-selective cation channel gene families and plays important roles in physiological processes such as plant signal transduction，growth and development，and environmental stress. In this study，we analyzed the evolutionary relationship，gene structure，conserved motifs，cis-acting elements，chromosome localization，collinearity，and gene expression patterns of the CNGC family members in alfalfa using bioinformatic tools and transcriptomic data. The results showed that there were 16 members of MsCNGC genes family in alfalfa，which were unevenly distributed on chromosomes，with segmental repeation，and most of proteins were located in the plasma membrane. The phylogenetic tree divided MsCNGCs into four subfamilies. Gene structure and conserved motif analysis showed that cNMP/CNBD and ITP functional domains were present. Cis-acting element analysis showed that MsCNGC genes contained many elements that responded to abiotic or biological stresses and hormones. There was interaction between MsCNGC4 and MsCNGC7.2 proteins. MsCNGC genes had tissue specificity. MsCNGC genes had significant response to drought，salt and hormone stress，which provided a theoretical basis for further research on the potential function of MsCNGC genes in the regulation of abiotic stress.

Key words： Alfalfa;CNGC genes family;Genome-wide;Systematic evolution;Gene structure;Abiotic stress

Ca2+作為植物中重要的次級信使，在調控植物的多種信號轉導、生長發育和非生物脅迫響應中發揮著關鍵性的作用，如植物的光合作用、激素合成、生物脅迫和非生物脅迫等［1-4］。環核苷酸門控離子通道（CNGCs）蛋白是鈣離子傳導途徑之一，廣泛存在于動植物中［5］。在植物中，大多數CNGC蛋白位于質膜，部分位于核膜和液泡膜［6-8］。CNGC是由六個跨膜（TM）結構域和第五、第六TM結構域之間的一個孔隙區域（P）組成，包含CaMB結構域和環核苷酸結合結構域（CNBD）［9-11］。CNBD是一個高度保守的區域，包含一個能與鈣調蛋白（Calmodulin，CaM）結合的磷酸鹽結合盒（PBC）和1個鉸鏈區［12-13］。環核苷酸單磷酸（3′，5′-cAMP和3′，5′-cGMP）和CaM可調節CNGC通道的關閉和打開［14］。這些結構對研究CNGC提供了重要的信息。

研究表明，CNGC家族成員可參與植物的各種生理反應，包括種子萌發、生殖發育［15］和非生物脅迫（鹽脅迫、熱脅迫）響應等［16，17］。目前，已經在大多數植物種鑒定出了CNGC基因，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定出20個AtCNGCs、蒺藜苜蓿（Medicago truncatu）中19個MtCNGCs基因、赤豆（Vigna angularis）中18個VaCNGCs基因［35］。在擬南芥中，AtCNGC1作為植物發育和抗逆性的調節因子，參與Ca2+的吸收［19］。AtCNGC18在花粉中表達，AtCNGC18功能的喪失導致花粉管生長缺陷，并導致雄性不育［18］。AtCNGC19和AtCNGC20在鹽脅迫下表達量顯著降低［19］。沉默IVb亞族SlCNGC基因顯著增強番茄（Solanum lycopersicum）對真菌病原體Pythium aphanidermatum和Solanum lycopersicum的抗性［20］。在芒果（Mangifera indica）CNGC家族成員中，MiCNGC13和MiCNGC6可通過調節MDA含量來維持細胞膜完整性，進而積極響應冷脅迫［21］。沉默棉花（Gossypium hirsutum）GhCNGC32和GhCNGC35基因后，轉基因植株的耐鹽性降低［22］。CNGC基因在植物的各種生物學過程中發揮重要作用。因此，鑒定紫花苜蓿（Medicago sativa）CNGC家族成員對紫花苜蓿的抗逆性研究具有重要意義。

紫花苜蓿是一種優質的多年生豆科牧草，在世界范圍內廣泛種植，對環境的適應性相對較強，因其營養含量高和適口性好而享有“牧草之王”的美譽［23，24］。然而，一些不利的生物和非生物因素嚴重制約了苜蓿生產，對苜蓿產量和品質產生了嚴重的負面影響，進而影響畜牧業的高質量發展。本研究利用紫花苜蓿全基因組序列信息、擬南芥CNGC家族基因研究信息及生物信息學分析技術對紫花苜蓿中的CNGC基因家族成員進行鑒定和分析，并利用轉錄組數據分析MsCNGC基因在不同組織和非生物脅迫（冷、干旱、鹽和ABA）下的表達模式，以期為進一步探究MsCNGC基因的功能提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 紫花苜蓿CNGC基因家族鑒定

從擬南芥數據庫（TAIR，http：//www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥CNGC家族蛋白的氨基酸序列。紫花苜蓿（中苜一號）基因組文件下載自https：//figshare.com/articles/dataset/Medicago_sativa_genome_and_annotation_files/12623960。以擬南芥CNGC蛋白為參考序列，利用TBtools中的BLASTp比對出紫花苜蓿中CNGCs的蛋白，然后，利用cNMP/CNBD（pfam：PF00027）和ITP（pfam：PF00520）的隱馬爾可夫模型（HMM）配置文件作為查詢，對紫花苜蓿蛋白數據庫進行搜索，利用CD-HIT（http：//weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/）軟件去除冗余序列。再利用InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro）網站分析預測蛋白的結構域，同時包含一個環核苷酸結合結構域（cNMP/CNBD，PF00027）和一個離子轉運蛋白結構域（ITP，PF00520）的蛋白屬于紫花苜蓿CNGC基因家族成員，并根據基因在染色體上的位置信息重新命名MsCNGC基因。

1.2 紫花苜蓿CNGC蛋白質理化性質、亞細胞定位、二級和三級結構預測分析

利用在線工具Prot Param（https：//web.expasy.org/protparam/）預測MsCNGC蛋白質的氨基酸數、分子量、等電點、穩定指數等理化性質。利用WoLF PSORT II網站（https：//www.genscript.com）和SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）預測MsCNGC蛋白成員的亞細胞定位及二級結構。使用在線網站SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分析MsCNGC蛋白的三級結構。

1.3 紫花苜蓿CNGC基因系統進化樹分析

利用軟件MEGA 11對紫花苜蓿16個MsCNGC，擬南芥20個AtCNGC，蒺藜苜蓿19個MtCNGC蛋白和赤豆18個VaCNGC蛋白共73個CNGC蛋白序列構建系統進化樹。進化樹構建采用最大似然法（Maximum likelihood estimate，ML），步長值（bootstrap values）為1 000次，其他參數設置默認。

1.4 紫花苜蓿CNGC基因結構、保守基序和順式作用元件分析

通過TBtools工具對MsCNGC基因家族成員進行內含子-外顯子結構分析。MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）用于預測蛋白的保守基序，保守基序數為10，其他參數默認。利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）工具分析啟動子序列（基因上游2.0 kb）中的順式作用元件，并利用TBtools工具進行可視化。

1.5 "紫花苜蓿CNGC基因染色體定位和共線性分析

基于紫花苜蓿全基因文件信息，使用TBtools軟件分析和定位MsCNGC基因的染色體分布。從EnsemblPlants （http：//plants.ensembl.org/index.html）網站分別下載擬南芥和蒺藜苜蓿全基因組序列和gff文件，利用多重共線掃描工具（MCScanX）分析紫花苜蓿與擬南芥和蒺藜苜蓿CNGC基因共線性，并通過TBtools進行可視化。用Simple Ka/Ks Calculator（NG）計算非同義替換率（Ka），同義替換率（Ks）以及Ka/Ks比率。

1.6 MsCNGC蛋白互作網絡預測

蛋白質互作網絡預測對功能未知的蛋白有著非常重要的作用。我們以模式作物擬南芥已注明功能的蛋白質和16個MsCNGC蛋白為研究對象，通過STRING（https：//cn.string-db.org/）在線軟件對MsCNGC蛋白進行了預測分析，置信度參數設為0.400，其他參數默認。

1.7 紫花苜蓿MsCNGC基因的組織表達模式和非生物脅迫表達分析

從NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/？term）下載紫花苜蓿在不同組織、干旱、低溫、ABA以及鹽脅迫下的轉錄組數據（SRP055547、SRR7091780～7091794，SRR7160313～7160357），獲得MsCNGC基因在不同組織和非生物脅迫下的表達模式，對每個MsCNGCs的FPKM值進行對數歸一化，并使用TBtools工具繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿MsCNGC基因家族成員鑒定及基本理化性質分析

為鑒定紫花苜蓿中所有的CNGC家族成員，從TAIR網站上下載了擬南芥CNGC基因家族20個成員的蛋白序列作為參考序列，對紫花苜蓿全基因組進行BLAST檢索，E小于1×10-5。同時，將cNMP/CNBD和ITP （pfam：PF00027、PF00520）的隱馬爾可夫模型（HMM）配置文件作為查詢，對紫花苜蓿蛋白數據庫進行搜索。去冗余后，共鑒定出16個包含CNGC功能域的基因，根據它們在染色體上的位置被命名為 MsCNGC1-MsCNGC8.5 （表1）［36］。MsCNGC蛋白長度為460 aa（MsCNGC4.2）～2 638 aa（MsCNGC3.2），對應的蛋白分子量為52.85～295.52 kDa，理論等電點在5.87～9.5之間，疏水指數（GRAVY）為-0.433～0.096。MsCNGCs蛋白二級結構分析表明，MsCNGC蛋白的α-螺旋、β-鏈折疊、延伸鏈和無規則卷曲分別為37.66%（MsCNGC8.2）～62.17%（MsCNGC4.2），2.60%（MsCNGC8.3）～11.02%（MsCNGC8.2），延伸鏈9.17%（MsCNGC3.2）～22.70%（MsCNGC8.2），25.00%（MsCNGC4.2）～33.65%（MsCNGC8.5）。不穩定系數預測表明，MsCNGC2.1/7.1/7.2/8.2蛋白的穩定系數小于40，屬于穩定蛋白，其他MsCNGCs的穩定系數大于40，屬于不穩定蛋白。MsCNGC3.2和MsCNGC8.1蛋白的等電點小于7，屬于酸性蛋白，其他14個MsCNGC蛋白等電點大于7，屬于堿性蛋白。亞細胞定位預測表明，MsCNGC4.2和MsCNGC8.1蛋白分別位于液泡和葉綠體上，其他14個MsCNGC蛋白定位于質膜上。

2.2 紫花苜蓿MsCNGC蛋白的系統發育分析

對紫花苜蓿16個MsCNGC蛋白、擬南芥20個AtCNGC蛋白、蒺藜苜蓿19個MtCNGC蛋白和赤豆18個VaCNGC蛋白，共73個CNGC蛋白的系統進化分析表明：73個CNGCs蛋白被劃分為5個亞家族（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，ⅣA，ⅣB）（圖1）。除Ⅲ亞家族不包含MsCNGC蛋白，其他4個亞家族均包含MsCNGC成員，其中Ⅲ、ⅣA、ⅣB亞家族均包含上述4個物種的CNGC成員，表明CNGC在不同物種間的進化關系是高度保守。第Ⅰ亞家族只包含MsCNGC2.1，MsCNGC3.2和MsCNGC5。第Ⅱ亞家族包含有MsCNGC8.4和MsCNGC8.5；第ⅣA 亞家族包含MsCNGC1，MsCNGC2.2，MsCNGC3.1， MsCNGC4.2，MsCNGC7.1和MsCNGC7.2；第ⅣB亞家族包含MsCNGC4.1，MsCNGC7.3，MsCNGC8.1，MsCNGC8.2和MsCNGC8.3。

2.3 紫花苜蓿MsCNGC基因家族保守基序和基因結構分析

為進一步探究MsCNGC基因的進化過程，我們首先對MsCNGCs蛋白構建系統進化樹，MsCNGCs蛋白被劃分成3個亞家族（圖2A）。對MsCNGC基因家族成員的保守基序和基因結構進行了分析，結果表明，MsCNGC蛋白中共預測到了10個基序（Motif1～Motif10）（圖2B），其中大多數MsCNGC蛋白含有10個motif。根據紫花苜蓿與擬南芥的進化關系，我們發現在第Ⅰ亞家族中MsCNGC3.1/7.1/7.2含有相同的motif；第Ⅱ亞家族中的MsCNGC2.2具有與第Ⅰ亞家族基因相同的motif結構；而第Ⅲ亞家族包含的MsCNGC1和MsCNGC4.2 motif數量和種類并不相同，其中MsCNGC1比MsCNGC4.2多3個motif；第Ⅳ亞家族中的MsCNGC蛋白（MsCNGC2.1，MsCNGC3.2，MsCNGC4.1，MsCNGC5和MsCNGC8.1）包含4～7個motif，其中MsCNGC2.1、MsCNGC3.2和MsCNGC5含有4個motif，MsCNGC4.1和MsCNGC8.1含有7個motif；第Ⅴ亞家族中3個MsCNGC蛋白（MsCNGC7.3，MsCNGC8.2和MsCNGC8.3）含有8～10個motif，MsCNGC8.2不包含motif7。此外，motif2在所有成員中都存在，MsCNGC2.1，MsCNGC3.2和MsCNGC5不包含motif3和motif5。

基因結構分析表明，MsCNGC基因內含子/外顯子的數量分別為4～45個、5～46個不等（圖2C）。6個基因（ MsCNGC2.2，MsCNGC3.1，MsCNGC4.2，MsCNGC7.1，MsCNGC7.2和MsCNGC8.1 ）含4～5個內含子；4個基因（ MsCNGC7.3，MsCNGC8.3，MsCNGC8.4和MsCNGC8.5 ）包含6～7內含子；2個基因（ MsCNGC1，MsCNGC8.2 ）含有9～10個內含子；3個基因（ MsCNGC5，MsCNGC2.1和MsCNGC3.2 ）含11～45個內含子。特別地， MsCNGC3.2 基因含有的內含子和外顯子數是該家族中最多的，分別是45和46個。另外，MsCNGC家族成員UTR的分布也是不均勻的，其數量在0～4個，其中6個基因（ MsCNGC3.1，MsCNGC3.2，MsCNGC4.2，MsCNGC7.3，MsCNGC8.1和MsCNGC8.3 ）的序列沒有預測到UTR區。

2.4 紫花苜蓿CNGC基因啟動子順式作用元件分析

為了進一步了解MsCNGC家族成員順式作用元件的分布，利用PlantCARE在線工具分析順式作用元件。結果表明，16個MsCNGC基因啟動子區共檢測到170個響應元件，但不同基因含有的響應元件數量和種類不盡相同。MsCNGC基因啟動子中與植物激素相關的順式作用元件有5類，包括與脫落酸（ABA）、生長激素（IAA）、茉莉酸（JA）、赤霉素（GA）和水楊酸（SA）相關的元件；參與環境刺激的順式作用元件包括3類，分別為低溫響應、干旱和防御/應激響應元件；此外，還有與晝夜節律和光響應相關的元件（圖3）。MsCNGC家族基因均含有與激素響應元件，例如， MsCNGC2.2/7.2/8.3/8.4/8.5 包含生長素響應（TGA-element）元件； MsCNGC2.1/3.1/4.1/5/7.2/7.3/8.1 基因包含參與水楊酸響應（TCA-element）元件； MsCNGC2.1/4.1/4.2/5/7.1/7.2/7.3/8.1/8.2 基因包含參與脫落酸（ABRE）作用元件；MsCNGC7.2/8.3/8.4/8.5基因包含參與赤霉素響應（Pbox、TATC-box）的順式作用元件； "MsCNGC1/2.2/3.1/3.2/5/7.2/8.1/8.2/8.3/8.4/8.5 包含參與茉莉酸響應（TGACG-motif）元件。脅迫響應元件也廣泛存在于MsCNGC基因家族中，例如， MsCNGC2.2、MsCNGC4.1、MsCNGC4.2和MsCNGC7.3 基因含有干旱響應（MBS）元件； MsCNGC1/2.2/3.2/8.5 基因包含參與防御和應激反應（TC-rich repeats）元件； MsCNGC1/3.2/4.1/5/7.3/8.1/8.4 包含光響應（G-box、I-box）元件， MsCNGC2.1/7.2/8.3 包含低溫響應（LTR）元件。此外， MsCNGC1/3.1/4.2/7.2/8.1 還包含參與晝夜節律調控相關（Circadian）作用元件（圖3）。

2.5 紫花苜蓿MsCNGC基因染色體定位、基因重復及共線性分析

對紫花苜蓿CNGC家族基因進行染色體定位分析發現，16個MsCNGCs基因不均勻的分布在chr1、chr2、chr3、chr4、chr5、chr7和chr8上（圖4A）。其中，chr1和chr5上各包含1個MsCNGC基因，chr2、chr3和chr4上各包含2個MsCNGCs基因，chr7上各包含3個MsCNGCs基因，chr8上各包含5個MsCNGCs基因。共線性分析表明：紫花苜蓿CNGC家族內的 MsCNGC1/MsCNGC4.2，MsCNGC7.3/MsCNGC8.2 之間存在共線性關系（圖4A），屬于節段重復，Ka/Ks小于1，說明他們之間在進化過程中經歷了純化選擇（表2）。進一步分析紫花苜蓿與擬南芥和蒺藜苜蓿之間CNGC基因的共線性發現，不同物種間也存在共線性關系，但紫花苜蓿與蒺藜苜蓿之間在相同染色體上的共線性較多，說明紫花苜蓿與蒺藜苜蓿都是豆科植物，所以其親緣性更高（圖5B）。

2.6 MsCNGC蛋白互作網絡預測分析

為了提供更多關于MsCNGC功能的線索，我們利用STRING在線軟件基于擬南芥CNGC蛋白的相互作用預測了該家族成員的蛋白質相互作用網絡。構建蛋白質相互作用網絡（圖5）。MsCNGC蛋白中有6個CNGC蛋白存在互作現象。其中MsCNGC7.2與MsCNGC4之間存在蛋白互作，其他MsCNGC蛋白之間不存在互作現象。MsCNGC2.1和MsCNGC5共有的互作蛋白有鈣調蛋白（Calcineurin B-like 1，CBL1、Calcineurin B-like 4，CBL4）、與CBL蛋白相互作用的植物激酶（CBL-Interacting Protein Kinase 24，CIPK24）、鈉/氫交換蛋白（Na+/H+ Exchanger 7，NHX7）和參與真核生物前轉錄RNA剪接和RNA延伸的蛋白質（Pre-tRNA Splicing Factor and RNA Elongation Factor，POT5）。MsCNGC2.1還與CBL蛋白相互作用的植物激酶（CBL-Interacting Protein Kinase 6，CIPK6）和氫離子ATP酶（Arabidopsis thaliana H±ATPase 1，AHA1）這2個蛋白之間存在互作。MsCNGC2.2與植物受體樣激酶（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 stress kinase receptor 1，PSKR1）和氫離子ATP酶（Arabidopsis thaliana H±ATPase 1，AHA1）之間存在互作。MsCNGC8.3只和參與真核生物前轉錄RNA剪接和RNA延伸的蛋白質（Pre-tRNA Splicing Factor and RNA Elongation Factor，POT5）互作。MsCNGC5還與CBL蛋白相互作用的植物激酶（CBL-Interacting Protein Kinase 10，CIPK10）之間存在互作。此外，MsCNGC7.2與鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinase 32，CPK32）存在互作。

2.7 紫花苜蓿MsCNGC基因在不同組織中的表達模式分析

分析了MsCNGC基因在紫花苜蓿不同組織中的表達模式，MsCNGC基因具有組織表達特異性（圖6）。 MsCNGC4.1和MsCNGC8.1在各個組織中都具有相同的表達水平。MsCNGC1在根瘤組織中不表達；MsCNGC7.2在花組織中不表達；MsCNGC8.4在根組織中不表達；MsCNGC4.2和MsCNGC5的表達模式相似，只在花中表達；MsCNGC3.1僅在葉中表達；MsCNGC8.5主要在伸長莖中表達；MsCNGC8.2基因在伸長莖和短莖組織中均有較高的表達水平，尤其在伸長莖中表達量最高；MsCNGC7.1在根瘤和根中高表達；MsCNGC2.1和MsCNGC8.4 在地上組織中的表達量 要顯著的高于地下組織，表明MsCNGCs基因在調節紫花苜蓿生長發育過程中發揮不同的作用。

2.8 紫花苜蓿MsCNGC基因在非生物脅迫下的表達模式分析

為進一步研究MsCNGC基因家族對非生物脅迫的響應，利用紫花苜蓿轉錄組數據分析了MsCNGCs基因在低溫、鹽、干旱和ABA處理下的表達模式（圖7）。在低溫處理下， MsCNGC2.2、MsCNGC5、MsCNGC8.4、MsCNGC8.5 的表達量在2 h后與0 h相比明顯上調（圖7A）； MsCNGC7.1和MsCNGC7.2 的表達趨勢一致。在鹽處理下，MsCNGCs基因的表達量隨著鹽處理時間的延長表現出不同程度的下調現象，如 MsCNGC2.2和MsCNGC5 的表達量顯著降低（圖7B）。在干旱處理下，隨著處理時間的增加， MsCNGC3.2、MsCNGC5和MsCNGC8.5 基因的表達量不斷升高（圖7C）。在ABA處理下， MsCNGC2.2 的表達量隨脅迫時間的延長而降低； MsCNGC5 在3 h表達量明顯下調，隨處理時間的延長又逐漸升高； MsCNGC4.2、MsCNGC8.4和MsCNGC8.5 在ABA處理下表達趨勢相似，在處理1 h后表達量顯著下調。 MsCNGC1和MsCNGC3.1 在ABA處理下的表達量不變（圖7D）。

3 討論

紫花苜蓿作為最重要的豆科牧草之一，是畜牧業持續健康發展的重要物質基礎，因此，研究紫花苜蓿對非生物脅迫的響應是至關重要的。CNGC作為一種非選擇性的陽離子通道，對Ca2+和K+具有滲透性，并已被證實參與植物的生長發育和對各種環境脅迫的響應［24］。本研究利用生物信息學方法從在紫花苜蓿全基因組中初步鑒定到了16個CNGC基因，而擬南芥和玉米中分別有20，12個CNGC基因，與MsCNGC基因的數量不同，說明在不同物種間CNGC基因的數量存在差異。亞細胞定位預測分析表明，大多數MsCNGC蛋白定位于細胞膜，與擬南芥CNGC基因的亞細胞定位相似［10］，推測CNGC蛋白主要在細胞膜上發揮功能。物種間的系統發育關系是生物學研究的基礎。紫花苜蓿和擬南芥中CNGC蛋白的系統發育關系發現，紫花苜蓿和擬南芥的CNGC蛋白被劃分為4個亞家族（圖1），并且在第Ⅱ和第Ⅳ亞家族中紫花苜蓿與蒺藜苜蓿的CNGC蛋白被劃分到同一分支，表明紫花苜蓿和蒺藜苜蓿有較高的親緣性。

基因的功能域是調控順式作用元件活性和基因表達的重要因素。擬南芥［10］、玉米［27］、小麥［29］的CNGC蛋白都含有典型的cNMP/CNBD和ITP功能域，能促進陽離子運輸［25］。而MsCNGC蛋白成員也含有典型的cNMP/CNBD和ITP功能域，表明MsCNGC蛋白可能也具有運輸陽離子功能。外顯子和內含子的結構影響基因的表達和蛋白質的功能，意味著外顯子和內含子使基因在生物體中發揮重要作用，從而維持生命［26］。內含子和外顯子分析發現，MsCNGC基因家族成員的內含子數目分別是4～45不等。雖然部分基因外顯子/內含子結構相似，但序列長度不同（圖2），這與其他植物的外顯子/內含子結構相似，如玉米［27］、水稻［28］、小麥［29］等，說明CNGC家族基因的結構相對復雜。基因啟動子區域內的順式作用元件在基因表達調控中起著至關重要的作用，基因啟動子中不同類型的順式作用元件預示著該基因在應對不同脅迫時可能具有不同的功能［30］。對啟動子順式作用元件分析發現，MsCNGCs的啟動子中包含大量的植物激素（ABA，IAA，JA，GA）響應元件、光響應元件和脅迫（光照，低溫，干旱）響應元件（圖3），表明MsCNGC基因可能參與調控脅迫響應及植物激素信號轉導。例如， MsCNGC2.2，MsCNGC4.1，MsCNGC4.2和MsCNGC7.3 基因含有干旱響應（MBS）元件，表明它們可能在干旱脅迫下具有活性。 MsCNGC7.2和MsCNGC8.3 基因具有多個激素應答元件，它們可能在植物的激素應答和各種生理代謝過程的調控中發揮作用。

MsCNGC基因分布在紫花苜蓿的7條染色體上，第6號染色體上沒有MsCNGC基因，因此，MsCNGC的分布是不均勻，與玉米、水稻CNGC基因在染色體上的分布相似［26，28］。基因復制是基因組進化和物種遺傳最重要的驅動力之一［31］。植物中基因家族擴增的兩個主要原因是節段重復和串聯重復。基因復制不僅可以為基因家族增加新成員，還可以豐富基因家族的功能，極大地促進了各種生物的遺傳進化［32］。在本研究中，MsCNGC基因家族中存在2對節段重復事件（ MsCNGC1/MsCNGC4.2，MsCNGC7.3/MsCNGC8.2 ）（圖4A），表明他們可能在功能上具有相似性。MsCNGCs基因與蒺藜苜蓿之間存在共線性關系，可能由于其是同科植物和親緣關系較近，也表明它們可能具有相似的功能，這需要進一步的研究。MsCNGC與擬南芥存在共線性，為預測MsCNGC基因的表達和蛋白的功能提供了依據。進一步蛋白質相互作用網絡預測發現，MsCNGC4與MsCNGC7.2之間存在蛋白互作，同時MsCNGC蛋白還與CBL，CIPK，NHX7，POT5和CPK32蛋白之間存在互作關系。這些結果為深入研究MsCNGC蛋白的潛在功能提拱了依據。組織表達分析表明，第ⅣB亞家族中 MsCNGC4.1和MsCNGC8.1 的組織表達一致，可能與它們的親緣性較高有關（圖1）。MsCNGC基因具有組織表達特異性，例如， MsCNGC4.2和MsCNGC5基因只在花中表達，MsCNGC3.1 基因只在葉中表達，說明MsCNGCs在各個組織中發揮著不同的作用。類似的，ZmCNGC5在玉米花粉中的特異性表達高于其他組織， ZmCNGC10、ZmCNGC11和ZmCNGC12 在玉米胚中的表達量都相對較高［27］，說明這些基因在玉米的花粉和胚的生長發育中起著至關重要的作用。

CNGC家族基因參與了非生物脅迫響應過程［13，16，21］。轉錄組數據分析表明，大多數MsCNGC基因在冷、鹽、干旱和ABA脅迫下表達量下降，有少數MsCNGC基因的表達量上升。如 MsCNGC2.2、MsCNGC5、MsCNGC8.4、MsCNGC8.5 受冷脅迫誘導下在2 h顯著上調表達，該結果與 RcCNGC14 和部分油菜籽CNGCs在冷誘導下的表達模式相同［13］；第Ⅲ亞家族中 MsCNGC7.1和MsCNGC7.2 在冷脅迫誘導下的表達水平一致，這與它們可能在進化關系上的親緣性較高有關（圖2A）。在鹽處理下 MsCNGC2.2與擬南芥中的AtCNGC19和AtCNGC20 的表達水平類似［19］，它們可能參與了植物對鹽脅迫時的生理調控。 MsCNGC5、MsCNGC8.5與PtrCNGC15.2、PtrCNGC15.3 在干旱脅迫下的表達相似［12］。研究發現沉默 SlCNGC15 基因的表達可提高番茄耐旱性，為進一步研究MsCNGC基因在非生物脅迫下的功能提供依據［33-35］。

4 結論

本研究對紫花苜蓿的CNGC家族成員進行了鑒定分析，從紫花苜蓿參考基因組中共鑒定出16個MsCNGC基因，并對其蛋白分子特征、進化關系、保守基序、基因結構、重復事件、共線性關系、順式作用元件和表達模式進行了研究。MsCNGC基因被劃分為4個亞家族，所有成員均含有cNMP/CNBD和ITP功能域。MsCNGC基因家族內存節段重復事件，紫花苜蓿與蒺藜苜蓿和擬南芥之間存在物種間共線性關系。MsCNGC基因的啟動子區含有大量與非生物應激和激素響應相關的順式作用元件。MsCNGC基因具有組織表達特異性。MsCNGC基因參與調控紫花苜蓿的冷、干旱、鹽和ABA等非生物脅迫響應過程，其中， MsCNGC3.2，MsCNGC5和MsCNGC8.5 能是調控紫花苜蓿耐干旱的關鍵差異基因。

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（責任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-09-26；修回日期：2023-11-16

基金項目： "國家自然科學基金項目（32101426）；寧夏自然科學基金項目（2023AAC05019）資助

作者簡介：

李小紅（1996-），男，回族，寧夏固原人，碩士研究生，主要從事牧草抗逆育種研究，E-mail：lxh0895@163.com；*通信作者Corresponding author，E-mail：lishuxia620@163.com