褪黑素浸種對鋁脅迫下苜蓿種子萌發(fā)及幼苗抗氧化生理的影響

摘要： 為探明外源褪黑素（Melatonin，MT）溶液浸種對鋁脅迫下紫花苜蓿（Medicago sativa L.）種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，本試驗以‘WL525HQ’（耐鋁）和‘三得利’（敏鋁）紫花苜蓿為材料，使用不同濃度MT溶液（0，100，200，400，800 μmol·L-1）浸種，測定鋁脅迫（1 mmol·L-1）下種子萌發(fā)、幼苗生長、幼苗抗氧化生理等指標。結果表明，鋁脅迫抑制了紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長，MT浸種通過提高抗氧化酶活性、減少H2O2和丙二醛的積累來減輕鋁脅迫給紫花苜蓿帶來的氧化傷害；且隨著MT溶液濃度的增加，紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長、株高、生物量及根系抗氧化酶活性呈先升后降趨勢，H2O2和丙二醛含量呈先降后升趨勢，‘WL525HQ’的變化幅度高于‘三得利’。綜合發(fā)芽指標、生長指標、抗氧化酶活性、H2O2和丙二醛含量評價不同濃度MT對苜蓿鋁毒害的緩解效果表明：200 μmol·L-1處理效果較好，400 μmol·L-1次之，800 μmol·L-1最差。

關鍵詞： 褪黑素；紫花苜蓿；鋁脅迫；種子萌發(fā)；幼苗生長

中圖分類號：S963.22+3.3 """文獻標識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0535-08

Effects of Melatonin on Seed Germination and Antioxidant Physiology of

Alfalfa Seedlings Under Aluminum Stress

LI Qi-jiao1， CUI Dong-yi2， DUAN Xin-hui1， LIU Li1， XU Wen-hua1， LI Qing-xi1，

ZHENG Li-wen1， REN Jian1， ZHU Li-min1， MA Xiang-li1*

（1.Yunnan Agricultural University Yunnan， Kunming， Yunnan Province 650201， China; 2. Diqing Academy of Animal

Husbandry and Veterinary Science， Shangri-La， Yunnan Province 674400， China）

Abstract： To investigate the effects of exogenous melatonin （MT） solution on seed germination and seedling growth of Medicago sativa L. under aluminum stress，‘WL525HQ’ （aluminum resistant） and ‘Suntory’ （aluminum sensitive） alfalfa were used as materials. The seeds were soaked with MT solution of different concentrations （0，100，200，400，800 μmol·L-1），and the seed germination，seedling growth，and antioxidant physiology of seedlings were measured under aluminum stress （1 mmol·L-1）. The results showed that aluminum stress inhibited the seed germination and seedling growth of alfalfa. MT seed soaking alleviated the oxidative damage caused by aluminum stress by increasing the activity of antioxidant enzymes and reducing the accumulation of H2O2 and MDA. With the increase of MT solution concentration，alfalfa seed germination rate，germination potential，root length，plant height，biomass and root antioxidant enzyme activity increased first and then decreased，while H2O2 and MDA contents decreased first and then increased. The variation range of ‘WL525HQ’ was higher than that of ‘Suntory’. The effects of different concentrations of MT on alfalfa aluminum toxicity were evaluated by combining germination indexes，growth indexes，antioxidant enzyme activities，H2O2 and MDA contents. The results showed that 200 μmol·L-1 treatment had the best effect，400 μmol·L-1 was the second，and 800 μmol·L-1 was the worst.

Key words： Melatonin;Alfalfa;Aluminum stress;Seed germination;Seedling growth

鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素，在弱酸性或中性土壤中，主要以沉淀態(tài)和聚合態(tài)（如鋁硅酸鹽和氧化物等）形式存在，對植物沒有毒性，然而，在酸性條件下，特別是當土壤pH值低于5時，土壤中大量沉淀態(tài)和聚合態(tài)的鋁會被溶解和活化，釋放出對植物有毒害作用的Al3+［1-2］。鋁毒害對植物的影響主要體現在種子萌發(fā)［3］、根系生長［4］、抗氧化酶活性變化［5］等方面。我國酸性土壤遍及10多個省市，尤其是我國長江以南地區(qū)廣泛分布著以紅壤為主的酸性富鋁化土壤，因而在生產中經常發(fā)生鋁毒害嚴重影響農作物產量和品質的現象［6］。

褪黑素（Melatonin，MT）又稱松果體素，化學名稱為N-乙?；?5-甲氧基色胺（C13H16N2O2），是一種與生長素具有類似結構的植物激素［7］。MT在植物體內含量微小，卻在植物生長、生理調節(jié)、增加植物抗逆性方面起著非常重要的作用［8-9］。MT是一種良好的抗氧化劑，可以直接清除植物體內的自由基，提高抗氧化劑含量，并增加與抗氧化酶有關基因的表達，以保護植物不受過氧化損傷，最終維持細胞膜結構的完整性［10］。近年來，外源MT處理已逐步運用于農業(yè)生產中，外源MT的添加能提高植物對逆境（紫外線輻射、高溫、低溫、干旱、重金屬脅迫等）的耐受性及對病蟲害的抵抗能力［11-14］。秦彬等［15］研究表明，MT浸種顯著提高了干旱脅迫下大豆種子的發(fā)芽能力，促進了根系發(fā)育，激活了大豆體內抗氧化酶活性，緩解了由干旱脅迫導致的細胞滲透體系失衡所帶來的損傷。此外，外源MT處理可顯著提高鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗體內抗氧化酶活性，減少自由基的積累，增強抗氧化系統(tǒng)的防御能力，促進紫花苜蓿植株生長［16］。由此可見，外源MT的應用對植物抵抗逆境脅迫具有重要意義。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上栽培歷史最悠久、種植面積最大的重要豆科牧草，其產量高、營養(yǎng)豐富，有著“牧草之王”的美譽，在草地畜牧業(yè)中具有重要的價值，是我國重點推廣的優(yōu)良多年生豆科牧草［17-18］。紫花苜蓿是一種對鋁毒非常敏感的豆科牧草，很難適應我國南方的酸性土壤，嚴重制約現代畜牧業(yè)的發(fā)展［19］。隨著南方畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，對紫花苜蓿等優(yōu)質牧草的需求逐漸增加［20］。但由于紫花苜蓿在酸性土壤中易受鋁毒害，嚴重限制了紫花苜蓿在我國南方酸性土壤上的種植。因此，研究紫花苜蓿耐鋁毒反應機制，對紫花苜蓿在南方的推廣種植具有重要意義。

目前，外源MT緩解植物逆境脅迫方面的研究已成熟，但主要集中于農作物，對緩解紫花苜蓿鋁脅迫的研究鮮少報道。因此，本研究擬以耐鋁型紫花苜蓿品種‘WL525HQ’和鋁敏感型紫花苜蓿品種‘三得利’為材料，通過MT浸種，探討外源MT浸種對鋁脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，為紫花苜蓿在酸性富鋁土壤上的種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為課題組前期篩選獲得并通過預實驗初步確定的對鋁毒耐性有顯著差異的2份紫花苜蓿材料：‘WL525HQ’和‘三得利’。其中‘WL525HQ’為耐受型，‘三得利’為敏感型。供試苜蓿種子均于2021年9月購自云南綠盛美地園林景觀有限公司，發(fā)芽率均≥90%，將種子保存于陰冷干燥處。本試驗于2022年3月在云南農業(yè)大學草學實驗室進行。

1.2 試驗方法

（1）種子處理：紫花苜蓿種子先經1.5%的硫酸銅溶液浸泡半小時進行消毒處理后用蒸餾水清洗3遍，再用磁力攪拌器清洗種子包衣。

（2）褪黑素浸種處理：種子處理完成后，將種子置于25℃、黑暗條件下并利用不同濃度的MT溶液（0，100，200，400，800 μmol·L-1）浸種24 h，期間更換3次溶液。

（3）材料培養(yǎng)：將浸種處理好的種子晾干至表面無水分，根據不同處理濃度將100粒大小均勻一致的種子放于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿內，濾紙使用5 mL含1 mmol·L-1 AlCl3的0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液（pH值為4.5）浸濕，并放入人工培養(yǎng)箱中發(fā)芽（光周期14 h／10 h，晝溫25℃，夜溫20℃，濕度為60%，光照為4 000 lx），每天觀察培養(yǎng)情況，據實際情況更換濾紙，且需保持各培養(yǎng)皿含水量相同。

實驗共設置6個處理，分別為：

①蒸餾水處理種子（CK）

②鋁脅迫處理+蒸餾水處理種子（Al）

③鋁脅迫處理+100 μmol·L-1褪黑素處理種子（Al+MT100）

④鋁脅迫處理+200 μmol·L-1褪黑素處理種子（Al+MT200）

⑤鋁脅迫處理+400 μmol·L-1褪黑素處理種子（Al+MT400）

⑥鋁脅迫處理+800 μmol·L-1褪黑素處理種子（Al+MT800）

培養(yǎng)時間為7 d，每個處理3次重復。每天觀察發(fā)芽情況，調查種子發(fā)芽數，當胚根突破種皮，長度為種長一半時計為發(fā)芽種子，繼續(xù)培養(yǎng)3 d測定種子發(fā)芽勢，培養(yǎng)7 d測定種子發(fā)芽率。并于第7 d收集幼苗用于測定其他指標。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 發(fā)芽勢與發(fā)芽率 """"發(fā)芽勢=培養(yǎng)3 d后供試種子的發(fā)芽數/供試種子數×100%；發(fā)芽率=培養(yǎng)7 d后供試種子的發(fā)芽數/供試種子數×100%［21］。

1.3.2 根長、株高與生物量 """將處理7 d的紫花苜蓿幼苗沖洗干凈后，用吸水紙將表面水分吸干，取苜蓿單株用直尺測量其根長及株高；然后每皿取10 株，將地上部和地下部分開，分別烘干，測定地上部（莖和葉）和地下部（根系）的干重［21］。

1.3.3 根系抗氧化酶活性 """將處理7 d的紫花苜蓿幼苗沖洗干凈后，用吸水紙將表面水分吸干，取其根系，測定抗氧化酶活性，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性參照鄒琦等［22］方法進行測定。

1.3.4 根系膜脂過氧化物質含量 """將處理7 d的紫花苜蓿幼苗沖洗干凈后，用吸水紙將表面水分吸干，取其根系，測定根系膜脂過氧化物質含量，H2O2含量及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量參照孫群等［23］方法進行測定。

1.4 數據處理

1.4.1 數據統(tǒng)計及分析 ""采用Microsoft Excel 2007進行數據統(tǒng)計、做圖。使用SPSS 23.0進行數據統(tǒng)計分析，并進行單因素方差分析。差異顯著性采用Duncan檢驗法。

1.4.2 不同濃度MT處理提高苜蓿的耐鋁性綜合評價 ""采用模糊綜合評判方法中的隸屬函數公式，以綜合評價不同濃度MT對苜蓿鋁毒害的緩解效果。其中，與耐鋁性呈正相關的指標用公式（1）計算，與耐鋁性呈負相關的指標用公式（2）計算；隸屬函數法進行評定時，隸屬函數平均的值越大，則耐鋁性越強。

（1）隸屬函數=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）

（2）反隸屬函數=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）

公式中Xi為指標測定值，Xmin和Xmax分別為全部參試材料某一指標的最小值和最大值。

2 結果和分析

2.1 "MT浸種對鋁脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，與CK相比，Al處理下‘WL525HQ’和‘三得利’兩個品種種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢顯著降低（Plt;0.05），發(fā)芽率分別降低了22.57%和24.18%，發(fā)芽勢分別降低了20.31%和23.57%。使用MT浸種對Al處理下‘WL525HQ’和‘三得利’種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均有不同程度的提升，隨著褪黑素濃度的升高，發(fā)芽勢和發(fā)芽率均呈現先升高后下降趨勢。其中，Al+MT200處理下發(fā)芽率及發(fā)芽勢提升最大，與Al處理相比，‘WL525HQ’和‘三得利’的發(fā)芽率分別提高了25.12%和23.57%，發(fā)芽勢分別提高了14.91%和20.74%。

2.2 MT浸種對鋁脅迫下紫花苜蓿幼苗生長的影響

由表1和表2可知，‘WL525HQ’和‘三得利’不同處理下根長、地上部干重及地下部干重變化趨勢一致，均為CKgt;Al+MT200gt;Al+MT400gt;Al+MT100gt;Algt;Al+MT800。與CK相比，Al處理顯著降低了兩個品種紫花苜蓿幼苗根長、株高、地上部干重及地下部干重 （Plt;0.05）。與Al處理相比，使用200 μmol·L-1MT浸種處理效果最顯著（Plt;0.05），‘WL525HQ’和‘三得利’的根長分別提高了66.67%和47.86%，株高分別提高了41.50%和33.50%，地上部干重分別提高了63.64%和42.99%，地下部干重分別提高了170.37%和96.30%。

2.3 MT浸種對鋁脅迫下紫花苜蓿幼苗根系膜脂過氧化物質含量的影響

由圖2可知，與CK相比，鋁脅迫下兩個品種紫花苜蓿幼苗根系H2O2和MDA含量顯著增加（Plt;0.05），‘WL525HQ’和‘三得利’的H2O2含量分別增加了37.97%和41.76%，MDA含量分別增加了74.13%和125.76%。鋁脅迫下，隨著褪黑素浸種濃度的增加，H2O2和MDA含量變化趨勢一致，均為先減少后增加。其中，與Al處理相比，Al+MT200處理下H2O2和MDA含量最低，‘WL525HQ’和‘三得利’的H2O2含量分別降低了27.52%和27.03%，MDA含量分別降低了32.77%和33.83%。

2.4 MT浸種對鋁脅迫下紫花苜蓿幼苗根系抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，與CK相比，Al處理顯著增加了‘WL525HQ’和‘三得利’幼苗根系POD，SOD和CAT活性（Plt;0.05）。與Al處理相比，使用MT浸種‘WL525HQ’和‘三得利’幼苗根系POD，SOD和CAT活性變化程度不同，其中Al+200 μmol·L-1MT處理下三個酶活性最強，‘WL525HQ’和‘三得利’的POD活性分別增加了6.86%和5.98%，SOD活性分別增加了5.53%和6.63%，CAT活性分別增加了17.11%和17.68%。

2.5 MT浸種對鋁脅迫下紫花苜蓿耐鋁性綜合評價

采用模糊綜合評判方法中的隸屬函數公式，對不同濃度MT處理下兩個品種紫花苜蓿的各項指標分別求其平均值，并對其進行排序，排名越靠前，表明該處理下苜蓿耐鋁性越強。由表3和表4可知，綜合各項指標表明， ‘WL525HQ’和‘三得利’排序均為CKgt;Al+MT200gt;Al+MT400gt;Al+MT100gt;Al+MT800gt;Al。除CK以外，兩個品種均為Al+MT200處理綜合得分最高，‘WL525HQ’為0.72，‘三得利’為0.70，Al處理綜合得分最低，‘WL525HQ’和‘三得利’均為0.16。即200 μmol·L-1MT溶液浸種處理下兩個品種紫花苜蓿耐鋁性最強，Al處理下耐鋁性最弱。

3 討論

鋁毒是酸性土壤中植物生長發(fā)育的主要限制因子，種子萌發(fā)是植物生活史中最先受到鋁脅迫影響的生命活動［24］。施加外源MT，能夠促進植物種子內部營養(yǎng)物質的積累，增加種子的干物質質量和鮮物質質量，進而提高發(fā)芽率［25］。研究發(fā)現，1 mmol·L-1AlCl3顯著降低了兩個品種紫花苜蓿的發(fā)芽率和發(fā)芽勢（Plt;0.05），利用不同濃度MT浸種后，紫花苜蓿種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢均有一定程度的提升，這與耿書德等［26］對鹽脅迫下外源MT浸種對西瓜種子萌發(fā)的影響研究一致。

根系是植物的主要營養(yǎng)器官之一，植物根系與地上部分相互作用、共同協(xié)調，促使植物能正常生長發(fā)育［27］。對植物產生傷害的先決條件是根尖細胞Al3+的積累，主要表現為抑制根系伸長，影響作物生長［28］。1 mmol·L -1 AlCl3鋁脅迫使紫花苜蓿幼苗根長、株高、地上生物量和地下生物量顯著降低（Plt;0.05）。利用MT浸種后，鋁脅迫對紫花苜蓿幼苗生長的抑制有所緩解，原因可能是MT可以通過促進鋁脅迫下紫花苜蓿根系發(fā)育，增強根系對營養(yǎng)物質的吸收、轉運、積累和利用，從而促進紫花苜蓿地上部分生長［29］。

鋁脅迫會使植物體內產生大量的活性氧自由基，破壞保護系統(tǒng)平衡，且當自由基的產生和積累達到一定值時，就會發(fā)生膜傷害，最終導致植物死亡［29］。H2O2是機體內具有強破壞力的活性氧，是植物氧化損傷的主要指標，H2O2過量積累會加劇膜脂過氧化作用，進而使細胞膜受到傷害，同時也會激活自身氧化還原系統(tǒng)［31-32］。MDA是膜質過氧化的產物，其含量多少與細胞膜的氧化損傷呈正相關關系［33-34］。MT具有極強的抗氧化功能，能有效緩解活性氧積累的傷害，保護植物細胞結構，并清除自由基［35］。本試驗發(fā)現鋁脅迫使紫花苜蓿幼苗根系MDA和H2O2含量顯著增加，這與何皇成等［36］研究一致。植物體內MDA的不斷積累會引起膜損傷，導致膜結構與生理完整性的破壞［37］。使用外源MT浸種后，MDA和H2O2含量降低，且以200 μmol·L -1MT溶液浸種處理效果最優(yōu)。說明適宜濃度的MT可以一定程度上降低植物體內的H2O2含量，并減緩活性氧產生速率，降低MDA的含量，從而降低了鋁脅迫造成的脂質過氧化程度，維持了膜的穩(wěn)定性，對植物幼苗根系的細胞膜起到保護作用［25］。

抗氧化酶是細胞抵御氧化應激系統(tǒng)的主要成分，植物通過積累抗氧化酶清除細胞中多余的活性氧等有害物質，同時達到抵御外界脅迫的目的［38］。本研究發(fā)現，鋁脅迫下，紫花苜蓿幼苗根系SOD，POD，CAT活性顯著增加，說明當發(fā)生逆境脅迫時，植物可通過自身的調節(jié)機制提高酶活性以應對逆境脅迫［39］。SOD，POD和CAT是植物抗氧化酶系統(tǒng)中的關鍵酶，這一系列的酶系統(tǒng)通過相互協(xié)調、相互配合，構成了植物抵御外界脅迫的防御系統(tǒng)［40］。SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，可以將超氧陰離子轉化為H2O2，然后POD和CAT再將產生的H2O2轉變?yōu)镠2O從而起到解毒作用［41］。MT是目前已知的抗氧化作用最強的內源性自由基清除劑，植物中MT的主要功能是充當活性氧清除劑，作為抵御植物內部和環(huán)境氧化應激的第一道防線［42-43］。研究表明，MT能刺激抗氧化酶使抗氧化酶活性上調，提高線粒體氧化磷酸化效率，減少線粒體氧化磷酸化過程中的電子泄露，增加其它抗氧化物質的效率，進而調節(jié)植物生長、發(fā)育和防御各種環(huán)境脅迫［44］。本試驗中，使用MT溶液浸種后，兩個品種紫花苜蓿根系SOD，POD和CAT活性均高于Al處理，且隨著MT濃度的升高，抗氧化酶活性呈現先升高后降低的趨勢，表明外源MT可以增加植物體內抗氧化酶的活性，緩解鋁脅迫對紫花苜蓿幼苗造成的氧化損傷。

4 結論

綜上所述，鋁脅迫會使紫花苜蓿幼苗根系損傷，積累大量的MDA及H2O2，抑制種子萌發(fā)，影響紫花苜蓿幼苗正常生長。使用100～800 μmol·L -1MT溶液浸種可提高鋁脅迫下紫花苜蓿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，促進其幼苗根系發(fā)育及地上部分生長，提高紫花苜蓿幼苗根系抗氧化酶活性，減少根系內MDA與H2O2的積累，增強紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長階段抵抗鋁脅迫的能力。且200 μmol·L -1 MT浸種處理對供試紫花苜蓿鋁脅迫緩解效果最佳。

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（責任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-06-03；修回日期：2023-08-15

基金項目： "云南省農業(yè)基礎研究聯合專項（202301BD070001-163）；洱源縣飼草產業(yè)科技特派團（202304BI090008）資助

作者簡介：

李啟嬌（1999-），女，漢族，云南昆明人，碩士研究生，主要從事牧草資源及育種研究，E-mail：1789181285@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：xfmaxiangli@126.com