三種蔥蓮屬植物的倍性及FISH核型分析

摘要： 本研究以5S rDNA為探針，利用FISH技術對3種蔥蓮屬栽培品種有絲分裂中期染色體上的rDNA位點進行物理定位，分析3種蔥蓮屬栽培品種的倍性及FISH核型。結果表明：3個品種存在兩種倍性，其中‘Lily Pies’和‘Fragrance’為二倍體、‘King′s ramson’為四倍體。它們的核型特點表現為：（1）‘Lily Pies’核型公式2n=2x =24=6 m+18 sm，染色體相對長度范圍為6.17%～12.80%，屬于2B型；（2）‘Fragrance’核型公式2n=2x=24=14 m+10 sm，染色體相對長度范圍為6.36%～12.08%，屬于2A型；（3）‘King’ s ramson’核型公式2n=4x=48=28 m+20 sm，染色體相對長度范圍為5.68%～13.55%，屬于2B型。3種蔥蓮屬植物的FISH位點均位于染色體的長臂末端，分別為‘Lily Pies’含有4個5S rDNA位點，在6號和8號的兩條染色上；‘Fragrance’含有3個5S rDNA位點，在兩條6號染色體以及一條8號染色上；‘King′s ramson’含有4個5S rDNA位點，分別在一條2號染色體、兩條6號染色體和一條8號染色體上。本研究對蔥蓮屬3個栽培品種的倍性和FISH核型的分析，將為該物種的遺傳多樣性分析和基因組結構解析提供新的信息。

關鍵詞： 蔥蓮屬；倍性；染色體核型；5S rDNA；熒光原位雜交

中圖分類號：S682.2 """文獻標識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0444-06

Analysis of Ploidy Levels and FISH Karyotypes of Three Zephyranthes Cultivars

XIAO Kong-zhong1*， LI Hui2， YAN Jian-xing1， YANG Li-jie1， LEI Lei1，3

（1. Soil and Water Conservation， Nanchang Institute of Technology， Nanchang， Jiangxi Province 330099， China； 2. School of Civil and

Architectural Engineering， Nanchang Institute of Technology， Nanchang， Jiangxi Province 330099， China; 3. Jiangxi Provincial

Engineering Research Center of Seed-Breeding and Utilization of Camphor Trees， Nanchang， Jiangxi Province 330099， China）

Abstract： In this study，Fluorescence in situ hybridization （FISH） was used to physically locate the 5S rDNA repeat on the metaphase chromosomes of three Zephyranthes cultivars. The ploidy and FISH karyotype of 3 Zephyranthes cultivars were analyzed. The results showed that there were two types of ploidy in the three cultivars，among which ‘Lily Pies’ and ‘Fragrance’ were diploid and ‘King’s ramson’ was tetraploid. The karyotype characteristics were as follows： ‘Lily Pies’ karyotype formula 2n=2x=24=6 m+18 sm，the relative length of chromosome ranged from 6.17% to 12.80%，and the karyotype belonged to 2B type. The formula of ‘Fragrance’ karyotype 2n=2x=24=14 m+10 sm，the relative length of chromosome was 6.36%12.08%，and the karyotype belonged to 2A type. The formula of ‘King’s ramson’ karyotype was 2n=4x=48=28 m+20 sm，the relative length of chromosome ranged from 5.68% to 13.55%，and the karyotype belonged to 2B type. The FISH loci of the three species were located at the end of the long arm of the chromosome，showing that ‘Lily Pies’ contained four 5S rDNA loci，which were on two homologous stains of No. 6 and No. 8，respectively. ‘Fragrance’contained three 5S rDNA loci，which were on two homologous chromosomes of No. 6 and one stain of No. 8. ‘King’s ramson’ contained four 5S rDNA loci，which were on one on No. 2，two on No. 6 and one on No. 8. In this study，the ploidy levels and the FISH karyotypes analyzed in three cultivars of Zephyranthes would provide new information for the analysis of genetic diversity and genome structure of this species.

Key words： Zephyranthes;Ploidy;Karyotype;5S rDNA;Fluorescence in situ hybridization

蔥蓮屬（Zephyranthes）植物，全屬大約70種，廣泛分布于美洲大陸、印度群島和墨西哥等地［1-2］。該屬植物大多具有較高的藥用價值，全草含多種生物堿，包括石蒜堿、多花水仙堿、尼潤堿等，具有抗癌、抗真菌和抑菌活性［3］。除了它們的藥用價值以外，更為突出的是它的觀賞價值，在我國園林綠化中廣泛栽培［4］。在夏季由于暴雨帶來的大量水分或急劇降溫，會出現大量開花的現象，因此也被稱為風雨蘭或雨百合［5］。

在分類學上，蔥蓮屬是一個多樣性很強的屬，種間具有較小的區別且形態上非常相似。現有的約50種蔥蓮屬植物的染色體數據庫表明，蔥蓮屬是一個進化活躍的屬，這從它的染色體基數種類繁多，且各基數相互之間沒有規律［6］。其染色體基數有x=5，6，7，8，9，12，13，16，19 ［7］。同時它的體細胞染色體數也具有廣泛變異，有從Z. seubertii的2n=10到園藝雜交種的2n=200之間變化［8］。我們常見的蔥蘭（Z. candida）就含有染色體數目2n=38，40，41的報道［9］。此外，該屬里的某一部分物種，常常會出現結構變化而導致染色體核型異常的現象［9］。目前市場上流行的蔥蓮屬植物大多是以栽培品種的形式出現，而對于它們的來源以及倍性特點的報道較少。為了減少育種的盲目性，因此，有必要去了解流行品種的倍性以及親緣關系的遠近特點。

隨著分子細胞遺傳學的發展，熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization，FISH）可實現染色體的識別和定位，這一技術已成功應用在百合屬、大麥屬、六出花屬、蕓苔屬、擬南芥屬等多種植物中進行染色體的來源分析與基因滲入鑒定［10-11］。本研究通過對3種蔥蓮屬栽培品種的倍性以及染色體FISH分析，建立了蔥蓮屬植物的5S rDNA標記的細胞遺傳學核型圖，為蔥蓮屬植物的遺傳多樣性分析、基因組結構研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料

3個蔥蓮屬植物栽培品種‘Lily Pies’‘Fragrance’‘King’s ramson’，購于浙江虹越花卉有限公司。3個品種均由印尼進口，主要應用于我國的園林綠化以及家庭盆栽中，種植于南昌工程學院生態科技園，進行常規水肥管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體制片 ""染色體制片參照Xiao等［12］的方法。將3種植物種植在泥炭土中進行發根，待新生的幼根在2 cm左右取下。用0.7 mmol·L-1的放線菌酮處理4 h，然后置于卡諾固定液固定至少12 h，再進行酶解、壓片、冰凍、揭片、脫水、干燥、鏡檢等步驟。而后將制片放入4℃冰箱備用。

1.2.2 "熒光原位雜交 ""5S rDNA重復序列探針5′- GGATGCGATCATACCAGCACTAATGCACCGGA- TCCCATCAGAACTCCGCAGTTAAGCGT-3′雙端進行TAMRA（紅色）標記，由北京擎科生物有限公司合成。原位雜交步驟：（1）配制雜交液，雜交液由2 μL 20× SSC（3 mol·L-1 NaCl和0.3 mol·L-1檸檬酸鈉組成，pH值= 7）、4 μL dextransulfate（硫酸葡聚糖）、2 μL 5S rDNA探針、12 μL dd-H2O組成；（2）雜交：將雜交液混勻加在1.2.1步驟中制備好染色體的載玻片上，迅速蓋好蓋玻片在37℃濕潤保溫盒中孵育6 h；（3）洗片：42℃下用2× SSC洗滌3次，每次5 min；（4）封片：將洗好的玻片風干，再每張制片滴加10 μL含有DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）的封片劑封片。最后在顯微鏡熒光模式下觀察拍照。藍紫色為染色體，紅色為5S rDNA信號位點。

1.2.3 染色體核型參數計算方法 ""（1）染色體長度：X總長= ΣX短臂長+ ΣX長臂長，X相對= （ΣX短臂長+ΣX長臂長）÷（X總長）×100%。進行核型分析時，長度一般取X相對。

（2）核型不對稱系數：As×K%=ΣX長臂長/X總長。

（3）臂比和著絲點位置：臂比：AR=X長臂長/X短臂長；染色體類型依據著絲粒位置進行分類，采用Stephens等［13］的標準，如表1所示。

（4）平均臂比：AVG（AR）=ΣAR/n

（5）核型分類：根據染色體的臂比和長度比將核型分為12類［13］，如表2所示。

2 結果與分析

‘Lily Pies’的體細胞數目、FISH核型及核型模式圖（圖1a），核型參數如下表（表3）。‘Lily Pies’為二倍體，體細胞含有24條染色體，染色體基數x=12，核型公式為2n=2x=24= 6 m+18 sm。有6條“m”型和18條“sm”型染色體組成。染色體的相對長度在6.17%～12.80%之間，染色體最長/最短為2.07，長臂/短臂平均為1.83，核型不對稱系數為63.85%，臂比值大于2的染色體占33.33%，核型分類為2B型（表4）。利用5S rDNA的FISH實驗，得出‘Lily Pies’含有4個5S rDNA的信號位點，分別是在6號和8號同源染色體的長臂末端。

‘Fragrance’的體細胞數目、核型及核型模式圖如下圖（圖1b），核型參數如下表（表3）。‘Fragrance’為二倍體，體細胞含有24條染色體，染色體基數x=12，核型公式為2n=2x=24=14 m+10 sm。有14條“m”型和10條“sm”型染色體組成。染色體的相對長度在6.36%～12.08%之間，染色體最長/最短為1.90，長臂/短臂平均為1.81，核型不對稱系數為63.56%，臂比值大于2的染色體占33.33%，核型分類為2A型（表4）。利用5S rDNA的FISH實驗，得出‘Fragrance’含有3個5S rDNA的信號位點，分別是在6號的兩條同源染色體和8號的一條染色體上，均位于染色體的長臂末端。

‘King′s ramson’的體細胞數目、核型及核型模式圖如下圖（圖1 c），核型參數如下表（表3）。‘King′s ramson’為四倍體，體細胞含有48條染色體，染色體基數x=12，核型公式為2n= 4x=48=28 m+20 sm。有28條“m”型和20條“sm”型染色體組成。染色體的相對長度在5.68%～13.55%之間，染色體最長/最短為2.39，長臂/短臂平均為1.60，核型不對稱系數為60.42%，臂比值大于2的染色體占8.33%，核型分類為2B型（表4）。利用5S rDNA的FISH實驗，得出‘King′s ramson’含有4個5S rDNA的信號位點，分別是在2號的一條同源染色體、6號的兩條染色體和8號的一條染色體上，所在染色體上的位置均位于長臂末端。

由此可知，3個蔥蓮屬植物存在兩種不同的倍性，分別為二倍體和四倍體。利用熒光原位雜交技術，鑒定了這3個品種的5S rDNA所在染色體上的位置發現，3個品種的5S rDNA位點數量不相同，其中‘Lily Pies’的位點在同源染色體上對稱分布，表現出原始種的特性；而另外2個栽培品種信號位點在同源染色體上非對稱分布，它們可能是通過雜交或遠緣雜交的方式選育而來的雜交種。通過比較5S rDNA信號的位置，發現它們具有的共同的特點是，所有的5S rDNA信號均位于染色體的長臂端部，并且6號染色體均含有5S rDNA的信號。結合5S rDNA信號所在的位置以及信號強弱可以得出，5S rDNA在蔥蓮屬植物中表現出一定的位置保守性，但在拷貝數方面已顯示出差異。

3 討論

rDNA是所有真核生物所必須的序列，本研究中的3種蔥蓮屬植物的5S rDNA位點均位于染色體的長臂末端，與Felix等［7］分析的7種蔥蓮屬植物的結果一致。表明蔥蓮屬植物雖然處于進化活躍的階段，其5S rDNA在染色體上的位置分布相對穩定。其中5S rDNA位點在不同染色體上主要表現為數目和大小的差異，這與前人的相關研究一致［14］。

從染色體核型角度分析，蔥蓮屬植物具有較豐富的染色體倍性，如Z. candida Herb.體細胞染色體存在多種類型2n=24，26，36，38，39，40，41，42，49［9，15］；也有如在Z.rosea中發現體細胞染色體有2n =26，27，28，48等類型［16］。在本樣本中，所有蔥蓮屬植物的染色體基數x=12，其中‘Lily Pies’和‘Fragrance’為二倍體，‘King′s ramson’為四倍體。在最開始的一些研究者認為，蔥蓮屬的染色體基數x=6，并認為染色體基數在整個屬中都保持不變［17］。然而隨著越來越多的蔥蓮屬植物的染色體倍性的報道，本屬還存在其他的染色體基數的報道，比如Z.rosea染色體基數有x=9，12，13，14;Z. candida Herb.染色體基數有x=5，7，12，13，19 ［6，9，15］。而就目前所流行的蔥蓮屬栽培品種中其染色體基數多為x=12。

染色體大小和核型公式是了解一些植物類群的進化和系統發育的重要工具［18-20］。蔥蓮屬植物中，染色體數目變化很大，核型不對稱性沒有顯著差異［7，21］。本研究的3種蔥蓮屬栽培品種的染色體長度范圍在5.68～13.55 μm之間。利用臂比值可以得出植物間的核型進化程度，前人的細胞學數據顯示蔥蓮屬植物常見的染色體核型大多是由中部著絲粒染色體（“m”型）和近中部著絲粒染色體（“sm”型）組成，其中“m”型染色體占大多數［6，15］。在本研究中，同樣的也只含有“m”和“sm”型染色體，與前人的結果類似。因此，本研究結果支持蔥蓮屬植物核型不對稱在核型進化中并不起重要作用的觀點［7，21］。

4 結論

本研究中的3種蔥蓮屬栽培品種含有兩種倍性，二倍體和四倍體，染色體基數均為x=12。它們的5S rDNA位點均位于染色體的長臂末端，不同品種的位點數有一定的差異。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-7-11;修回日期：2023-10-19

基金項目： "江西省教育廳科技項目（GJJ2201514）；江西省大學生創新創業訓練計劃項目（S202311319002）；南昌工程學院博士科研啟動項目（2022kyqd004）資助

作者簡介：

肖孔鐘（1993-）男，漢族，江西贛州人，博士，講師，主要從事園林植物遺傳育種研究，E-mail：2022994828@nit.edu.cn