草地早熟禾BBML基因的克隆及表達模式分析

摘要： 為探究嬰兒潮（BABY BOOM， BBM）基因誘導草地早熟禾（Poa pratensis）體胚發生的潛在功能，本研究采用同源克隆方法獲得PpBBML（PpBBM-like）基因，并對其進行生信分析、亞細胞定位和表達模式分析。結果表明：PpBBML編碼的蛋白具BBM特有的bbm-1基序且定位于細胞核，并與小麥（Triticum aestivum）BBM親緣關系最近。PpBBML的表達水平存在組織特異性，表達量為花藥gt;莖基gt;幼葉gt;根莖gt;老葉gt;不定根。6-BA，NAA（除0 h外），MeJA和EBR（除4 h外）處理后的PpBBML表達量均高于CK；GA3處理后的PpBBML表達量均低于CK。在僅添加生長素的愈傷組織誘導培養基上，其表達量在接種第2 d最高。綜上所述，PpBBML是AP2亞家族的轉錄因子基因，其表達量在幼嫩組織中最高且受到不同激素的誘導，并在愈傷組織形成初期表達量急劇上升，因此，該基因可能具有誘導草地早熟禾胚性愈傷組織發生的潛力。

關鍵詞： 草地早熟禾；BBM基因；基因克隆；生物信息學分析；表達模式分析

中圖分類號：S688.4 """文獻標識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0396-13

Cloning and Expression Pattern Analysis of BBML Gene in

Poa pratensis（Kentucky Bluegrass）

YU Jiang-di， LI Yu-zhu*， MIAO Jia-min， DING Fei-fei， BAI Xiao-ming， NIU Kui-ju

（College of Pratacultural Science， Gansu Agricultural University;Key Laboratory of Grassland Ecosystem， Ministry of Education;

Sino-U.S. Center for Grassland Ecosystem Sustainability， Lanzhou， Gansu Province 730070， China）

Abstract： To explore the potential function of the BABY BOOM （BBM） gene in inducing somatic embryogenesis in Poa pratensis. The PpBBML （PpBBM-like） gene was obtained through homologous cloning and analyzed using bioinformatics，subcellular localization，and expression pattern analysis. The results showed that the protein encoded by PpBBML had the unique bbm-1 motif of BBM and was located in the nucleus，and was closely related to wheat （Triticum aestivum） BBM. The expression level of the PpBBML gene exhibits tissue specificity，with the highest expression in anthers，followed by stem base，young leaves，rhizomes，old leaves，and adventitious roots. The expression levels of PpBBML after treatment with 6-BA，NAA （except 0 h），MeJA，and EBR （except 4 h） were higher than those of the control;however，the expression of PpBBML after GA3 treatment was lower than that of the control. In callus induction medium supplemented only with auxin，the expression of PpBBML peaked on the second day of inoculation. In summary，PpBBML is a transcription factor gene of the AP2 subfamily.Its expression is the highest in young tissues，is induced by different hormones，and increases sharply in the early stage of callus formation. Therefore，this gene may have the potential to induce embryonic callus formation in Poa pratensis.

Key words： Kentucky Bluegrass;BBM gene;Gene cloning;Bioinformatics analysis;Expression pattern analysis

植物體細胞胚胎（體胚）發生是指由體細胞經過離體培養產生胚狀體的過程，該過程可直接從外植體表皮、亞表皮、懸浮細胞、原生質體發生，也可以從脫分化的外植體形成愈傷組織的外部或內部產生［1］。玉米（Zea mays）、小麥和水稻（Oryza sativa）均可通過體胚發生途徑再生完整植株，再生的體胚來自胚性愈傷組織［2-4］。隨著對植物胚性愈傷組織發生分子機制 研究的不斷深入，隸屬于AP2亞家族的轉錄因子基因BBM已被證明是植物胚胎發生的關鍵調節因子，該基因能促進細胞增殖、愈傷組織誘導及體胚形成等［5］。Florez等［6］發現可可（Theobroma cacao）的BBM基因在種胚和胚性愈傷組織中均高表達，且過表達TcBBM可顯著提高可可體胚的誘導率。Maulidiya等［7］發現甘蔗（Saccharum officinarum）的BBM基因可顯著提高其胚性愈傷組織的誘導率及體胚的產生。最近的研究表明BBM基因能促進植物尤其是單子葉植物的遺傳轉化效率。Lowe等［8］利用農桿菌胭脂堿合成酶啟動子（Nos：ZmWUS2）低水平表達WUS2，結合玉米泛素啟動子（ZmUbi：ZmBBM）高水平表達BBM成功獲得了玉米，高粱（Sorghum bicolor），甘蔗和水稻經體胚發生途徑再生的轉基因植株。共表達BBM和WUS也能明顯提高玉米胚性愈傷組織誘導率，進而實現玉米組培執拗型品種的高效遺傳轉化［2，9］。

草地早熟禾是溫帶地區應用最廣泛的冷季型草坪草和重要牧草［10］。迄今為止，草地早熟禾通過愈傷組織分化再生的研究已有很多報道。McDonnell等［11］首次用成熟種子誘導出胚性愈傷組織，但植株再生率僅有6%。之后，研究者們先后利用不同外植體（幼穂、根、芽、胚根和胚軸等）誘導草地早熟禾愈傷組織，其中，幼穗因組織幼嫩、分生能力強、再生頻率高，其胚性愈傷組織率最高，但該外植體的取材受季節限制［12］。愈傷組織的誘導和分化是建立再生體系的關鍵，而高效的再生體系是草地早熟禾遺傳轉化的基礎［13］。Ke等［14］采用農桿菌介導法，以草地早熟禾品種‘Touchdown’的胚芽鞘為外植體，通過愈傷組織再生途徑最早實現了GUS和rolC基因的遺傳轉化，但轉化效率僅有3.7%。Ha等［15］采用基因槍介導法，以草地早熟禾品種‘Kenblue’的愈傷組織為受體細胞，用含有潮霉素磷酸轉移酶基因（hpt）、β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA;gus）和合成綠色熒光蛋白（GFP）基因［sgfp（S65T）］的三個質粒（pAct1IHPT-4，pAHC15和pAct1IsGFP-1）共轉化，轉化率為2.2%。佘建明等［16］利用農桿菌侵染草地早熟禾胚性愈傷的方法轉化Bt基因，共獲得5株陽性轉化植株，轉化率為45%。由此可見，盡管草地早熟禾已建立了穩定遺傳轉化體系，但相對于水稻等模式物種而言，仍存在遺傳轉化效率低，可轉化品種少的問題。

利用BBM等胚胎發生標記基因提高草地早熟禾胚性愈傷組織誘導率和體胚發生率，有望縮短該草種的遺傳轉化時間，提高遺傳轉化效率，實現在更多品種上開展轉基因和基因編輯技術。目前草地早熟禾的BBM基因仍未得到鑒定，本文以分蘗能力強，根系發達的野生栽培品種‘清水’草地早熟禾（Poa pratensis‘Qingshui’）為材料，以ZmBBM1/2的蛋白序列為請求序列，基于本課題組的5個轉錄組數據庫檢索并克隆BBML基因，進而分析其蛋白的理化性質和保守基序，構建系統進化樹；通過構建該基因的過表達載體進行亞細胞定位試驗；利用實時熒光定量PCR檢測PpBBM基因在不同的組織器官和外源激素處理以及不同外植體誘導愈傷組織形成階段表達水平的差異，以期為進一步驗證草地早熟禾BBM基因的胚性愈傷組織誘導功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以‘清水’草地早熟禾為材料，將其成熟種子栽種于育苗穴盤，于人工培養室中進行培養。期間每星期澆灌1次1/2 Hoagland營養液直至長出3～4個葉片，然后進行單株移栽，待移栽苗生長10 d后，一部分材料混合單株采集葉片（幼葉、老葉）、不定根、莖（根莖、莖基）等不同的組織；另一部分材料葉面噴施NAA（Naphtalic Acetic Acid）（0.1 mg·L-1），GA3（Gibberellic Acid）（10 μmol·L-1），6-BA（6-Benzylamino purine）（0.1 mg·L-1），ABA（Abscisic Acid）（10 mg·L-1），ETH（Ethylen）（200 mg·L-1），EBR（24-Epibrassinolide）（0.01 mg·L-1）和MeJA（Methyl Jasmonate）（0.1 mmol·L-1）等激素［17］，每個處理3株以上，CK為噴施蒸餾水。噴激素后取樣時間點分別為0，2，4，6，12和24 h，混合單株采集葉片。

于2022年5月單株種植‘清水’草地早熟禾于甘肅農業大學草坪實訓基地（103°34′E，36°5′N），試驗地地勢由西北向東南傾斜，海拔1 517.30 m，屬中溫帶氣候區，內陸性氣候特征明顯，易干旱。田間管理包括間苗、中耕除草、適時灌溉。于2023年6月10日混合單株采集草地早熟禾的花藥。

將‘清水’草地早熟禾成熟種子消毒后，置于1/2 MS基礎培養基上，待胚根和初生葉分別長到15～20 mm和9～10 mm時，切取根尖（約5 mm長）和葉基（約2～3 mm長）為外植體，在添加外源激素（4 mg·L-1 2，4-D）、3%碳源（根尖用蔗糖；葉基用麥芽糖）和0.7%瓊脂的MS基礎培養基上誘導愈傷組織［18］，每個處理5皿，每皿30個外植體。預試驗表明，以根尖和葉基為外植體時，均在第3 d形成肉眼可見的愈傷組織。因此，取樣時間設為接種后第0，1，2，3和8 d。

所有采集的樣品存于凍存管中，液氮速凍后放于-80℃冰箱保存，用于基因表達量的熒光定量PCR分析。

1.2 PpBBML基因的鑒定

以2個ZmBBMs蛋白序列（NM_001154063.1，NM_001138224.1） 作為鑒定草地早熟禾PpBBML基因的請求序列，將本課題組已有的轉錄組數據作為本地數據庫［19-23］，利用Bioedit軟件中的“blastn”功能，Expectation Value選擇1.0E-10，在本地數據庫中進行檢索。將所得到的序列通過NCBI（National Center for Biotechnology Information）網站中的blastX進行驗證，之后獲得含完整開放閱讀框（ORF）的PpBBML基因。

1.3 PpBBML基因的克隆

采用天根生物科技有限公司的總RNA試劑盒提取草地早熟禾總RNA。利用Nanodrop 2010/2020超微量紫外可見分光光度計檢測RNA的濃度和純度，并通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA由TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒反轉錄生成。根據草地早熟禾轉錄組數據庫中鑒定獲得的PpBBML基因序列，利用Oligo7軟件設計特異性引物（表1）。以反轉錄的cDNA為PCR擴增模板，使用PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase（TaKaRa）高保真DNA聚合酶進行擴增。反應體系為：12.5 μLPrimeSTAR? GXL Premix，1 μLcDNA，1 μLPpBBML-F，1 μLPpBBML-R，9.5 μLddH2O，共25 μL。反應程序為：98℃變性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸1 min，30個循環。擴增結束后，將PCR產物經凝膠電泳檢測后， 切膠回收，進行加A尾反應（Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?，TaKaRa），通過TA克隆（Mighty TA-cloning Kit，TaKaRa），將含有PpBBML基因片段的序列連接到入門載體pCR8/GW/TOPO上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得含有準確目的基因片段的陽性克隆并進行PCR鑒定，挑選陽性克隆送華大基因進行測序并提交NCBI，獲得GenBank登錄號。

1.4 PpBBML蛋白的生物信息學分析

利用表2中的在線軟件工具對草地早熟禾BBML基因編碼的蛋白進行生物信息學分析。

1.5 PpBBML過表達載體構建及亞細胞定位

利用LR重組技術，把克隆到入門載體（pCR8/GW/TOPO）的目的基因片段連接到pEG101載體上，構建pEG101-35S-PpBBML過表達載體。根據PpBBML基因CDS區設計特異性引物pEG101-PpBBML-F和pEG101-PpBBML-R，以草地早熟禾葉片cDNA為模板進行PCR擴增，利用膠回收試劑盒回收DNA并與pEG101-35S-PpBBML載體連接轉化大腸桿菌DH5α，通過質粒小提取試劑盒（TIANGEN，北京）獲得pEG101-35S-PpBBML-GFP重組質粒。將構建好的載體質粒電轉化法轉入農桿菌（GV3101），30℃培養 2 d，用接種環將農桿菌從固體培養皿上刮下，接于相應抗性的1 mL LB液體培養基中，吹打均勻后搖床培養1 h，5 000 r·min-1，離心5 min，去上清，收集菌體，用10 mmol·L-1 MgC12（含120 μmol·L-1 AS）懸浮液重懸菌體，調OD600至0.6左右，室溫靜置3～4 h；挑選生長狀況良好的煙草（Nicotiana tabacum）植株，用去槍頭的1 mL注射器從煙草葉片下表皮注射，并做好標注；將注射完成的煙草植株弱光培養2 d，即可觀察；取標記的農桿菌注射的煙草葉片，制作成玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，并拍照［24］。

1.6 實時熒光定量PCR分析

本研究采用相對定量方法，GAPDH為內參基因，用Oligo7軟件設計引物。選用TaKaRa公司的TB GreenR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒。20 μL反應總體積包括2 μL cDNA，6.4 μLddH2O，0.8 μL上游和0.8 μL下游引物（10 μM）和10 μL TB Green Premix Ex Taqll（Tli RNaseH Plus）（2×）。反應程序為：95℃預變性30 s，PCR反應為95℃變性5 s和60℃退火30 s，40次循環，溶解曲線分析保留默認，為95℃持續1 s，65℃持續15 s，95℃持續1 s。每個樣品設生物學重復3次，技術重復4次，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平［25］。利用SPSS 22.0和Origin 2019軟件進行統計分析和作圖［26］。

2 結果與分析

2.1 植物總RNA電泳及濃度檢測

提取草地早熟禾葉片RNA，結果顯示RNA條帶清晰且完整，符合后續試驗要求（圖1）。用Nanodrop 2010/2020超微量紫外可見分光光度計檢測RNA的濃度和純度符合要求，提取的草地早熟禾RNA基本無酶和蛋白污染，可用于后續試驗。

2.2 PpBBML基因的克隆

根據NCBI數據庫中ZmBBM2（ACG29578.1）序列信息，在草地早熟禾unigene_tiller（PRJNA718697）轉錄組數據庫中檢索獲得PpBBML（OR699039）的序列。經NCBI比對分析，該序列與硬直黑麥草（Lolium rigidum）的BBM序列比對完整，可進行后續試驗。根據該基因序列設計特異性引物，以反轉錄獲得的葉片cDNA為模板，PpBBML-F和PpBBML-R為引物進行PCR擴增，獲得1個長度為1 000 bp左右的基因片段（圖2）。在篩選培養基上共挑選5個單克隆進行測序，結果正確的有4個。1個單克隆的測序 結果中間有重疊區域，將序列拼接到一起后，獲得的 "序列與轉錄組檢索到的序列完全一致，目的片段長1 128 bp，使用NCBI在線軟件進行比對分析，將其命名為PpBBML。

2.3 PpBBML蛋白的生物信息學分析

2.3.1 理化性質分析 ""利用ExPaSy中的ProtParam軟件對PpBBML蛋白進行理化性質分析。結果表明，PpBBML的分子量為41.05 KD，等電點為（pI）為6.12，屬于酸性蛋白；蛋白質分子式為C1763H2803N527O582S11；不穩定指數（Instability index）為46.82，平均親水指數（Grand average of hydropathicity， GRAVY）為-0.680，說明 PpBBML是 不穩定的親水性蛋白［27］，脂肪指數（Aliphatic index）為68.80；該蛋白無跨膜結構和信號肽；磷酸化位點包括26個絲氨酸（S）、12個蘇氨酸（T）和6個酪氨酸（Y）（圖3）。

2.3.2 "二級和三級結構預測 ""通過在線網站預測了PpBBML蛋白質序列的二級結構。結果發現，PpBBML蛋白二級結構以不規則卷曲和α-螺旋為主，分別占42.82%和32.98%，其次是占13.30%的β-折疊和10.90%的β-轉角（圖4）。PpBBML蛋白三維結構均由1個PDB號為7wq5.1.A的結構為模板建立，7wq5.1.A屬于乙烯反應性轉錄因子WRl1（Ethylene-responsive transcription factor）。PpBBML序列的一致性為56.32%，范圍為185～356 aa。PpBBML蛋白三級結構與二級結構預測結果一致，均以不規則卷曲和α-螺旋為主（圖5）。

2.3.3 "系統進化樹構建和基序分析 ""通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）/Phytozomev13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）共獲得22個BBM/BBML蛋白序列，包括15個單子葉植物和9個雙子葉植物，用于系統發育分析［17］。分析的BBM/BBML序列包括來自有性繁殖單子葉植物節節麥（Triticum aestivum）、野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）、旱麥草（Eremopyrum triticeum）、小麥、硬直黑麥草（Lolium rigidum）、多年生黑麥草（Lolium perenne）、梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）、狗尾草（Setaria viridis）、粱（Setaria italica）、水稻、大麥（Hordeum vulgare）和玉米的BBM/BBML序列，來自雙子葉植物有性生殖物種擬南芥、甘藍型油菜（Brassica napus）和大豆（Glycine max）的BBM/BBML序列，利用Mega7.0軟件繪制系統發育進化樹。結果表明，所有的BBMs聚在3個不同的分支（圖6）。草地早熟禾BBML與節節麥、野生二粒小麥、烏拉爾圖小麥及小麥的BBM蛋白位于第1分支，其中PpBBML與TaBBM1親緣關系最近。

采用MEME網站在線預測PpBBML蛋白的保守基序，設置返回motif參數為10，發現motif1-10在眾多物種的BBM/BBML蛋白中都存在。比對發現，motif1和motif3是兩個AP2保守結構域，即AP2-R1，AP2-R2。說明比對的不同物種BBM/BBML成 "員在進化過程中其功能具有高度保守性。motif8對應BBM-like基因特有的bbm-1基序。根據motif分析結果，可歸為3類：第1類具有10個motif（motif1-10），包括PpBBML，TaBBM1，EtBBM，TuBBM1，TdBBM1，AetBBM1，LrBBM1，LpBBM1，DfBBM和HvBBM2；第2類具有9個motif（motif1-4和motif6-10），包括ZmBBM2和ZmBBML；第3類具有5個motif （motif1-4和motif6），包括AtBBM，SvBBM1，SiBBM1，OsBBM1，BnBBM1/2和GmBBM（圖6）。

利用DNAMAN 8軟件對PpBBML蛋白進行多序列比對發現：該蛋白中檢測到2個AP2結構域（AP2-R1和AP2-R2）。此外，還檢測到euANT2，euANT3，euANT4和bbm-1等4個基序，但PpBBML蛋白的euANT2-euANT4基序中存在氨基酸殘基差異，因此將其命名為PpBBML（圖7）。

2.4 PpBBML蛋白亞細胞定位

為探究PpBBML基因編碼的蛋白質在細胞內的具體存在部位，本研究構建了pEG101-35S-PpBBML-GFP表達載體，通過注射煙草葉片觀察熒光信號分布情況確定其位置。圖8的結果表明，空載體在細胞膜及細胞核組分中熒光信號分布均勻且強度較高，無特異性亞細胞定位現象；而PpBBML-GFP的較強熒光信號主要分布于細胞核中，與生信分析結構一致，這表明PpBBML蛋白在細胞內的位置主要存在于細胞核中，該蛋白可能在細胞核中發揮作用。

2.5 PpBBML基因的表達分析

2.5.1 "不同組織部位 ""結果表明，PpBBML在不同組織部位的表達量差異較大，存在組織特異性。該基因在花藥中的表達量最高，是不定根中的8.37倍，顯著高于其它組織（Plt;0.05）；在莖基和幼葉中的表達量顯著高于根莖、老葉和不定根（Plt;0.05），在不定根中表達量最低（圖9）。

2.5.2 不同外源激素處理 ""為了研究外源性激素對PpBBML表達量的影響，對分別噴施NAA，GA3，6-BA，ABA，ETH，MeJA和EBR的草地早熟禾葉片進行熒光定量分析。結果表明，6-BA處理后的PpBBML表達量均高于CK，處理2 h時表達量最高，是對照的2.91倍，并顯著高于其余時間（Plt;0.05）。NAA（除0 h外），MeJA和EBR（除4 h外）處理后的PpBBML表達量均高于CK，其中，NAA處理12 h，PpBBML表達量最高，是對照的6.64倍；MeJA和EBR處理24 h，PpBBML的表達量最高，分別是對照的3.47倍和1.91倍。GA3處理后的PpBBML表達量均低于CK，且差異顯著（Plt;0.05）。ABA和ETH處理后的PpBBML表達量在不同時間點表現出不同的變化，ABA在處理24 h的表達量最高，ETH在處理12 h表達量最高（圖10）。

2.5.3 不同外植體愈傷組織形成階段 ""分別以草地早熟禾的根尖和葉基為外植體，分析愈傷組織形成階段PpBBML基因表達量的動態變化。結果顯示，以根尖為外植體時，PpBBML表達量呈先上升后下降的趨勢，接種第2 d時達最大，與其它時間點差異均顯著（Plt;0.05）；接種第8 d時，表達量最低，顯著低于接種第1 d和第3 d（Plt;0.05）。以葉基為外植體時，PpBBML表達量在接種第2-3 d時顯著高于其它時間點（Plt;0.05），并在接種第2 d達最大值，顯著高于接種第3 d（Plt;0.05）；接種第8 d時，表達量最低，與接種第3 d差異顯著（Plt;0.05）（圖11）。

3 討論

3.1 草地早熟禾BBML蛋白的理化性質分析

解析蛋白的理化性質和空間結構對于認識蛋白的功能、功能的執行、生物大分子間的相互作用等具有重要意義。Yavuz等［28］對高粱BBMs蛋白進行理化性質分析發現，SbBBM-like1的等電點（pI）為4.85，SbBBM-like2的等電點為5.99，兩個蛋白均為酸性蛋白；SbBBM-like1被分類為高分子量蛋白質（171 kDa），而SbBBM-like2為低分子量蛋白質（72 kDa）；兩個蛋白均定位于細胞核。楊紫彤等［29］對毛白楊（Populus tomentosa）BBMs蛋白進行理化性質分析發現，PtoBBM1和PtoBBM2蛋白分子量各為78.71 kDa和78.44 kDa，理論等電點為5.95和6.08，均屬于酸性蛋白；不穩定系數為47.46和48.63，總平均疏水性為-0.816和-0.758，推測均為親水性不穩定蛋白，不具有信號肽；二、三級結構均以不規則卷曲為主；2個BBM蛋白均定位于細胞核。本文檢索并克隆得到1個草地早熟禾BBML基因，對該基因編碼的蛋白進行理化性質分析，發現PpBBML蛋白屬于酸性蛋白；并且是親水性不穩定蛋白，無跨膜結構和信號肽；二、三級結構均以不規則卷曲和α-螺旋為主，與高粱和毛白楊BBMs蛋白具有相似的理化性質和空間結構。蛋白結構決定著其功能，SbBBM和PtoBBM已被報道在胚性愈傷組織形成中發揮作用［28-29］。因此，推測PpBBML可能具有促進草地早熟禾胚性愈傷組織發生的功能。

3.2 草地早熟禾BBML蛋白的保守結構域和基序分析

基因的結構域是調控順式作用元件活性和基因表達的重要因素［30］。BBM基因隸屬于AP2亞家族，該亞家族具有2個AP2結構域。此外，該亞家族還含有3個特定的euANT2-4基序和euANT5，euANT6，bbm-1，bbm-2和bbm-5等5個基序［31］。bbm-1是BBM/BBML的特有基序，存在于所有已鑒定的BBM/BBML基因的蛋白序列中，而euANT5，bbm-2和bbm-5等基序并不一定在BBM/BBML中存在［32］。小麥的BBMs蛋白均有兩個AP2結構域，并具有保守的bbm-1和euANT2-euANT6基序；TaBBM蛋白C端的bbm-2，bbm-3和bbm-4基序與其它植物的BBM同源蛋白相比，保守性較低［33］。高粱的BBM蛋白具有2個AP2保守結構域和保守的bbm-1，euANT2-euANT6基序；SbBBM蛋白的C端含有bbm-2，bbm-3和bbm-5基序，但保守性較低［32］。本研究通過對草地早熟禾BBML蛋白序列的同源比對發現，該蛋白具有兩個AP2結構域，同時具有bbm-1和euANT2，euANT3，euANT4基序，但該蛋白的euANT2-4基序中存在個別氨基酸殘基差異。研究表明，AP2結構域高度保守并能特異性結合順式作用元件如GCC-box（核心元件AGCCGCC）或DRE/CRT（核心元件A/GCCGAC）等，在調控植物發育方面具有重要的功能［34］。bbm-1基序是BBM蛋白的識別基序，該基序與euANT2基序協同工作以調節體胚發生［35］。缺失和結構域交換分析表明，BnBBM1需要bbm-1基序協同euANT2來誘導擬南芥的體胚發生［35］。由此推斷，BBM蛋白中的bbm-1和euANT2基序協同作用是該蛋白發揮功能的關鍵。草地早熟禾BBML蛋白的euANT2基序存在氨基酸殘基變異，這是否會對該蛋白的功能產生影響還有待進一步的研究。

3.3 草地早熟禾BBML蛋白的系統進化分析

系統進化分析可以反映物種之間的進化關系，以及某個基因或蛋白質之間的關系或功能。李曉慧［33］檢索得到3個小麥BBM基因（ TaBBM-3A，TaBBM-3B和TaBBM-3D ），進化樹分析結果顯示3個小麥BBM與二穗短柄草（Brachypodiumn distachyon）的AIL7（AINTEGUMENTA-LIKE7）、水稻的BBM3和PLT1（PLETHORA1）以及玉米、谷子（Setaria italica）、高粱等的BBM蛋白在同一分支上，同源性較高。韓少鵬［32］檢索得到2個高粱的BBM基因（ SbBBM-putative1和SbBBM-putative2 ），對高粱BBM基因編碼的蛋白進行系統進化分析發現，高粱BBM蛋白與擬南芥的BBM、水稻的BBM、玉米的BBM和油菜的BBM蛋白聚在一起。Du等［2］對玉米BBMs基因編碼的蛋白進行系統進化分析發現，玉米BBM與水稻BBM3聚集在一起；玉米BBM2與水稻BBM2聚在一起，具有78%的相似性；玉米BBM2與玉米BBM具有43%的相似性。本研究對草地早熟禾BBML蛋白進行系統進化樹分析發現，PpBBML與擬南芥的BBML和小麥的BBM1聚集在一起，并與小麥BBM1的親緣關系最近。有研究指出， TaBBM1 基因的異位表達可促進體胚的形成［33］，因此，推測PpBBML基因也具有誘導草地早熟禾體胚形成的功能。

3.4 草地早熟禾BBML基因的組織特異性表達模式分析

表達模式分析可揭示不同物種的基因在不同細胞類型、組織器官或發育階段中的表達差異，以此推測基因的功能。Yavuz等［28］研究了高粱的BBM基因在不同組織中的表達模式，發現SbBBM-like1在幼苗的根中表達量最高，其次為胚性愈傷組織，在葉片和地上部組織中表達量較低；與SbBBM-like1相比，SbBBM-like2在胚性愈傷組織中的表達增加了近200倍。李曉慧［33］研究了小麥的幼根、節間、葉、莖尖、小穗、小花、14 d的胚和不同時期的籽粒中BBM基因的表達模式，結果表明TaBBMs在14 d的胚中的表達水平最高，在幼根、葉和不同發育時期的籽粒中也有不同程度的表達，其他部位幾乎不表達。Bilichak等［36］在小麥胚性小孢子培養中發現TaBBM的表達在籽粒和根中富集。Boutilier等［37］利用mRNA原位雜交技術研究了甘藍型油菜小孢子衍生的胚和擬南芥種子發育過程中BBM的表達，發現在發育的早期和晚期，在整個小孢子和合子胚發育時期中都檢測到BBM表達。Du等［2］對培養0，1，2，4，6和8 d的玉米未成熟胚進行表達模式分析，發現ZmBBM和ZmBBM2在培養的第2 d開始顯著且快速的表達，ZmBBM在第6 d時達到峰值，ZmBBM2在第8 d時達到峰值。本研究發現草地早熟禾的PpBBML在花藥中的表達量最高，其次是莖基，在不定根中的表達量最低。Khanday等［38］發現OsBBM1是在花藥中特異表達的轉錄因子基因。在甘藍型油菜未成熟的花粉粒誘導產生的體胚中分離獲得了BBM基因，該基因過表達能促進體胚的發生［37］。因此，過表達草地早熟禾的PpBBML基因很可能也會促進體胚的發生。

3.5 草地早熟禾BBML基因在激素誘導下的表達模式分析

Li等［39］在落葉松（Larix kaempferi × L. olgensis）的BBM中鑒定了許多重要的潛在順式作用元件，例如AUXREPSIAA4元件（參與生長素反應性和根分生組織基因表達的元件）、ARR1AT元件（參與細胞分裂素反應的元件）、GARE1OSREP1元件（參與赤霉素反應的元件）和PYRIMIDINEBOXHVEPB1元件（參與脫落酸反應的元件），說明LkBBM的表達受到高度調控，激素在BBM基因行使功能時發揮重要作用。王麗麗等［17］使用ABA，IAA，NAA和MeJA激素對梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）進行處理，發現梁山慈竹BBM基因對這幾種激素都有不同程度的響應，其中ABA，IAA和MeJA激素處理后DfBBM表達量均呈先上升后下降的趨勢；NAA處理后，DfBBM表達量明顯下降。本文對草地早熟禾葉片進行NAA，GA3，6-BA，ABA，MeJA，ETH和EBR等7種激素處理，發現PpBBML對這些激素有不同程度的響應，其中，6-BA，NAA（除0 h外），MeJA和EBR（除4 h外）處理后的PpBBML表達量均高于CK；GA3處理后的PpBBML表達量均低于CK；ABA和ETH處理后的PpBBML表達量在不同時間點表現出不同的變化。這與在梁山慈竹上的研究結果不完全一致。Hill等［40］研究發現植物再生的組織培養是一個兩步過程，其中外植體最初在富含生長素的培養基上培養以產生愈傷組織；然后在富含細胞分裂素的培養基上培養這些愈傷組織以再生芽。Khanday等［41］研究表明，在水稻盾片細胞中， OsBBM1位于外源生長素的下游，OsBBM1 正調控生長素生物合成基因OsYUCCA（ OsYUC6，OsYUC7和OsYUC9 ）的表達，這導致內源生長素水平增加，接著發生脫分化、愈傷組織形成和之后的體胎發生；OsBBM1誘導胚胎發生過程中，在添加細胞分裂素的培養基上培養愈傷組織也可以產生再生芽。生長素通過平衡與調整內源生長素水平來啟動細胞分裂與胚性潛能的誘導，并且能夠促進體胚的早期發育［42］。綜上所述，生長素和細胞分裂素可能在BBML基因促進草地早熟禾胚性愈傷組織和體胚誘導中發揮重要作用，而茉莉酸甲酯和油菜素甾醇與BBML基因之間的關系有待進一步研究。

3.6 草地早熟禾BBML基因在愈傷組織中的表達模式分析

組織培養和轉基因技術是植物功能基因組研究和分子育種的重要手段。愈傷組織誘導是組織培養的第一步，愈傷組織的誘導能力影響后續的分化和轉化效率［18］。在組織培養中，當受到高水平的生長素刺激時，分離的外植體形成多能性愈傷組織，根和芽可從中再生［43］。通過構建擬南芥（Arabidopsis thaliana）愈傷組織突變體并對其進行遺傳學分析，BBM基因已被證明參與了生長素誘導的愈傷組織形成［44］。BBM在擬南芥和甘藍型油菜的種胚發育過程中優先表達，并且BBM的異位表達觸發了胚性愈傷組織的自發產生［37］。此外，不同外植體在組織培養中形成愈傷組織的能力有差異。擬南芥成熟葉片很容易形成愈傷組織，而水稻的成熟葉片對組織培養極不敏感［45］。Jiang等［46］以擬南芥野生型種子為外植體，研究了AtBBM在愈傷組織形成不同時期的表達模式差異，發現該基因的表達量在愈傷組織誘導過程中急劇增加，推測BBM的上調可能與愈傷組織的形成有關。Zhang等［18］以水稻種子為外植體，研究了 OsBBM1 在愈傷組織形成過程中的表達模式差異，發現該基因的表達量隨著誘導時間的增長呈上升趨勢。本研究以草地早熟禾剛萌發的無菌苗根尖和葉基為外植體，在僅添加生長素的MS固體培養基上檢測PpBBML在愈傷組織形成初期表達量的變化，結果表明，在接種后第2 d，PpBBML在兩個外植體上的表達量均最高，在接種第8 d表達量均最低，表明PpBBML在草地早熟禾愈傷組織形成初期表達量最高，與前人在水稻和擬南芥上的研究結果相似。BBM基因在犬薔薇（Rosa canina）體胚形成的過程中優先表達，激活信號轉導通路調控分化體細胞的誘導和體胚的形成［47］。因此，推測PpBBML基因在生長素誘導草地早熟禾胚性愈傷組織和體胚形成的過程中具有重要作用。

4 結論

本文克隆得到1個含有完整ORF的PpBBML基因，該基因編碼的蛋白具有2個AP2結構域和BBM基因所特有的bbm-1基序；其euANT2-4基序中有個別氨基酸殘基存在差異。系統進化分析表明，PpBBML與TaBBM1親緣關系最近；亞細胞定位于細胞核中。因此，PpBBML是AP2亞家族的轉錄因子基因。PpBBML基因在不同植物組織部位中的表達水平存在差異，在幼嫩組織上具有最高的表達量。對NAA，GA3，6-BA，ABA，ETH，EBR和MeJA等7種激素有不同程度的響應。在僅添加生長素的愈傷組織誘導培養基上，PpBBML表達量在愈傷組織形成初期急劇增加。綜上所述，PpBBML基因可能具有促進草地早熟禾胚性愈傷組織形成進而發生體胚的功能。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-10-30；修回日期：2023-12-07

基金項目： "草業生態系統教育部重點實驗室（甘肅農業大學）2022年開放課題（KLGE202217）；甘肅農業大學科技創新基金（青年導師扶持基金）（GAU-QDFC-2021-02）；草種創新與草地農業生態系統全國重點實驗室開放基金課題（SKLHIGA202301）資助

作者簡介：

余江弟（1999-），女，漢族，甘肅天水人，碩士研究生，主要從事草類植物分子育種方面研究，E-mail：2605257509@qq.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：liyz@gsau.edu.cn