產苦馬豆素的瘋草內生真菌研究進展

摘要： 含苦馬豆素（Swainsonine，SW）的棘豆屬（Oxytropis DC.）和黃芪屬（Astragalus L.）植物稱為瘋草，其共生著一種瘋草內生真菌（Alternaria Section Undifilum oxytropis）。瘋草中的SW由其內生真菌產生，而非由宿主植物產生。SW是一種吲哚里西啶類生物堿，牲畜食用瘋草后引起中毒，嚴重者死亡，對我國畜牧業危害巨大。本文對棘豆屬瘋草的分類與分布，瘋草內生真菌的分類、分布、傳播方式及形態學差異，不同真菌中SW的合成相關酶及合成途徑的研究進展進行綜述，討論了SW合成途徑及其關鍵酶的作用，旨在為瘋草內生真菌的研究、利用及SW合成途徑的明晰提供參考。

關鍵詞： 瘋草內生真菌；苦馬豆素；次級代謝產物；棘豆屬植物；瘋草

中圖分類號：S812.8 """文獻標識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0358-11

Research Progress of Endopfyte Fungi from Locoweed Producing SW

LI Dan1，2， LU Ping1，2*， YUAN Bo1，2， DU Ling1，2， LI Yu-ling1，2，

GAO Feng1，2， JIANG Kai1，2

（1. Inner Mongolia Normal University， College of Life Science and Technology， Hohhot， Inner Mongolia 010020， China;

2. Key Laboratory of Biodiversity conservation and Sustainable utilization in Mongolian Plateau for College and University

of Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot， Inner Mongolia 010020， China）

Abstract： Oxytropis DC. and Astragalus L. plants，also known as locoweed，contain swainsonine （SW），an indolizidine alkaloid. The SW is produced by an endophytic fungi，Alternaria Section Undiflum oxytropis，that coexist with the locoweed，rather than by the host plant itself. Consuming of locoweed can cause poisoning in livestock， leading to death，poseing a significant threat to China′s animal husbandry. This article reviews the research progress on the classification and distribution of the locoweed of Oxytropis genus，the classification and distribution，and transmission of endophytic fungi in locoweed，the related synthesis enzymes，and the synthesis pathways of SW in different fungi. Based on existing experimental results，the synthesis pathways of SW and the roles of its key enzymes are summarized and discussed. The aim is to provide a reference for the research and utilization of locoweed endophytic fungi and to clarify of synthesis pathways of SW.

Key words： Endophytic fungi of locoweed;Swainsonine;Secondary metabolites;Oxytropis spp;Locoweed

瘋草主要指含苦馬豆素（Swainsonine，SW）的棘豆屬（Oxytropis DC.）和黃芪屬（Astragalus L.）有毒植物，在世界范圍內對于草原畜牧業危害巨大［1-3］。SW是一種吲哚里西啶類生物堿［4］，化學名為吲哚里西啶三醇或（1S，2S，8R，8aR）-三羥基八氫吲哚里西啶，最初由Colegate等［5］在澳大利亞分布的灰苦馬豆（Swainsona canescens）植物體分離得到，中國由曹光榮等［6］首次從黃花棘豆（Oxytropis. ochrocephala）中分離出，SW的化學結構與甘露糖相似，可與動物細胞中的溶酶體α-甘露糖苷酶I和高爾基體甘露糖苷酶II的底物競爭性結合，從而抑制酶的活性、阻礙糖蛋白的合成與加工，并導致細胞空泡變性。牲畜持續食用一段時間的瘋草會中毒，產生一系列癥狀，如肌肉震顫、嘔吐、母畜流產、公畜不育及死亡［7］。后來發現SW具有抑制腫瘤生長和轉移作用［8］，是一種有前景的抗腫瘤藥物。SW具有雙雜環分子結構，有四個手性構型，化學合成過程中易形成手性異構體，難以分離，故化學合成的SW商品價格昂貴［8］，從生物體中提取SW值得探索。

瘋草內生真菌與豆科棘豆屬、黃芪屬植物共生［9］，屬于鏈格孢屬（Altenaria），最初被劃在該屬，后根據其ITS序列歸在埃里格孢屬（Embellisia），又有學者提出將其歸在Undifilum，后經分析比對其GAPDH， RPB2 和TEF1 等多個基因序列，將其歸在波浪狀芽管孢組（Undifilum）Altenaria 屬［10-11］。

本文對棘豆屬瘋草的分類與分布、瘋草內生真菌形態學、分類、分布、傳播方式及不同真菌中SW合成途徑的進展進行綜述，對于明晰瘋草內生真菌SW合成分子機制和代謝途徑，以及未來指導瘋草中SW的控制和利用都有重要意義。

1 棘豆屬瘋草的分類與分布

瘋草包括含SW的豆科（Leguminosae）、旋花科（Convolvulaceae）、錦葵科（Malvaceae）等植物，以豆科的棘豆屬、黃芪屬植物為主。國外多分布于美國、澳大利亞、加拿大等地，在美國西部其危害最為嚴重［12］；分布在中國的瘋草多為棘豆屬植物，全世界共有300余種棘豆屬植物［13］，美國主要有5種棘豆屬的瘋草（表1），中國的棘豆屬植物有80余種，多分布于西北、華北、東北、西南等地，已報道的中國棘豆屬瘋草植物為23種［14］，對草原危害最為嚴重的有小花棘豆（Oxytropis. glabra）、黃花棘豆（O. ochrocephala）、甘肅棘豆（Oxytropis. kansuensis）、冰川棘豆（Oxytropis. glacialis）、毛瓣棘豆（Oxytropis. sericopetata），主要分布在內蒙古、寧夏、甘肅、陜西、青海、新疆、西藏、四川等省區的干旱和半干旱地區，具有抗旱耐寒、生命力強和繁殖率高等特點。對比其他雜草或毒草，瘋草的分布與豐度占優勢，認為瘋草與內生真菌共生，從而有助于提高其抗逆性［15］；昆蟲病原真菌羅伯茨綠僵菌（Metarhizium robertsii）也產生SW，為宿主植物提供哌啶酸（Pepocolic acid，PA），可提升宿主植物對環境的適應能力以及抗脅迫能力［16-20］。

2 瘋草內生真菌的分類、分布、傳播方式及形態學差異

2.1 瘋草內生真菌的分類

Braun等［9］最早在絹毛棘豆（O.sericea）、藍伯氏棘豆（O. lambertii）及密柔毛黃芪（Astragalus. mollisimus）等瘋草中分離到產SW的Alternaria 內生真菌，后又有學者在絹毛棘豆（O.sericea）［22-25］和藍伯氏棘豆（O. lambertii）［26-27］中分離到，中國學者也從毛瓣棘豆（O. sericopetata）［28］、冰川棘豆（O. glacialis）［28］、甘肅棘豆（O. kansuensis）［29］、小花棘豆（O. glabra）［30］、黃花棘豆（O. ochrocephala）［31-32］中分離到。瘋草內生真菌目前定義了4個種，分別是Alternaria. oxytropis［33］，Alternaria. cinereum［34］和Alternaria. fulvum［34］，以及作為模式種的Alternaria.bornmuellerii［11］。根據形態學、生理學及遺傳學證據，2014年將A. fulvum改名為Alternaria. fulva［35-36］。在中國境內從甘肅棘豆（O. kansuensis）和小花棘豆（O. glabra）中分離出瘋草內生真菌A. oxytropis，在國外從絹毛棘豆（O.sericea）和藍伯氏棘豆（O. lambertii）中也分離到該內生真菌，目前在中國境內分離到的瘋草內生真菌都屬于A.oxytropis；在美國從密柔毛黃芪（A. mollisimus）中分離出A. cinereum；從斑莢黃芪（Astragalus. lentiginosus）中分離出A. fulvum；在澳大利亞的小冠花（Securigera varia）中分離出A. bornmuellerii。

管慧銳等［21］對24株瘋草內生真菌的ITS序列進行比較分析，5種從中國境內分布的棘豆屬植物（甘肅棘豆、黃花棘豆、鐮形棘豆、毛瓣棘豆及小花棘豆）中分離的瘋草內生真菌聚到一支，相鄰的瘋草內生真菌并不一定源于同種宿主植物，可能與其遺傳距離與地理分布也有密切關系［37］，從相近地理位置分布的棘豆宿主植物分離到的瘋草內生真菌相似程度更高，而地理位置較遠、但從同種棘豆宿主植物分離的瘋草內生真菌的相似程度較前種小，更近的地理距離可能遺傳距離更近。

2.2 瘋草內生真菌的分布

在棘豆屬宿主植物生長過程中，其不同部位（如莖、葉、花等）都能分離出瘋草內生真菌［32］。Braun在美國3種瘋草種群中分離到Alternaria 屬內生真菌，花中的感染率為100%，種子中的感染率為93.1%，葉和莖的感染率為72.9% 和 97.2%［9］。

內生真菌在種子中定殖于種皮內部的薄壁組織［38］，故內生真菌只通過母體傳遞，而不在物種間傳遞。植株中菌絲體在細胞間隙間有發現，并且在分生組織中的菌絲體要比成熟組織中更豐富［39-40］，可能是由于分生組織利用碳源的效率高［41］。同時，地上組織中的內生真菌水平要比地下組織中的高［42］。瘋草內生真菌能直接吸收來自植物中氨基酸形式的營養供應，光合作用強的部分，其葉綠體產生的可被瘋草內生真菌吸收利用的賴氨酸（Lysine，Lys）水平更高，更適于內生真菌的存活［43］。

2.3 瘋草內生真菌的傳播方式

Rodriguez等［44］根據內生真菌的傳播方式將內生真菌分為四類：第一類是棒狀子實體內生真菌（Clavicipitaceous endophytes），傳播方式為垂直傳播，且產生真菌毒素；第二、三和第四類均屬于非棒狀子實體內生真菌（Nonclavicipitaceous endophytes）。第二類寄主范圍較廣，一般定植于根、莖和葉，能夠在植物內形成廣泛的感染，通常情況下通過種皮或根莖進行垂直傳播，少數情況也可水平傳播；第三類內生真菌僅出現在地上組織中，通過菌絲碎裂和/或在死亡或衰老組織上產生有性或無性孢子進行繁殖，孢子和菌絲碎片可以由食草動物或昆蟲的攜帶進行傳播，或通過風、雨的作用進行擴散與繁殖。第四類主要是子囊菌，在實驗室條件下，菌絲碎裂和分生孢子是傳播的主要途徑，不僅能侵染植株地上部分，還能侵染根部［45］。瘋草內生真菌通過種子攜帶內生真菌進行垂直傳播［9，45-46］，屬于第一類。

2.4 瘋草內生真菌A. oxytropis 的形態學特點

目前，瘋草內生真菌定義到的4個種，A. cinereum和A. fulvum 從黃芪屬瘋草中分離出，A. oxytropis 從棘豆屬分離出，A.bornmuellerii 從Securigera varia中分離出。從棘豆屬和黃芪屬分離出的瘋草內生真菌形態略有不同，但從棘豆屬和Securigera varia 中分離的瘋草內生真菌形態相似［11］。

中國境內棘豆屬瘋草分離到的產SW瘋草內生真菌均為A. oxytropis，但不同棘豆屬植物中分離到的瘋草內生真菌菌落形態大體相同。從幾種棘豆屬瘋草中分離到瘋草內生真菌［31，47-48］生長前期都呈圓形、隆起、邊緣整齊的白色菌落，整體分布白色氣生菌絲；生長中期菌體分泌黑褐色的色素物質，菌落背面呈黑色，顏色由白色漸變為淺灰，后灰色逐漸加深變成灰黑色；后期色素由黑色逐漸變為黑綠色。在整個生長過程中，菌落均呈輻射狀生長，表面絨狀較松散，菌體內部堅硬。其中，從甘肅棘豆中分離到的菌落與此有所差別，菌落逐漸由白色變為淡黃色、黃褐色，再變為黑褐色、黑色，其他形態并無顯著差別。而A.bornmuellerii 不僅在菌落形態與A. oxytropis 相似，在以其ITS1、5.8S和ITS2序列構建的鄰接串聯進化樹與A. oxytropis 聚到了一支，且自展值為 98%，形成了一個強支持的單系群，故A.bornmuellerii與A. oxytropis 從基因型到表型都極為相似，可能為同種瘋草內生真菌。

從黃芪屬瘋草中分離到的菌株含有更多的氣生菌絲體，隨著菌落生長，少部分形成硬化的菌絲體，從密柔毛黃芪中分離到的A. cinereum 通常是灰色到深灰色的，而從斑莢黃芪中分離到的A. fulvum 則是棕褐色到棕色。而在基于ITS和gpd基因序列構建的鄰接串聯進化樹中，A. cinereum 和A. fulvum 聚到了一支，自展值為99%。

分生孢子是菌種鑒定的重要依據。該類型瘋草內生真菌的分生孢子大小一般為（14～70）×（5～15） μm，個別物種可達（80～90）×（5～15） μm，顏色為黃綠色至深棕色，形狀為廣橢圓形至長橢圓形，兩端較尖細，表面較平滑，無顯著突起，孢子壁較厚，兩層，外壁較粗糙，有橫隔與縱隔，大多數為3～7個橫隔，0～3個縱隔，呈串珠狀或分岔排列［9-11，49］。

3 真菌中SW合成相關酶及合成途徑

3.1 酵母氨酸還原酶

酵母氨酸還原酶（Sacchropine reductase，Sac）（EC 1.5.1.10）［50］，也稱酵母氨酸脫氫酶（Sacchropine dehydrogenase，SDH），可催化α-氨基己二酸半醛生成酵母氨酸（L-saccharopine），反應過程為：谷氨酸+α-氨基己二酸半醛+NADPH+H+酵母氨酸+NADP++H2O，反應中酵母氨酸還原酶為雙向酶，催化正向反應和逆向反應所需pH不同［50］，正向反應最適pH為7.0，逆向反應為9.75。

在豆類絲核菌（Rhizoctonia leguminicola）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）及A. oxytropis 中都存在Sac酶，在R. leguminicola里Lys合成哌啶-6-羧酸（delta-1-piperideine-6-carboxylate，P6C）時，由Lys →酵母氨酸→ α-氨基己二酸半醛的兩步反應都由Sac酶催化［51］，；在M. anisopliae 中，酵母氨酸氧化酶（saccharopine oxidase，FAP2）可催化Lys合成酵母氨酸，后再由Sac酶催化合成P6C；在A. oxytropis 中這兩步是可逆反應，正向反應與R. leguminicola相同，見圖1。

Mukherjee等敲除A. sect. Undifilum oxytropis 中的sac基因，敲除突變株中SW水平、PA水平及P6C 水平均上升，而Lys水平和酵母氨酸水平下降，a-氨基己二酸水平未發生變化［52］；盧萍等敲除A. oxytropis OW 7.8 的sac基因，敲除突變株Δsac中SW水平、酵母氨酸水平均下降，從培養第14天到第45天，Δsac 的SW水平始終低于OW7.8而Lys水平變化不大［53］；此外在OW7.8和Δsac的培養液中添加四種前體（酵母氨酸、α-氨基己二酸、Lys和PA）后，OW7.8和Δsac的SW水平都上升，且OW7.8的SW水平始終高于Δsac［54］。推測Lys是必需氨基酸，而酵母氨酸是合成Lys過程中的中間產物，在Δsac中其合成受阻，為合成必需的Lys，可能發生由FAP2催化P6C 合成酵母氨酸，進而合成Lys，故Δsac中SW水平降低，Lys水平不變，說明Sac酶促進酵母氨酸和SW的合成［53］。該課題組又對Δsac和OW7.8進行無參轉錄組測序分析，篩選出41個與SW合成相關的差異表達基因，其中有5個注釋到Sac酶，它們在Δsac中表達均下調，也說明Sac酶促進SW的合成［55］。

3.2 吡咯啉-5-羧酸還原酶

吡咯啉-5-羧酸還原酶（Pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR）是脯氨酸（Proline，Pro）生物合成通路上的一個關鍵酶［56］，在植物和微生物中主要催化吡咯啉-5-羧酸（Pyrroline-5-carboxylate，P5C）合成Pro，也將NAD（P）H氧化為NAD（P）+。在A. oxytropis 中P5CR酶催化P6C 合成SW的重要前體物PA［57-58］。

在A. oxytropis OW7.8中克隆 P5CR 基因，向培養基中添加PA的實驗結果顯示，添加組 P5CR 基因表達水平在23～26 d下降，在29～32 d上升并高于對照組，推測可能由于添加組前期有冗余PA，發生負反饋抑制，經一段時間后冗余的PA被消耗，負反饋抑制解除，SW水平下降， P5CR 基因表達水平提高，而對照組中隨SW合成，發生負反饋抑制時， P5CR 基因表達水平降低，進而SW水平也下降。提出 P5CR 基因表達促進A. oxytropis OW7.8 中SW的合成［59］。

植物在干旱、高鹽和低溫等條件下啟動脫落酸（Abscisic acid，ABA）合成，可增強其抵抗逆境的能力，ABA水平與Pro水平正相關［60］，故P5CR酶發揮作用可能與ABA調控也有關，對黃花棘豆中分離的瘋草內生真菌（A. oxytropis）及其宿主黃花棘豆進行全基因組測序，發現真菌基因組中有2個編碼P5CR酶的基因，推測其中一個 P5CR 基因是SWN基因簇中的一員，其功能可能與SwnR酶相似，但在其他產SW真菌中并無此推論［61］。

3.3 SWN基因簇成員的編碼產物

Cook等［62］提出產SW真菌有一個共同的SWN基因簇，該基因簇共包括7個成員：swnA，swnN，swnT， swnH1，swnH2 ，swnK，swnR，在M. robertsii中負責催化由Lys到SW的生物化學反應，在其他產SW真菌中負責催化由PA到SW的生物化學反應，見表2。

產SW的不同類型真菌中的SWN基因簇成員的數量不同，M. robertsii、樹牽牛內生真菌（ICE）、太田結皮菌（Arthroderma otae）和馬毛癬菌（Trichophyton equinum）中含有SWN基因簇全部7個成員，瘋草內生真菌（A. oxytropis）和假裸囊菌屬內生真菌（Pseudogymnoascus sp.）中有5個成員，即swnN， swnH1，swnH2 ，swnK，swnR基因，但無swnA和swnT基因。swnK和 swnH2 基因存在于在各種產SW真菌中［64］。swnK基因編碼一個多功能非核糖肽-聚酮合酶，有7個結構域，催化由PA到1-酮基吲哚里西啶的多步反應，見表3。

孫璐等［65］敲除了M. anisopliae中的swnR基因，敲除突變株中的SW水平顯著下降。Cook等［62］敲除M. robertsii 的swnK 的T結構域基因序列，并含部分KS結構域，敲除突變株ΔswnK 未測到SW，在基因功能互補株又檢測到SW；羅飛飛等［63］敲除M. robertsii的SWN基因簇7個基因，在ΔswnK、Δ swnH1、ΔswnH2 中均未測到SW，其他4個基因敲除突變株ΔswnA，ΔswnN、ΔswnR、ΔswnT 的SW水平比野生型菌株下降，下降的水平依次是ΔswnA＞ΔswnN＞ΔswnR＞ΔswnT。黃恩霞等［66］敲除了M. anisopliae中的swnK基因，敲除突變株中沒有檢測到SW。王維夫［67］敲除A.oxytropis OW 7.8的swnK 基因ACP結構域，其敲除突變株ΔswnK-ACP中未測出SW，與M. robertsii 中敲除swnK基因對SW合成的影響一致［63］。

3.4 真菌中SW合成途徑

對真菌SW合成途徑的研究始于豆類絲核菌（R. Leguminicola）［51］，發現合成了一種吲哚里西啶類生物堿——根霉菌胺（Slaframine），有另一條支路能合成SW，之后又在M. anisopliae、M. robertsii和A. oxytropis中研究合成SW的通路。

若人為將從Lys到SW的合成途徑分為3個過程［21］，可表示如下：①由Lys到PA；②由PA到1-羥基吲哚里西啶；③由 1-羥基吲哚里西啶到SW。

目前在M. anisopliae 中推測由 Lys 到 PA 的合成過程與在 R. Leguminicola 中的稍有不同＼[51， 68＼]（圖1-A、1-B）。在 M. anisopliae 中是由 Lys "酵母氨酸氧化酶 "酵母氨酸 酵母氨酸還原酶 "P6C→PA，或由 α-氨基己二酸→ α-氨基己二酸半醛→P6C→PA；而在 M. robertsii 中由 Lys 到 PA 的過程與上述兩種真菌不同（圖1-C），是由 Lys "Lys環化脫氫酶 "PA或由Lys SwnA酶 "P6C SwnR酶 "PA；而在 A. oxytropis 中，由 Lys 到 PA 的過程較復雜（圖1-D），有兩個分支，一是由 Lys 酵母氨酸 α-氨基己二酸半醛→ P6C PA，二是由 Lys "L-Lys-α-氧化酶 ""6-氨基-2-氧己酸酯→ P2C → PA。

在 R. Leguminicola 中，由 PA 合成1-羥基吲哚里西啶的過程可能是 PA 還原環化 "1-酮基吲哚里西啶 1-酮基吲哚里西啶還原酶 "1-羥基吲哚里西啶；在M. robertsii中由PA合成1-羥基吲哚里西啶的過程與A. oxytropis中的極為相似，但與R. Leguminicola不同（圖2）；而在M. anisopliae中目前無功能實驗證據驗證，但鑒于其與M. robertsii同屬綠僵菌真菌，宿主是2種金龜子物種，且含SWN基因簇，推測各基因編碼的酶在合成SW的過程中發揮相同或相似作用，因此推測其中由PA→SW的過程與M. robertsii和A. oxytropis相似。

M.robertsii及A.oxytropis 中由1-羥基吲哚里西啶合成SW的過程非常相似，均為1-羥基吲哚里西啶 SwnH2酶 1，2-二羥基吲哚里西啶 SwnH1酶 SW，此過程中合成的化合物同分異構結構變化目前仍在研究，推測各化合物的變化情況大致相似（圖3-C、3-D）。在R.Leguminicola中該過程也與上述兩種真菌相似，發生了兩步氧化反應，在M.anisopliae中無相關基因功能實驗證據，但因其存在SwnH1和SwnH2兩種酶，因此推測與M.robertsii及A.oxytropis相似。

因此，在不同產SW真菌中SW的合成途徑不完全相同，目前在上述4種真菌中SW合成途徑研究仍需深入，部分反應過程及所需關鍵酶需進一步確定。

4 展望

牲畜過量食用瘋草后引起SW中毒，嚴重者死亡，對畜牧業造成巨大損失［69］，然而脫SW的黃芪屬、棘豆屬植物本身蛋白質含量高，具有很好的營養價值［70］。苦馬豆素能抑制腫瘤的發生和轉移，可篩選高產SW的瘋草內生真菌進行發酵研究。瘋草內生真菌的SW合成途徑研究還需深入，包括各種關鍵酶、調控因子和調控機制。可繼續深入挖掘瘋草真菌基因組序列，聯合多組學分析，尋找其他SW合成相關的基因及代謝產物，并進行功能分析，從而進一步細化和完善其SW合成途徑。瘋草內生真菌是大型絲狀真菌，其外源DNA的原生質體轉化難度大，同源重組率低，故可進行技術優化研究，或開發基因組編輯等新技術進行基因功能研究。

本課題組目前正在進行小花棘豆內生真菌A. oxytropis OW7.8 中SW合成途徑及其合成相關基因的研究，克隆了所有的SWN基因簇成員和 P5CR 基因，構建和篩選了這6個基因的敲除突變株，后續將檢測敲除突變株和野生株的SW的水平，并結合基因組學、轉錄組學和代謝組學等多組學相關分析，深入研究相關基因功能，進而明晰在A. oxytropis OW7.8 中SW的生物合成途徑。

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（責任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-10-23；修回日期：2023-11-28

基金項目： "國家自然科學基金項目（31460235、31960130）；內蒙古自然科學基金項目（2022MS03014）；內蒙古師范大學基本科研業務費專項資金資助（2022JBTD010）資助

作者簡介：

李丹（1997-），女，漢族，內蒙古呼和浩特人，碩士研究生，主要從事內生真菌中次生代謝途徑研究，E-mail： 17695475658@163.com；*通信作者Author for correspondence， E-mail： luping@imnu.edu.cn