前癃通膠囊介導(dǎo)miR-216a-5p/TPT1/mTORC1通路調(diào)控良性前列腺增生的實驗研究

〔摘要〕 目的 通過細(xì)胞實驗探討前癃通膠囊（qian long tong capsule， QLTC）能否通過調(diào)控miR-216a-5p/腫瘤蛋白翻譯控制1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（miR-216a-5p/tumor protein translationally controlled 1/mammalian target of rapamycin complex 1，miR-216a-5p/TPT1/mTORC1）信號通路抑制良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia， BPH）。方法 將25只大鼠隨機分為對照組（等體積生理鹽水），QLTC低（56.25 mg/mL）、中（112.50 mg/mL）、高（225.00 mg/mL）劑量組，LBSC組（168.75 mg/mL），每組5只。每組灌胃1 mL/次，2次/d，連續(xù)5 d。各組大鼠麻醉后制備含藥血清。根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?，將CP-H022細(xì)胞分5步做實驗處理，每部分實驗進行獨立分組。將miR-216a-5p過表達(dá)和沉默表達(dá)，及TPT1過表達(dá)進行對照研究；RT-qPCR法檢測正常和BPH模型CP-H022細(xì)胞內(nèi)miR-216a-5p表達(dá)量，并觀察不同濃度QLTC處理的BPH細(xì)胞中miR-216a-5p表達(dá)量的差異；細(xì)胞集落形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力；CCK-8法檢測BPH模型細(xì)胞增殖；RT-qPCR法檢測miR-216a-5p、TPT1 mRNA表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；生信分析、雙熒光素酶實驗驗證miR-216a-5p與TPT1的靶向關(guān)系；過表達(dá)TPT1后，Western blot法檢測BPH細(xì)胞中TPT1/mTORC1信號通路相關(guān)分子表達(dá)情況。結(jié)果 與對照組1比較，模型組1的CP-H022細(xì)胞內(nèi)miR-216a-5p表達(dá)量下調(diào)（Plt;0.05）；不同濃度的QLTC均能上調(diào)miR-216a-5p表達(dá)量（Plt;0.05）；根據(jù)本實驗結(jié)果，本研究將選用QLTC（高劑量）組CP-H022細(xì)胞進行后續(xù)實驗。與模型組2比較，QLTC組2細(xì)胞增殖減少、凋亡增加（Plt;0.05），B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）表達(dá)降低（Plt;0.05），Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白單克隆抗體（monoclonal antibody to Bcl-2 associated X protein，Bax）、cleaved Caspase-3表達(dá)升高（Plt;0.05）。敲低miR-216a-5p后，與模型組4比較，QLTC組4細(xì)胞增殖增強、凋亡減少（Plt;0.05），Bcl-2表達(dá)升高（Plt;0.05），Bax、cleaved Caspase-3表達(dá)降低（Plt;0.05）。與mimic-NC組比較，miR-216a-5p mimic組TPT1表達(dá)量降低（Plt;0.05）；QLTC處理后，細(xì)胞TPT1、p-mTORC1表達(dá)均降低（Plt;0.05）；過表達(dá)TPT1后BPH細(xì)胞增殖功能增強（Plt;0.05），凋亡減少（Plt;0.05），Bcl-2表達(dá)升高（Plt;0.05），Bax、cleaved Caspase-3表達(dá)下降（Plt;0.05）。結(jié)論 QLTC可通過介導(dǎo)miR-216a-5p下調(diào)TPT1/mTORC1通路，進而抑制BPH。

〔關(guān)鍵詞〕 前癃通膠囊；良性前列腺增生；細(xì)胞實驗；miR-216a-5p；腫瘤蛋白翻譯控制1；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1；信號通路

〔中圖分類號〕R277.5" " " " "〔文獻標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.03.005

Experimental study of Qianlongtong Capsule on mediating miR-216a-5p/TPT1/mTORC1 pathway to regulate benign prostate hyperplasia

HUANG Hongyu1，2， GUO Zishen1，2， ZHU Wenxiong3， YUAN Yifeng3， HE Juqiao3， LIU Tao3，

TAN Meixin1， YANG Jinyu2， CAO Yutan2， ZHANG Xi1*

1. Hunan Brain Hospital （Hunan Second People's Hospital）， Changsha， Hunan 410021， China; 2. School of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. The First

Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To investigate whether Qianlongtong Capsule （QLTC） can inhibit benign prostatic hyperplasia （BPH） by regulating the signaling pathway of miR-216a-5p/tumor protein translationally controlled 1/mammalian target of rapamycin complex 1 （miR-216a-5p/TPT1/mTORC1） through cell experiments. Methods A total of 25 rats were randomized into control （equal volume of normal saline）， low-（56.25 mg/mL）， medium-（112.50 mg/mL）， and high-dose （225.00 mg/mL） QLTC， and LBSC groups （168.75 mg/mL）， with five rats in each group. The rats in each group were given corresponding drug 1 mL by gavage， twice a day， for continual five days. Drug-containing serum was prepared from rats in each group after anesthesia. According to different experimental purposes， CP-H022 cells were treated experimentally by five steps， and each part of the experiment was grouped independently. The comparative study on overexpression and silencing expression of miR-216a-5p， and TPT1 overexpression was performed; RT-qPCR was used to determine the expression levels of miR-216a-5p in normal and BPH model CP-H022 cells， and observe the differences of miR-216a-5p expression levels in BPH cells treated with different concentrations of QLTC; cell colony formation assay was used to examine cell proliferation; CCK-8 was used to test the proliferation of BPH model cells; RT-qPCR was used to determine the expression levels of miR-216a-5p and TPT1mRNA; cell apoptosis was checked by flow cytometry; bioinformatics analysis and dual luciferase assay were used to verify the targeting relationship between miR-216a-5p and TPT1; after overexpression of TPT1， Western blot was used to examine the expression of TPT1/mTORC1 signaling pathway related molecules in BPH cells. Results Compared with the control group， the expression level of miR-216a-5p in CP-H022 cells in the model group 1 downregulated （Plt;0.05）; different concentrations of QLTC can upregulate the expression of miR-216a-5p; based on the results of this experiment， QLTC （high-dose） group CP-H022 cells will be selected for subsequent experiments in this study. Compared with the model group 2， cell proliferation decreased and apoptosis increased in QLTC group 2 （Plt;0.05）， Bcl-2 expression decreased （Plt;0.05）， and expressions of Bax and cleaved Caspase-3 increased （Plt;0.05）; compared with the model group 4，after knocking down miR-216a-5p， the QLTC group 4 showed higher cell proliferation and lower apoptosis （Plt;0.05）， increased expression of Bcl-2 （Plt;0.05）， and decreased expressions of Bax and cleaved Caspase-3 （Plt;0.05）. Compared with the mimic-NC group， the expression of TPT1 of miR-216a-5p mimic group decreased （Plt;0.05）; after QLTC treatment， the expressions of TPT1 and p-mTORC1 in cells decreased （Plt;0.05）; after overexpression of TPT1， the proliferation function of BPH cells was higher （Plt;0.05）， apoptosis was lower （Plt;0.05）， Bcl-2 expression increased （Plt;0.05）， and expressions of Bax and Cleaved Caspase-3 decreased （Plt;0.05）. Conclusion QLTC can inhibit benign prostatic hyperplasia by mediating miR-216a-5p to downregulate TPT1 / mTORC1 pathway.

〔Keywords〕 Qianlongtong Capsule; benign prostatic hyperplasia; cell experiment; miR-216a-5p; tumor protein translationally controlled 1; mammalian target of rapamycin complex 1; signaling pathway

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性最常見的泌尿系統(tǒng)疾病之一，其特征是前列腺非惡性腫大導(dǎo)致的尿液儲存和膀胱排空障礙[1]。目前，治療手段主要包括手術(shù)療法和藥物療法（如α受體阻斷劑、5α-還原酶抑制劑等），但常伴隨一系列不良反應(yīng)[2]。近年來有研究表明，中藥復(fù)方有助于BPH患者自身免疫功能的提高和機體修復(fù)[3]。因此，中醫(yī)藥已成為治療BPH的重要方法之一。前癃通膠囊（qian long tong capsule，QLTC）由黃芪、丹參、三七、穿山甲、牛痘精液、蒲公英等組成，是賀菊喬教授廣研中醫(yī)文獻并根據(jù)多年臨床經(jīng)驗研制的治療BPH的中藥復(fù)方[4]。前期研究證實，QLTC能明顯改善BPH國際前列腺癥狀評分、尿流率和殘余尿量，縮小增生的前列腺體積，其治療BPH臨床療效顯著[5-6]。由于BPH是由于前列腺過渡區(qū)（prostate transition zone，PTZ）和尿道周圍區(qū)域的上皮和肌纖維組織不受調(diào)節(jié)地增生生長所致[7]，故控制前列腺纖維細(xì)胞過度增殖是治療BPH的關(guān)鍵。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a-5p與前列腺成纖維細(xì)胞的增殖相關(guān)[8]，但miR-216a-5p在BPH中的調(diào)節(jié)作用及病理生理過程中涉及的具體分子通路還有待深入研究。亦有研究指出，在胰腺癌治療中，miR-216a-5p可靶向調(diào)控腫瘤蛋白翻譯控制1（tumor protein translationally controlled 1，TPT1）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號，可有效抑制腫瘤發(fā)生[9]。然而，在BPH治療相關(guān)研究中，TPT1是否受miR-216a-5p調(diào)控以及TPT1是否參與miR-216a-5p介導(dǎo)的協(xié)同作用目前尚未有研究討論。本文從QLTC介導(dǎo)miR-216a-5p調(diào)控前列腺成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的分子機制展開研究，擬進一步確認(rèn)QLTC能否介導(dǎo)miR-216a-5p靶向TPT1/mTORC1信號通路對BPH進行有效治療，以期為臨床應(yīng)用QLTC延緩BPH提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 動物和細(xì)胞

25只SD雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[許可證號SCXK（湘）2019-0004]，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)（溫度25 ℃，濕度50%）。倫理編號：2020（K）034。飼養(yǎng)籠具、墊料、飲水的制備與消毒均符合SPF級實驗動物飼養(yǎng)要求。人前列腺成纖維細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CP-H022）。

1.2" 主要藥物和試劑

QLTC（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，規(guī)格：0.5 g×40粒/瓶，批號：090223）；癃閉舒膠囊（long bi shu capsule，LBSC）（石家莊科迪藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20050356，0.3 g/片，批號：171004）；Trizol試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，批號：15596026）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：CW2141、CW2569）；B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白單克隆抗體（monoclonal antibody to Bcl-2 associated X protein，Bax）、TPT1抗體、辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG、293T細(xì)胞、oe-TPT1（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：AWA43352、AWA47651、AWA43641、AWS0002、HG-NC002、HG-HO003295）；cleaved Caspase-3抗體（美國CST生物公司，批號：#9661）；mTORC1抗體、磷酸化mTORC1抗體（p-mTORC1）（美國Abcam公司，批號：ab134903、ab109268）；HRP標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：SA00001-2）；APC凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：KGA1007）；miR-216a-5p mimcs及inhibitor、野生型人TPT1基因雙熒光素酶報告質(zhì)粒（psiCHECK-2-TPT1）、突變型人TPT1基因雙螢光素酶報告質(zhì)粒（psi?

CHECK-2-TPT1-MUT）（上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司，批號：HY-R00451、HY-R00385、HY-R00451）；雙螢光素酶檢測試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司，批號：E1910）。

1.3" 主要儀器

化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）；電泳儀（中國北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-2C）；酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司，型號：800TS）；熒光定量PCR儀、熒光PCR板（美國賽默飛世爾科技公司，型號：PIKOREAL96、SPL0960）；流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特生物科技有限公司，型號：A00-1-1102）；顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司，型號：DSZ2000X）。

1.4" 含藥血清制備

將25只大鼠隨機分為對照組，QLTC低、中、高劑量組，LBSC組，每組5只。根據(jù)團隊前期研究，QLTC低、中、高劑量組大鼠給予相應(yīng)濃度的QLTC藥液（取QLTC中藥粉溶入蒸餾水中；QLTC低、中、高劑量組濃度分別為56.25、112.50、225.00 mg/mL）；LBSC組大鼠給予LBSC藥液（取LBSC中藥粉溶入蒸餾水中，配制成168.75 mg/mL藥液）；對照組大鼠給予等體積生理鹽水進行灌胃[10]。每組灌胃1 mL/次，2次/d，連續(xù)5 d。末次灌胃后1 h，用戊巴比妥鈉將各組大鼠麻醉，從后腹主動脈及心室采血，無菌分離血清，滅活除菌后分裝入小瓶，保存于-80 ℃冰箱。

1.5" 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

CP-H022細(xì)胞使用含10% FBS和1% P/S的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞均于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了模擬體內(nèi)雄激素誘導(dǎo)的BPH，均用10 nm DHT處理接種的CP-H022細(xì)胞72 h[11]。根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?，?步做實驗處理，每部分實驗進行獨立分組。

第一部分實驗中，將CP-H022細(xì)胞隨機分為6組。對照組1：CP-H022細(xì)胞+10%對照組大鼠血清；模型組1：CP-H022細(xì)胞+10%對照組大鼠血清+10 nm DHT；QLTC（低劑量）組：CP-H022細(xì)胞+10%QLTC低劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC（中劑量）組：CP-H022細(xì)胞+10%QLTC中劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC（高劑量）組：CP-H022細(xì)胞+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；LBSC組：CP-H022細(xì)胞+10%LBSC組大鼠血清含藥血清+10 nm DHT。

第二部分實驗中，將CP-H022細(xì)胞隨機分為4組。模型組2：CP-H022細(xì)胞+10%對照組大鼠血清+10 nm DHT；QLTC組2：CP-H022細(xì)胞+10% QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC+inhibitor-NC組：CP-H022細(xì)胞（轉(zhuǎn)染inhibitor-NC）+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC+miR-216a-5p inhibitor組：CP-H022細(xì)胞（轉(zhuǎn)染miR-216a-5p inhibitor）+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT。

第三部分實驗中，將CP-H022細(xì)胞隨機分為4組。inhibitor-NC組：CP-H022細(xì)胞（轉(zhuǎn)染inhibitor-NC）+10 nm DHT；miR-216a-5p inhibitor組：CP-H022細(xì)胞（轉(zhuǎn)染miR-216a-5p inhibitor）+10 nm DHT；mimic-NC組：CP-H022細(xì)胞（轉(zhuǎn)染mimic-NC）+10 nm DHT；miR-216a-5p mimic組：CP-H022細(xì)胞（轉(zhuǎn)染miR-216a-5p mimic）+10 nm DHT。

第四部分實驗中，將CP-H022細(xì)胞隨機分為4組。模型組4：CP-H022細(xì)胞+10%對照組大鼠血清+10 nm DHT；QLTC組4：CP-H022細(xì)胞+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC+oe-NC組：CP-H022細(xì)胞（轉(zhuǎn)染oe-NC）+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC+oe-TPT1組：CP-H022細(xì)胞（轉(zhuǎn)染oe-TPT1）+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT。

1.6" 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

CP-H022細(xì)胞在體外用MEM培養(yǎng)基（含10% FBS和1% P/S）培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。將轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑Lip2 000加入無血清MEM培養(yǎng)基中配置轉(zhuǎn)染液，混勻。CP-H022細(xì)胞與轉(zhuǎn)染混合液37 ℃下孵育6 h后，更換完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.7" RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中miR-216a-5p、TPT1 mRNA的表達(dá)水平

收集細(xì)胞樣本，使用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，RNA的濃度和純度通過帶紫外波長濾光片的酶標(biāo)儀測定。參照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。使用SYBR Green RTPCR試劑盒擴增DNA片段，重復(fù)3次。以相對定量2-Ct法分析細(xì)胞中miR-216a-5p、TPT1 mRNA的表達(dá)量。所有基因均來源于人類。TPT1內(nèi)參為β-actin，miR-216a-5p內(nèi)參為U6。引物序列詳見表1。

1.8" 細(xì)胞集落形成實驗

CP-H022細(xì)胞按照每孔200個的密度種植在6孔板內(nèi)，每3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)菌落明顯形成時，終止培養(yǎng)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，待菌落被結(jié)晶紫染色，對細(xì)胞菌落進行拍照和計數(shù)。

1.9" CCK-8實驗

胰酶消化后，根據(jù)5×104個細(xì)胞/孔的密度將CP-H022細(xì)胞接種于12孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。按照50 μL/孔的濃度，用完全培養(yǎng)基配制CCK-8溶液，每孔CP-H022細(xì)胞加入500 μL含有CCK-8的培養(yǎng)基。CP-H022細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育2 h后轉(zhuǎn)移到96孔板，并于多功能酶標(biāo)儀450 nm測量吸光度。每組設(shè)置3復(fù)孔，取均值做柱狀圖。

1.10" 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

CP-H022細(xì)胞被胰酶（無EDTA）消化后，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min（離心半徑 9 cm）。洗滌細(xì)胞沉淀后，500 μL的Binding buffer被加入離心管中懸浮細(xì)胞。使用APC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對CP-H022細(xì)胞進行染色，避光孵育10 min。CP-H022細(xì)胞的凋亡情況使用流式細(xì)胞儀觀察并記錄。

1.11" 雙螢光素酶實驗

采用TargetScan數(shù)據(jù)庫（http：//www.Targetscan. org/）預(yù)測miR-216a-5p與TPT1的結(jié)合位點。分別構(gòu)建miR-216-5p inhibitor和miR-216a-5p mimic質(zhì)粒，將CP-H022細(xì)胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)基中。將psiCHECK-2-TPT1、psiCHECK-2-TPT1-MUT進行轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒大提。為檢測miR-216a-5p與TPT1的結(jié)合位點，將CP-H022細(xì)胞隨機分為以下4組。TPT1-WT+hsa-miR-216a-5p NC組：CP-H022細(xì)胞共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-TPT1大提質(zhì)粒+hsa-miR-216a-5p NC（終濃度50 nm）的293T細(xì)胞；TPT1-WT+hsa-miR-216a-5p mimic組：CP-H022細(xì)胞共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-TPT1大提質(zhì)粒+hsa-miR-216a-5p mimics（終濃度50 nm）的293T細(xì)胞；TPT1-MUT+hsa-miR-216a-5p NC組：CP-H022細(xì)胞共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-TPT1-MUT大提質(zhì)粒+hsa-miR-216a-5p NC（終濃度50 nm）的293T細(xì)胞；TPT1-MUT+hsa-miR-216a-5p mimic組：CP-H022細(xì)胞共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-TPT1-MUT大提質(zhì)粒+hsa-miR-216a-5p mimics（終濃度50 nm）的293T細(xì)胞。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞沉淀，采用雙螢光素酶活性檢測試劑盒根據(jù)說明書檢測細(xì)胞螢光素酶活性并計算海腎螢光素酶與螢火蟲螢光素酶的比值。

1.12" Western blot檢測TPT1和mTORC1蛋白表達(dá)情況

RIPA緩沖液提取細(xì)胞蛋白裂解物。BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳于室溫封閉1.5 h，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。洗膜3次后加Bcl-2（1∶3 000）、Bax（1∶3 000）、cleaved Caspase-3（1∶3 000）、TPT1（1∶3 000）、p-mTORC1（1∶3 000）、mTORC1（1∶3 000）和β-actin（1∶1 000）抗體稀釋液于4 ℃孵育過夜；洗膜3次后加二抗HRP山羊抗兔IgG（1∶6 000），室溫孵育1.5 h后添加ECL顯影液顯影。結(jié)果運用Quantity One軟件進行分析。

1.13" 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以“x±s”表示。兩組之間比較采用非配對t檢驗；3組及以上數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA，Tukey's進行事后檢驗。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" BPH細(xì)胞中miR-216a-5p相對表達(dá)情況

與對照組1比較，模型組1，QLTC（低、中、高劑量）組，LBSC組miR-216a-5p的相對表達(dá)量均下調(diào)（Plt;0.05）；與模型組1比較，QLTC（低、中、高劑量）組和LBSC組miR-216a-5p的相對表達(dá)量均上調(diào)（Plt;0.05）；與QLTC（低劑量）組比較，QLTC（中、高劑量）組和LBSC組中miR-216a-5p相對表達(dá)量均上調(diào)（Plt;0.05）；與QLTC（中劑量）組比較，QLTC（高劑量）組和LBSC組中miR-216a-5p的相對表達(dá)量均上調(diào)（Plt;0.05）；與QLTC（高劑量）組比較，LBSC組miR-216a-5p的相對表達(dá)量下調(diào)（Plt;0.05）。根據(jù)本實驗結(jié)果，本研究將選用QLTC（高劑量）組CP-H022細(xì)胞進行后續(xù)實驗。詳見圖1。

2.2" QLTC 干預(yù)后BPH細(xì)胞中miR-216a-5p表達(dá)情況及細(xì)胞增殖情況

與模型組2比較，QLTC組2、QLTC+inhibitor-NC組的miR-216a-5p相對表達(dá)量上調(diào)，集落形成數(shù)減少，在24 h、48 h、72 h時細(xì)胞增殖能力均減弱，CP-H022細(xì)胞凋亡率增加，Bcl-2蛋白相對表達(dá)降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)升高（Plt;0.05）；與QLTC組2、QLTC+inhibitor-NC組比較，QLTC+miR-216a-5p inhibitor組miR-216a-5p相對表達(dá)量下降，集落形成數(shù)增多，在24 h、48 h、72 h時細(xì)胞增殖能力均增強，CP-H022細(xì)胞凋亡率減少，Bcl-2蛋白相對表達(dá)升高，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)降低（Plt;0.05）。詳見圖2。

2.3" BPH細(xì)胞中TPT1與miR-216a-5p的靶向關(guān)系情況

生信分析檢測，發(fā)現(xiàn)miR-216a-5p與TPT1存在堿基互作，詳見圖3A。與TPT1-WT+hsa-miR-216a-5p NC組比較，TPT1-WT+hsa-miR-216a-5p組海腎螢光素酶/螢火蟲螢光素酶比值降低（Plt;0.05），詳見圖3B。與inhibitor-NC組比較，miR-216a-5p inhibitor組TPT1的mRNA表達(dá)和蛋白相對表達(dá)水平增加（Plt;0.05），miR-216a-5p mimic組TPT1的mRNA表達(dá)和蛋白相對表達(dá)水平降低（Plt;0.05）；與miR-216a-5p inhibitor組比較，miR-216a-5p mimic組、mimic-NC組TPT1的mRNA表達(dá)和蛋白相對表達(dá)水平降低（Plt;0.05）；與mimic-NC組比較，miR-216a-5p mimic組TPT1的mRNA表達(dá)和蛋白相對表達(dá)水平降低（Plt;0.05）。詳見圖3C、D。

2.4" QLTC介導(dǎo)miR-216a-5p/TPT1/mTORC1信號通路對BPH細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與模型組4比較，QLTC組4和QLTC+oe-NC組的TPT1、p-mTORC1/mTORC1蛋白相對表達(dá)降低，集落形成數(shù)減少，在48 h、72 h時細(xì)胞增殖減弱，BPH細(xì)胞凋亡率增加，Bcl-2蛋白相對表達(dá)降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)升高（Plt;0.05）；與QLTC組4、QLTC+oe-NC組比較，QLTC+oe-TPT1組TPT1、p-mTORC1/mTORC1蛋白相對表達(dá)均升高，集落形成數(shù)增多，在48 h、72 h時細(xì)胞增殖能力增強，BPH細(xì)胞凋亡率減少，Bcl-2蛋白相對表達(dá)升高，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)下降（Plt;0.05）。詳見圖4。

3 討論

BPH是中老年男性泌尿系統(tǒng)中最常見的疾病之一，在50～65歲的男性中發(fā)病率高達(dá)15%～25%[12-13]。BPH典型表現(xiàn)是小腹脹痛、排尿困難和夜尿頻多，使得中老年男性生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。前列腺切除治療和藥物治療等聯(lián)合療法在BPH的臨床應(yīng)用中日趨成熟，但其不良反應(yīng)仍未得到有效改善，且機體容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[14-15]。BPH病理表現(xiàn)為前列腺體積增大，屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”范疇，且中醫(yī)藥治療BPH有獨特優(yōu)勢[16-17]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，BPH病因病機是腎氣衰憊、氣化失司、氣血運行不暢、瘀滯日久，其基本病機是氣虛血瘀。有研究表明，QLTC對BPH有良好的治療效果，QLTC方中重用黃芪為君藥，味甘性溫，歸肺、脾經(jīng)，益氣利水，培補后天；丹參、三七、水蛭、穿山甲活血化瘀、軟堅散結(jié)為之臣；王不留行具有利尿、活血化瘀之效，為佐使藥，以輔助君臣藥益氣利水、活血散瘀之效。諸藥合用，共奏益氣利水、活血散結(jié)之功[4]。

有研究前期通過體外細(xì)胞實驗證實，QLTC含藥血漿可抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖，促進前列腺間質(zhì)細(xì)胞凋亡[18]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，QLTC含藥血漿可通過抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞Fibronectin與CollagenⅣ基因表達(dá)[19]，從而抑制基質(zhì)細(xì)胞增生。動物實驗研究表明，QLTC能顯著改善BPH大鼠前列腺上皮組織增生，降低間質(zhì)面積，縮小前列腺體積，降低前列腺濕重、體積及指數(shù)[20]。有研究表明，QLTC在BPH的治療中能產(chǎn)生良好作用[21-22]，但具體機制不明，而本研究表明，QLTC能夠上調(diào)miR-216a-5p，導(dǎo)致TPT1/mTORC信號通路的下調(diào)，從而延緩BPH發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a-5p與前列腺癌細(xì)胞的分裂失控有關(guān)[8]。作為miRNA家族成員之一，miR-216a-5p在細(xì)胞的生長周期調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。miR-216a-5p在體外和體內(nèi)均能有效抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[24]。本研究結(jié)果顯示，BPH細(xì)胞中miR-216a-5p表達(dá)量降低，并且QLTC對miR-216a-5p的表達(dá)上調(diào)作用隨劑量增多而增強。本研究的實驗均圍繞QLTC和miR-216a-5p對BPH細(xì)胞增殖功能的具體作用展開，本研究結(jié)果證實，QLTC介導(dǎo)miR-216a-5p上調(diào)可抑制BPH細(xì)胞增生，并促進BPH細(xì)胞凋亡。TPT1基因是抑癌基因P53和癌癥干細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[25]。mTORC1在維持TPT1的高蛋白水平方面起關(guān)鍵作用[26]。抑制TPT1可通過mTORC1依賴性途徑（進一步使mTOR上的Ser371殘基去磷酸化）和mTORC1非依賴性途徑（抑制Bcl-2）增強雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬[27]。已有研究表明，miRNAs轉(zhuǎn)錄后能夠下調(diào)目的基因的表達(dá)，從而在腫瘤的惡性過程中發(fā)揮作用[28]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，TPT1可以與miR-770-5p競爭性結(jié)合，從而影響腫瘤進程[29]。同時有研究證實，miR-216a-5p通過靶向TPT1/mTORC1抑制胰腺癌的腫瘤發(fā)生[9]。TPT1在惡性前列腺增生中過表達(dá)[30-31]。前文實驗已經(jīng)證實，miR-216a-5p在BPH中呈現(xiàn)低表達(dá)現(xiàn)象，故推測在BPH中miR-216a-5p和TPT1/mTORC1之間存在類似胰腺癌中的調(diào)控通路。生物信息學(xué)分析和螢光素酶報告系統(tǒng)提示，TPT1是miR-216a-5p的重要結(jié)合靶點。

本研究結(jié)果進一步證實，miR-216a-5p在BPH中下調(diào)TPT1的表達(dá)。TPT1/mTORC1通路在癌癥中的高度活躍與癌癥預(yù)后不良相關(guān)[32]。過表達(dá)TPT1后，BPH細(xì)胞集落形成增多，增殖能力增強，凋亡減少的同時mTORC1磷酸化增加。這一系列結(jié)果表明，TPT1/mTORC1促進BPH發(fā)展。結(jié)合前文實驗結(jié)果，QLTC通過介導(dǎo)miR-216a-5p上調(diào)抑制TPT1/mTORC1信號通路，從而抑制BPH的發(fā)展。但本研究僅在體外進行實驗，對QLTC介導(dǎo)miR-216a-5p的針對性治療以及對BPH的臨床效果尚未可知，有待進一步深入研究。

綜上所述，QLTC抑制BPH病程可能與QLTC介導(dǎo)miR-216a-5p下調(diào)TPT1/mTORC1信號通路相關(guān)。本研究結(jié)果在一定程度上揭示了，QLTC對BPH抑制作用的分子機制，表明QLTC可能是一種極具潛力的治療BPH的中成藥，而miR-216a-5p/TPT1/mTORC1也有望成為BPH分子靶向療法的新靶標(biāo)。

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