柴胡桂枝湯揮發油的GC-MS分析及對人肺腺癌A549細胞體外增殖的抑制作用研究

文冉 李壯壯 杜以晴 楊勇 容蓉 呂青濤

摘 要 目的：研究復方柴胡桂枝湯揮發油的組成成分，并評價其對人肺腺癌A549細胞體外增殖的抑制作用。方法：根據2015年版《中國藥典》（四部）通則2204揮發油測定法中甲法提取柴胡桂枝湯中的揮發油。采用氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）結合Kováts指數分析其揮發油成分，并采用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。以不同質量濃度順鉑（4、8、16、32、64 mg/L）為陽性對照，采用MTT法檢測不同質量濃度柴胡桂枝湯揮發油（25、50、100、200、400 mg/L）作用48 h后對A549細胞體外增殖的抑制作用;另設陰性對照組（加細胞但不加藥物）。結果：從揮發油中共分離出71個成分，鑒定出其中59個成分，其峰面積之和占總峰面積的84.99%。其中，相對含量較高的成分為芳姜黃烯（17.65%）、β-甜沒藥烯（9.57%）、β-羅勒烯（7.05%）、α-姜黃烯（5.35%）、 ?2，5-二甲基苯甲醛（4.24%）、異丁酸芳樟酯（2.70%）、α-雪松烯（2.48%）、δ-杜松烯（2.07%）。與陰性對照組比較，4～64 mg/L順鉑組和25～400 mg/L柴胡桂枝湯揮發油組細胞的增殖率均顯著降低（P<0.05）;順鉑和柴胡桂枝湯揮發油對A549細胞體外增殖的半數抑制濃度分別為10.150、73.526 mg/L。結論：柴胡桂枝湯揮發油中主要以芳姜黃烯、β-甜沒藥烯、β-羅勒烯、α-姜黃烯等成分為主，其對A549細胞的體外增殖具有一定的抑制作用。

關鍵詞 柴胡桂枝湯;揮發油;氣相色譜-質譜聯用法;Kováts指數;人肺腺癌A549細胞

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the composition of the volatile oil from Compound chaihu guizhi decoction， and to evaluate its in vitro anti-proliferative activity on human lung adenocarcinoma A549 cells. METHODS： The volatile oil from Chaihu guizhi decoction was extracted according to the steam distillation method of general rules 2004 in the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅳ）. The volatile oil components were analyzed by GC-MS combined with Kováts index， and the relative content of each component was calculated by peak area normalization method. Using different concentrations of cisplatin （4， 8， 16， 32， 64 mg/L） as positive control， MTT assay was used to detect the inhibitory effects of different concentrations of volatile oil from Chaihu guizhi decoction （25， 50， 100， 200， 400 mg/L） on in vitro proliferation of A549 cell after 48 h of treatment. Negative control group （with cells but without drugs） was set up. RESULTS： A total of 71 chemical components were isolated from the volatile oil， among which there were 59 compounds identified， sum of peak areas accounting for 84.99% of the total peak area. The compounds with relatively high content included ar-curcumene （17.65%）， β-bisabolene （9.57%）， β-ocimene （7.05%）， α-curcumene （5.35%）， 2，5-dimethylbenzaldehyde （4.24%）， linalyl isobutyrate （2.70%）， α-cedrene （2.48%）， δ-cadinene （2.07%）. Compared with negative control group， the proliferation rate of cells were decreased significantly in 4-64 mg/L cisplatin groups and 25-400 mg/L volatile oil from Chaihu guizhi decoction groups （P<0.05）. IC50 of cisplatin and volatile oil from Chaihu guizhi decoction to in vitro proliferation of A549 cells were 10.150 and 73.526 mg/L. CONCLUSIONS： The volatile oil from Chaihu guizhi decoction mainly includes ar-curcumene， β-bisabolene， β-ocimene， α-curcumene， which shows certain inhibitory effect on ?in vitro proliferation of A549 cells.

KEYWORDS ? Chaihu guizhi decoction; Volatile oil; GC-MS; Kováts index; Human lung adenocarcinoma A549 cells

柴胡桂枝湯出自《傷寒論》，為東漢末年中醫名家張仲景創立的經典方劑，由小柴胡湯和桂枝湯加減而來，全方由柴胡、桂枝、黃芩、人參、甘草、半夏、生姜、芍藥、大棗共9味中藥組成[1]。隨著人們對經方的深入研究，發現柴胡桂枝湯在現代臨床可用于治療呼吸系統類、神經系統類、消化系統類和運動系統類等疾病，如其在感冒[2]、失眠[3]、抑郁癥[4]、功能性消化不良[5]、頸椎病[6]等的治療中具有獨特優勢。另有報道發現，柴胡桂枝湯中桂枝的揮發性成分桂皮醛聯合熱療，可通過調控活性氧和絲裂原活化蛋白激酶家族來誘導非小細胞肺癌A549細胞的凋亡[7];生姜中的8-姜辣素可通過表皮生長因子/信號轉導與轉錄活化因子/細胞外調節蛋白激酶通路來調節結直腸癌細胞的增殖和遷移[8]，而生姜中的6-姜辣素可通過誘導細胞周期阻滯、活性氧的產生和線粒體膜電位的破壞從而促進人胃癌（AGS）細胞的凋亡[9]。由此可見，柴胡桂枝湯揮發油的單一成分具有一定的抗癌藥效。那么，柴胡桂枝湯揮發油是否具有體外抗癌作用值得探究，加之目前針對柴胡桂枝湯揮發油組成的基礎研究較少，故本研究采用氣相色譜-質譜法（GC-MS）對柴胡桂枝湯揮發油的成分進行分析，結合Kováts指數（KI值）對揮發油組分進行準確定性，為柴胡桂枝湯揮發油組成成分的研究提供基礎數據，同時評價該揮發油對人肺腺癌A549細胞體外增殖的抑制作用，旨在為柴胡桂枝湯的進一步開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7000B型三重四極桿GC-MS聯用儀（美國Agilent公司）;AE240型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）;熱電Thermo MK3酶標儀（上海賽默飛生物有限公司）;HF90型CO2恒溫培養箱（上海力申科學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

柴胡（批號：17090609）、桂枝（批號：17092603）、黃芩（批號：17041516）、甘草（批號：17082005）、生姜（批號：17030803）、人參（批號：17031503）、大棗（批號：17052411）、半夏（批號：17071501）、白芍（批號：17072801）等飲片均購自山東省中醫院，由山東中醫藥大學藥學院李峰教授鑒定均符合2015年版《中國藥典》（一部）標準;注射用順鉑（山東齊魯制藥有限公司，批號：H37021358，規格：20 mg）;正構烷烴混合標準品C8～C36（美國Sigma-Aidrich公司，批號：11521014，純度：≥98%）;MTT試劑（江蘇凱基生物技術有限公司，批號：14069927）;胎牛血清（FBS，美國HyClone公司，批號：LT22906）;DMEM高糖培養基（美國Gibco公司，批號：8118192）;二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號：6768521）;其余試劑均為分析純，水為自制雙蒸水。

1.3 細胞

人肺腺癌細胞株A549購自山東省中醫院。

2 方法

2.1 柴胡桂枝湯揮發油的提取

取柴胡桂枝湯處方10倍量的藥材，粉碎后過三號篩，加入8倍質量水，按2015年版《中國藥典》（四部）通則2204揮發油測定法中甲法[10]提取該復方中的揮發油。加熱回流提取8 h后，冷卻，收集揮發油，經無水硫酸鈉干燥后，稱質量并計算其得率（揮發油質量/藥材總質量×100%）為1.12%。

2.2 溶液的制備

2.2.1 揮發油樣品溶液 取揮發油樣品適量，用三氯甲烷稀釋成質量濃度為65 g/L的溶液（以揮發油質量計），作為樣品溶液，待GC-MS進樣分析。

2.2.2 正構烷烴C8～C36標準品溶液 取正構烷烴標準品C8～C36適量，加三氯甲烷稀釋成5 mg/L的標準品溶液，待GC-MS進樣分析。

2.2.3 體外增殖試驗揮發油母液 取揮發油樣品適量，用DMSO稀釋，制備成質量濃度為35 g/L（以揮發油質量計）的溶液，作為體外抗增殖試驗的母液。

2.3 柴胡桂枝湯揮發油的GC-MS分析

2.3.1 GC條件 石英毛細管色譜柱：Agilent HP-5 MS（250 μm×0.25 μm，30 m）;載氣：氦氣（純度為99.999%）：載氣流速：1.0 mL/min;載氣壓力：7.652 2 psi;隔膜吹掃速率：1 mL/min;進樣口溫度：250 ℃;升溫程序：初始溫度100 ℃并保持10 min，以2 ℃/min速率升至150 ℃并保持15 min，再以2 ℃/min速率升至280 ℃并保持18 min;進樣量：1.0 μL;分流比：20 ∶ 1;溶劑延遲時間：3 min。

2.3.2 MS條件 離子源：電子轟擊源（EI）;離子源溫度：230 ℃;電離能量：70 eV;傳輸線溫度：280 ℃;掃描范圍：質荷比（m/z）35～1 000。

2.3.3 樣品分析 在全掃描（SCAN）檢測模式下，分別取“2.2.1”項下揮發油樣品溶液和“2.2.2”項下正構烷烴C8～C36標準品溶液，按“2.3.1”“2.3.2”項下條件進樣分析，記錄總離子流圖。根據 Vanden Dool 和 Kratz 線性程序升溫的KI原理，利用公式求得各成分的KI值[KI=100n+100（tx-tn）/（tn+1-tn），式中n為碳原子數，tx為被分析組分x的保留時間，tn、tn+1分別為碳原子數為n和n+1的正構烷烴標準品的保留時間]，并與NIST 11質譜庫中檢索得到的KI值進行比對，從而對揮發油成分進行定性分析，最后通過峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

2.4 柴胡桂枝湯揮發油對A549細胞體外增殖的抑制作用考察

將處于對數生長期的A549細胞制備成5×104個/mL的單細胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔培養板中（取2塊培養板，分別用來考察順鉑和柴胡桂枝湯揮發油的體外增殖抑制作用），將細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h待細胞貼壁后，棄上清，然后將細胞分為順鉑組、柴胡桂枝湯揮發油組（分別用1塊板），試驗均設陰性對照組。順鉑組分別添加含10%FBS和不同質量濃度順鉑（4、8、16、32、64 mg/L，劑量參考文獻[11]設置）的DMEM培養基，柴胡桂枝湯揮發油組分別添加含10%FBS和不同質量濃度揮發油（25、50、100、200、400 mg/L，以揮發油質量計，劑量由前期試驗摸索得出）的DMEM培養基，陰性對照組僅加入含10%FBS和0.1%DMSO的DMEM培養基（記為0 mg/L組），并另設不含細胞但加入含10%FBS和0.1%DMSO的DMEM培養基的空白對照組，每組均設置5個復孔。加藥后，將各組細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養48 h，再在每孔避光加入MTT溶液（5 mg/mL）10 μL，繼續培養4 h，棄上清;每孔加入DMSO溶液150 μL，于搖床上振搖15 min，采用酶標儀測定490 nm波長處各孔的吸光度（A），計算各組細胞的增殖抑制率[增殖抑制率=（A陰性對照- ?A揮發油）/（A陰性對照-A空白對照）×100%]，并采用GraphPad Prism 7.00軟件計算藥物的半數抑制濃度（IC50）。試驗重復3次。

2.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。試驗數據用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 柴胡桂枝湯揮發油成分的GC-MS分析結果

在柴胡桂枝湯揮發油中共分離出71個成分，通過質譜庫檢索和人工圖譜解析，并結合KI值比對，初步鑒定了其中59個揮發性成分，占揮發油總峰面積的84.99%，包括烯烴類成分（序號1～18的化合物）的相對含量總和為51.47%、醛類成分（序號19～33的化合物）的相對含量總和為13.62%、醇類成分（序號34～43的化合物）的相對含量總和為5.29%、酯類成分（序號44～49的化合物）的相對含量總和為6.68%、酸類成分（序號50～53的化合物）的相對含量總和為2.14%、酚類成分（序號54～55的化合物）的相對含量總和為0.77%、其他類成分（序號56～59的化合物）的相對含量總和為5.03%。其中，含量較高的化合物為芳姜黃烯（17.65%）、β-甜沒藥烯（9.57%）、β-羅勒烯（7.05%）、α-姜黃烯（5.35%）、2，5-二甲基苯甲醛（4.24%）、異丁酸芳樟酯（2.70%）、α-雪松烯（2.48%）、δ-杜松烯（2.07%）。正構烷烴混合標準品總離子流圖見圖1，柴胡桂枝湯揮發油總離子流圖見圖2，柴胡桂枝湯揮發油成分鑒定和相對含量測定結果見表1。

3.2 柴胡桂枝湯揮發油對A549細胞體外增殖的抑制作用

與陰性對照組比較，順鉑不同質量濃度組和柴胡桂枝湯揮發油不同質量濃度組細胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.05），且均呈一定的濃度依賴趨勢。經計算，順鉑和柴胡桂枝湯揮發油對A549細胞體外增殖的IC50分別為10.150、73.526 mg/L。各組細胞的體外增殖抑制率測定結果見表2。

4 討論

柴胡桂枝湯由9味中藥組成，化學構成復雜，其揮發油中同系物及同分異構體眾多，單憑質譜檢索數據庫無法達到較高匹配度。KI值是一種重現性較好的定性參數，僅與固定相的性質、柱溫有關[12]。黃慶暉等[13]采用超臨界流體萃取法提取柴胡桂枝湯中的揮發油，依靠質譜數據庫檢索比對鑒定出揮發油中28種成分，占揮發油總成分的85%。本研究采用2015年版《中國藥典》（四部）通則2204揮發油測定法中甲法提取柴胡桂枝湯中的揮發油，采用GC-MS法測定并結合KI值對揮發油組分進行定性分析，共鑒定出了其中59個成分，其峰面積之和占總峰面積的84.99%。相比之下，本研究更能夠對揮發油中更多組分進行表征。雖然超臨界流體萃取法與傳統提取方法相比，不殘留有機溶劑、萃取速度快，但其局限性為設備造價高、對脂溶性成分溶解能力強、對水溶性成分溶解能力差。相比而言，按揮發油測定法中甲法提取揮發油的成本低廉，并且更貼近柴胡桂枝湯水煎服的用藥方式。

近年來，多采用放化療、靶向藥物等手段治療肺癌。順鉑是一種細胞周期非特異性的抗腫瘤藥物，同時也是目前應用最廣泛的實體瘤治療藥物之一[14]，故本研究以順鉑為陽性對照藥物來考察柴胡桂枝湯揮發油對A549細胞體外增殖的影響。本研究結果顯示，柴胡桂枝湯揮發油對A549細胞的體外增殖具有一定的抑制作用，該作用雖不及順鉑（IC50明顯高于順鉑），但考慮到順鉑在腫瘤的治療過程中易產生耐受現象，且對肝臟毒副作用大[15]，因此尋求有效、低毒的天然抗腫瘤藥物仍有重要意義。

從《傷寒論》首載柴胡桂枝湯，到現代臨床的古方新用，該方的適用范圍逐漸擴大，其在神志病治療方面也得到了運用[16]。目前有臨床報道稱，柴胡桂枝湯揮發油可能通過降低興奮性氨基酸/抑制性氨基酸的比值、增強自由基清除能力、阻止過氧化物生成以及減少一氧化氮（NO）神經毒性來發揮抗癲癇作用[17-18]。柴胡桂枝湯揮發油組分較多，其中姜辣素類成分在柴胡桂枝湯揮發油定性分析結果中有體現且占比較大。有研究指出，柴胡桂枝湯揮發油中的姜辣素、單萜類、丁香酚等主要成分在抗氧化與抗癲癇過程中可能發揮了一定的作用[19]。并且，姜辣素能夠調節與癌癥有關的多種細胞信號通路，包括核因子κB（NF-κB）、信號轉導子和轉錄激活因子3（STAT3）、激活蛋白1（AP-1）、β-連環蛋白、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和促炎介質腫瘤壞死因子α（TNF-α）、環氧合酶2（COX-2）等，發揮其體內外抗癌作用[20]。據報道，在烏拉坦誘導的小鼠肺癌模型中，6-姜辣素可誘導小鼠肺組織中抗原重組蛋白1（MSR1）、脂肪酸受體蛋白36（CD36）和葡萄糖調節蛋白78（GRP78）的表達，升高肺泡細胞因子γ-干擾素（IFN-γ）和白細胞介素12（IL-12）的水平，降低IL-10和轉化生長因子β1（TGF-β1）的水平，增加M1巨噬細胞比例，降低M2巨噬細胞比例，減少肺部腫瘤結節數和直徑，改善肺組織病理結構異常[21]。由此也可推測，姜辣素類成分或為柴胡桂枝湯揮發油抑制肺癌細胞A549增殖的潛在活性成分之一。