響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘葉多酚超聲波輔助提取工藝研究

摘 要：本研究以料液比、乙醇濃度、超聲波功率、超聲波時(shí)間為研究因素，在進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，探討了超聲波輔助沙棘葉多酚提取的最優(yōu)工藝條件。研究發(fā)現(xiàn)，獲得最高沙棘葉多酚得率的提取工藝條件為料液比1∶7.5、乙醇濃度75%、超聲波功率492 W、超聲波時(shí)間70 min。在此工藝條件下，沙棘葉多酚實(shí)際得率為19.55%。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；沙棘葉多酚；超聲波輔助；提取工藝

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction Process for Polyphenols in Sea-Buckthorn Leaves by Response Surface Methodology

YANG Ying， BAI Song， HE Jing， LUO Ling

（Sichuan Vocational College of Chemical Industry， Luzhou 646099， China）

Abstract： This research tasked solid-liquid ratio， ethanol concentration， ultrasound power and ultrasound time as research factors. On the basis of conducting single factor experiments， response surface methodology was used to explore the optimal process conditions for ultrasound assisted extraction of polyphenols from sea-buckthorn leaves. Research had found that the extraction process parameters for obtaining the highest yield of sea-buckthorn leaf polyphenols were solid-liquid ratio of 1∶7.5， ethanol concentration of 75%， ultrasonic power of 492 W， and ultrasonic time of 70 minutes. Under these process conditions， the actual yield of sea-buckthorn leaf polyphenols was 19.55%.

Keywords： response surface methodology; sea-buckthorn leaf polyphenols; ultrasonic assisted; extraction process

沙棘（Hippophae rhamnoides）是胡頹子科沙棘屬落葉性灌木植物，又名酸刺、達(dá)日布[1]。沙棘具有耐旱、保持水土等作用，因此在我國西北地區(qū)廣泛種植[2]。沙棘除了具有生態(tài)保護(hù)作用外，還是一種典型的藥食同源植物，其根、莖、葉、花、果中富含多酚類、多糖類、黃酮類、氨基酸、維生素等豐富多樣的營養(yǎng)功效物質(zhì)，具有降血壓、降膽固醇、抗炎、抗氧化、緩解心絞痛發(fā)作等多重功效[3]。目前，人們對(duì)沙棘產(chǎn)品的研發(fā)主要集中于沙棘果實(shí)營養(yǎng)功效物質(zhì)的開發(fā)利用，而同樣富含營養(yǎng)功效物質(zhì)的沙棘葉常常被當(dāng)作廢棄物丟棄，從而造成了其中營養(yǎng)資源嚴(yán)重浪費(fèi)。本研究將采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，探索超聲波輔助法提取沙棘葉多酚的最佳工藝參數(shù)，旨在進(jìn)一步拓展沙棘葉開發(fā)利用途徑，為沙棘葉多酚類產(chǎn)品研發(fā)提供基礎(chǔ)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：甘肅恒有農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供的沙棘干葉。試劑：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（蘇州蘇泰科生物試劑有限公司）；福林酚、Na2CO3、Fe2CO3、無水乙醇（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）。

1.2 設(shè)備與儀器

101-X型電熱鼓風(fēng)干燥箱（常州市萬豐儀器制造有限公司）；HH-4A型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州隆和儀器制造有限公司）；DX-65型粉碎機(jī)（廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司）；TD5A型離心沉淀機(jī)（常州隆和儀器制造有限公司）；VGT-1730QT型高頻超聲波清洗器（廣東固特超聲股份有限公司）；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（杭州億捷科技有限公司）；UV-1800APC型紫外分光光度計(jì)（杭州俊升科學(xué)器材有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沙棘葉樣品處理

將沙棘葉在60 ℃條件下恒溫干燥4 h，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過20目篩，作為備用樣品。

1.3.2 沙棘葉中多酚提取工藝

精確稱取5 g沙棘葉粉末置于錐形瓶中，按試驗(yàn)設(shè)定的料液比，加入試驗(yàn)設(shè)定濃度的乙醇溶液150 mL，按照試驗(yàn)設(shè)定的超聲波輔助提取參數(shù)進(jìn)行提取，提取液過濾，濾液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后，用無水乙醇溶解，定容至150 mL，待測(cè)[4]。

1.3.3 沙棘葉中多酚得率測(cè)定

（1）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參考葛亮等[5]沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，進(jìn)行沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。經(jīng)計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為A=0.010 4c+0.0142，R2=0.998 4，線性關(guān)系良好。

（2）沙棘葉多酚得率計(jì)算。取1.0 mL試驗(yàn)樣品沙棘葉多酚提取液，按照上述操作方法，分別進(jìn)行吸光度值測(cè)定，然后根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及式（1）計(jì)算沙棘葉中多酚得率。

沙棘葉多酚得率=（C×V）/1 000×M×100%（1）

式中：C為沙棘葉多酚濃度，mg·mL-1；V為沙棘葉多酚提取液體積，mL；M為稱取的沙棘葉粉末質(zhì)量，g。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)因素分別為料液比、乙醇濃度、超聲波功率、超聲波時(shí)間，評(píng)價(jià)指標(biāo)為沙棘葉多酚得率。通過單因素試驗(yàn)，初步研究4項(xiàng)試驗(yàn)因素對(duì)沙棘葉多酚得率的影響，并確定響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平。

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)探求沙棘葉中多酚提取最佳工藝參數(shù)。因素水平編碼表見表1。本次響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)自變量為料液比（A）、乙醇濃度（B）、超聲波功率（C）、超聲波時(shí)間（D），因變量為沙棘葉多酚得率（Y）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比

在乙醇濃度為60%、超聲波功率為400 W、超聲波時(shí)間為60 min的條件下，依次設(shè)定料液比為1∶12、1∶10、1∶8、1∶6、1∶4，研究不同料液比對(duì)沙棘葉多酚得率的影響（見圖1）。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著提取液用量的增大，沙棘葉多酚得率的變化趨勢(shì)為先升高后降低。樣品沙棘葉多酚得率最大值對(duì)應(yīng)的料液比為1∶8。因此，選擇1∶10、1∶8、1∶6為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中料液比水平。

2.1.2 乙醇濃度

在料液比為1∶8、超聲波功率為400 W、超聲波時(shí)間為60 min的條件下，依次設(shè)定乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%，研究不同乙醇濃度對(duì)沙棘葉多酚得率的影響（見圖2）。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇濃度依次提高時(shí)，沙棘葉多酚得率的變化趨勢(shì)為先提升后緩慢降低。樣品沙棘葉多酚得率最大值對(duì)應(yīng)的乙醇濃度為70%。因此，選擇60%、70%、80%為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中乙醇濃度水平。

2.1.3 超聲波功率

在料液比為1∶8、乙醇濃度為60%、超聲波時(shí)間為60 min的條件下，依次設(shè)定超聲波功率為100 W、250 W、400 W、550 W、700 W，研究不同超聲波功率對(duì)沙棘葉多酚得率的影響（見圖3）。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)超聲波功率依次提高時(shí)，沙棘葉多酚得率的變化趨勢(shì)為先迅速提升后緩慢降低。樣品沙棘葉多酚得率最大值對(duì)應(yīng)的超聲波功率為400 W。因此，選擇250 W、400 W、550 W為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中超聲波功率水平。

2.1.4 超聲波時(shí)間

在料液比為1∶8、乙醇濃度為60%、超聲波功率為400 W的條件下，依次設(shè)定超聲波時(shí)間為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，研究不同超聲波時(shí)間對(duì)沙棘葉多酚得率的影響（見圖4）。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)超聲波時(shí)間依次提升時(shí)，沙棘葉多酚得率的變化趨勢(shì)為先提升后緩慢降低。樣品沙棘葉多酚得率最大值對(duì)應(yīng)的超聲波時(shí)間為60 min。因此，選擇40 min、60 min、80 min為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中超聲波時(shí)間水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素組合與結(jié)果如表2所示。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

結(jié)合表2中響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，建立響應(yīng)面二次回歸模型，確定回歸方程為Y=18.93-0.12A+0.46B+0.20C+0.10D-0.098AB+0.54AC-0.10AD-0.11BC+0.07BD+0.26CD-0.52A2-0.40B2-0.25C2-0.29D2。

根據(jù)表3中回歸模型偏方差分析結(jié)果可知，回歸模型失擬項(xiàng)的P值大于0.05，沒有達(dá)到顯著水平，說明回歸模型與試驗(yàn)實(shí)際結(jié)果擬合程度良好；回歸方程模型P值＜0.01，說明本次響應(yīng)面試驗(yàn)所建立的回歸模型達(dá)到極顯著性水平，回歸模型可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果；回歸系數(shù)R2=0.966 5，R2adj=0.933 0，說明回歸方程試驗(yàn)擬合狀況良好，誤差較小。

表3中一次項(xiàng)的F值的大小可以用于判斷4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)沙棘葉多酚得率的影響程度。F值越大的試驗(yàn)因素對(duì)沙棘葉多酚得率的影響越大。結(jié)合表3可知，F(xiàn)B＞FC＞FA＞FD，這說明4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)沙棘葉多酚得率的影響由大到小依次為乙醇濃度＞超聲波功率＞料液比＞超聲波時(shí)間。

從一次項(xiàng)看，與Y均呈正相關(guān)的試驗(yàn)因素為B、C、D，呈負(fù)相關(guān)的試驗(yàn)因素為A。其中，A、B、C對(duì)Y的影響均達(dá)到極顯著水平；D對(duì)Y的影響達(dá)到顯著水平。從交互項(xiàng)看，AC、BD、CD與Y呈正相關(guān)，AB、AD、BC與Y呈負(fù)相關(guān)。其中，AC、CD對(duì)Y的影響達(dá)到極顯著水平；AB、AD、BC、BD對(duì)Y的影響不顯著。從二次項(xiàng)看，A2、B2、C2、D2與Y均呈負(fù)相關(guān)，且對(duì)Y的影響均達(dá)到極顯著水平。

在本次響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中交互作用的3D曲線圖中（圖5），曲張程度最高的交互作用3D曲面圖為料液比（A）與超聲波功率（C）的交互圖形，說明料液比（A）與超聲波功率（C）的交互作用對(duì)沙棘葉多酚得率的影響最為顯著，這一圖示表征的結(jié)果也符合表3中偏回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果。

2.2.3 回歸模型最優(yōu)試驗(yàn)組合選擇與驗(yàn)證

通過Design-Expert 10.0軟件的回歸方程最優(yōu)解分析功能，確定獲得最高沙棘葉多酚得率的試驗(yàn)組合為料液比1∶7.5、乙醇濃度75.19%、超聲波功率492.37 W、超聲波時(shí)間69.66 min。結(jié)合試驗(yàn)的操作可行性，上述工藝條件組合應(yīng)適度調(diào)整為料液比1∶7.5、乙醇濃度75%、超聲波功率492 W、超聲波時(shí)間70 min。在此工藝條件下，沙棘葉多酚得率的理論值為19.82%。

按照最優(yōu)試驗(yàn)組合條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，所取得沙棘葉多酚得率平均值為19.55%，得率較高，與回歸方程測(cè)算的理論最大值之間的相對(duì)誤差為1.38%，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)中相對(duì)誤差不超過10%的要求，說明利用響應(yīng)面法所建立的回歸模型能夠很好地預(yù)測(cè)沙棘葉多酚得率，且穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)沙棘葉多酚得率的影響由大到小依次為B乙醇濃度＞C超聲波功率＞A料液比＞D超聲波時(shí)間。獲得最高沙棘葉多酚得率的提取工藝條件組合為料液比1∶7.5、乙醇濃度75%、超聲波功率492 W、超聲波時(shí)間70 min。在此工藝條件下，沙棘葉多酚實(shí)際得率為19.55%。

本試驗(yàn)利用響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)方法，優(yōu)化了超聲波輔助沙棘葉多酚提取工藝技術(shù)，為深入開展沙棘葉多酚研究提供了理論基礎(chǔ)參考。隨著沙棘葉多酚提取工藝研究的日漸成熟，更多的沙棘葉多酚相關(guān)產(chǎn)品將會(huì)得到開發(fā)利用。

參考文獻(xiàn)

[1]陳奕璇，郭佳琦，關(guān)文強(qiáng)，等.沙棘綜合開發(fā)利用研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（19）：201-207.

[2]李曉艷，楊福多.沙棘生長氣候條件分析與其種植培育技術(shù)要點(diǎn)[J].農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2022，12（12）：75-77.

[3]丁肇俊，葉健文，馬佳琪，等.沙棘葉化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].世界中醫(yī)藥，2023，18（5）：714-720.

[4]田建華.沙棘葉多酚提取物及其抗氧化活性研究[J].食品工程，2023（2）：48-50.

[5]葛亮，李琦，李森，等．沙棘果總多酚提取工藝的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J]．化學(xué)與生物工程，2023，40（3）：30-35.

作者簡(jiǎn)介：楊英（1983—），女，四川眉山人，本科，實(shí)驗(yàn)師。研究方向：微生物、食品檢測(cè)、食品營養(yǎng)及加工。