UPLC-MS/MS測(cè)定豬肉中頭孢類藥物的殘留量

摘 要：本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)豬肉中頭孢類藥物殘留量進(jìn)行分析。樣品經(jīng)乙腈-水溶液和磷酸鹽緩沖溶液提取，HLB固相萃取柱純化后用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，3種頭孢類藥物濃度在0～200 ng·mL-1時(shí)，相關(guān)系數(shù)大于0.996，線性關(guān)系良好；檢出限為0.001～0.365 μg·kg-1，定量限為0.003～1.220 μg·kg-1。不同濃度下樣品的加標(biāo)回收率為83.2%～95.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～7.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.078～2.817 μg·kg-1。

關(guān)鍵詞：豬肉；頭孢類藥物；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；固相萃取柱

Determination of Cephalosporin Residues in Pork by UPLC-MS/MS

SUN Yuying， LI Qihui， CHEN Yue

（National Light Industry Food Quality Supervision and Testing of the Nanjing Station ，Nanjing 211816， China）

Abstract： This article uses ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry to analyze the residual levels of cephalosporins in pork. The sample was extracted by acetonitrile aqueous solution and phosphate buffer solution， purified by HLB solid-phase extraction column， and determined by ultra-high performance liquid chromatography mass spectrometry. The results showed that the correlation coefficient （R2） of the three cephalosporin drugs was greater than 0.996 within 0～200 ng·mL-1， indicating a good linear relationship; the detection limit is 0.001～0.365 μg·kg-1， with a quantification limit is 0.003～1.220 μg·kg-1. The spiked recovery rates of samples at different concentrations is 83.2%～95.2%， with a relative standard deviation is 1.9%～7.5% and a standard deviation is 0.078～2.817 μg·kg-1.

Keywords： pork; cephalosporins; ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; solid-phase extraction column

獸藥可作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，在畜牧業(yè)中還被廣泛用于疾病的治療和預(yù)防。但獸藥使用不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中存在獸藥殘留物。頭孢菌素類抗生素由天然頭孢菌素C衍生而來(lái)，被廣泛用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的疾病，如牛乳腺炎、腹瀉病毒等。由于其具有良好的治療效果、低致敏性、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的抗菌藥物。但頭孢菌素類藥物的不當(dāng)使用可能會(huì)使肉制品中殘留該藥物并危害人們的健康，如耐藥性和過(guò)敏反應(yīng)。目前對(duì)頭孢類藥物殘留分析的方法主要有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和微生物法，由于上述方法通常煩瑣且缺乏選擇性，而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）具有高特異性、高靈敏性、高準(zhǔn)確性等優(yōu)勢(shì)[1]，本研究采用UPLC-MS/MS方法對(duì)豬肉中3種頭孢類藥物的殘留量進(jìn)行分析，為測(cè)定豬肉中頭孢類藥物殘留量提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉，購(gòu)自盒馬；頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于95%，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；乙腈（質(zhì)譜純，默克）；甲酸（色譜純）；磷酸二氫鉀（分析純）；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters-TQ-Cronos液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；BSA124S-CW電子天平（萬(wàn)分之一）；移液器（艾本德中國(guó)有限公司）；離心機(jī)（上海安亭-GL-20G-Ⅱ）；渦旋儀（其林貝爾儀器-Vortex QL-861）；BFAA-DC24-RT加熱氮吹儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

用10 mL乙腈-水溶液提取2 g豬肉樣品，均質(zhì)提取1 min，10 000 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，重復(fù)提取1次后將上清液合并至雞心瓶中。40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈，立即加入20 mL磷酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻后待凈化。移取上清液至HLB固相萃取小柱中，依次用3 mL磷酸鹽緩沖溶液，2 mL水淋洗，5 mL甲醇洗脫于離心管中。將提取的溶液氮吹蒸發(fā)至干，然后用1mL 0.1%甲酸水-乙腈溶液溶解殘留物，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

分別移取頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液250 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈-水溶液稀釋至刻度線，配制成濃度為10 μg·mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。吸取100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙腈-水稀釋至1 mL，配制成濃度為1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為0～200 ng·mL-1，配制完成后上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，B為乙腈；流速為0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

ESI正離子模式；監(jiān)測(cè)模式：MRM；霧化器溫度：500 ℃；霧化器流速：800 L·h-1；毛細(xì)管電壓：0.50 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水，B相為純乙腈，采用梯度洗脫時(shí)，檢測(cè)物的峰型良好，具有較高的靈敏度。在正電離模式下，甲酸可以提供豐富的質(zhì)子供應(yīng)，有利于[M+H]+離子的形成，使目標(biāo)物之間、目標(biāo)物與溶劑峰之間能夠較好分離[2]，因此本研究選擇0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)中3種頭孢類藥物的保留時(shí)間為2.0～6.0 min，調(diào)整有機(jī)相比例和梯度洗脫，切換閥控制主峰不流入質(zhì)譜，同時(shí)確保每次樣品測(cè)定時(shí)主峰能被完全洗脫而不影響下一針樣品的檢測(cè)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2 質(zhì)譜條件

分別配制3種頭孢類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液

（200 ng·mL-1），采用ESI+模式掃描，選擇相對(duì)豐度較高、出峰穩(wěn)定的母離子和子離子碎片。母離子和子離子碎片通過(guò)ESI柱洗脫液進(jìn)入施加電壓的不銹鋼毛細(xì)管中，加熱的氣體（通常為氮?dú)猓┭刂?xì)管傳遞，導(dǎo)致洗脫液霧化和帶電液滴產(chǎn)生，而這些液滴在經(jīng)歷過(guò)庫(kù)侖裂變，進(jìn)入質(zhì)譜儀前便通過(guò)解吸和解溶轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的離子[3]。3種頭孢類藥物最優(yōu)的UPLC-MS/MS檢測(cè)參數(shù)如表2所示。其標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖見(jiàn)圖1。各藥物的色譜峰峰型尖銳且保留時(shí)間處無(wú)雜峰干擾。

2.3 固相萃取小柱的選擇

HLB固相萃取小柱對(duì)疏水化合物或親水化合物都有良好的適應(yīng)性[4-5]，能有效保留甘油酯、磷脂、蛋白質(zhì)等化合物，且使用前無(wú)須活化和平衡，可有效富集凈化目標(biāo)成分，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，綜合實(shí)驗(yàn)對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)用HLB作為固相萃取小柱。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用外標(biāo)定量法，繪制豬肉中頭孢類藥物的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），得到的線性回歸方程見(jiàn)表3，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖2所示。當(dāng)3種頭孢類藥物的濃度在0～200 ng·mL-1時(shí)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 2～0.999 8，均大于0.99。

2.5 回收率、精密度與檢出限測(cè)定結(jié)果

在豬肉空白基質(zhì)中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加水平為5 μg·kg-1、10 μg·kg-1、50 μg·kg-1共3個(gè)濃度，每批次添加水平做6個(gè)平行樣品，重復(fù)測(cè)定3次。由表4可知，3種頭孢類藥物的加標(biāo)回收率為83.2%～95.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～7.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.078～2.817 μg·kg-1。結(jié)果表明，該方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比時(shí)添加的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限和定量限，結(jié)果如表5所示。3種頭孢類藥物的檢出限為0.001～0.365 μg·kg-1，定量限為0.003～1.220 μg·kg-1。根據(jù)《出口動(dòng)物源食品中頭孢類抗生素殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 1988—2023）規(guī)定頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉在動(dòng)物源食品中的檢出限為2.0 μg·kg-1，定量限為5.0 μg·kg-1，而本方法檢出限為0.001～0.365 μg·kg-1，定量限為0.003～1.220 μg·kg-1，能滿足頭孢類藥物含量分析的需要。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定豬肉中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉的含量，結(jié)果表明3種頭孢類藥物在0～200 ng·mL-1相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.996，線性關(guān)系良好；其中方法檢出限為0.001～0.365 μg·kg-1，定量限為0.003～1.220 μg·kg-1。樣品的加標(biāo)回收率為83.2%～95.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～7.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.078～2.817 μg·kg-1。建立的方法快速、簡(jiǎn)單，重復(fù)性和選擇性好，適用于豬肉樣品中頭孢類藥物殘留量的檢測(cè)。

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作者簡(jiǎn)介：孫鈺瑩（1997—），女，福建福州人，碩士。研究方向：食品檢測(cè)。