豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留的降解規(guī)律研究

摘 要：目的：研究豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的降解規(guī)律。方法：通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以未檢出4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的黃豆芽、綠豆芽為空白基質(zhì)，采用加標回收試驗研究樣品在冷藏和冷凍條件下4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的動態(tài)殘留量。結(jié)果：冷凍條件下，黃豆芽、綠豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉降解半衰期分別為44.1 d、90.0 d，6-芐基腺嘌呤降解半衰期分別為32.4 d、40.8 d。冷藏條件下，黃豆芽、綠豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉降解半衰期分別為37.5 d、45.3 d，6-芐基腺嘌呤降解半衰期分別為11.8 d、31.8 d。結(jié)論：該研究為豆芽中4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤因自身降解造成初檢結(jié)論被推翻的情況提供了理論參考。

關(guān)鍵詞：豆芽；降解；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；4-氯苯氧乙酸鈉；6-芐基腺嘌呤

Degradation Rules Study of 4-Chlorophenxyacetate and 6-Benzylaminopurine in Bean Sprouts

HUANG Binbin1， WANG Xiaozhen1， PEI Liyan1， QIN Bin1， HUANG Chunyan1， HUANG Jingzhou2

（1.Qinzhou Inspection and Testing Centre， Qinzhou 535000， China;

2.Guangxi Qinzhou Xinghe Food Co.， Ltd.， Qinzhou 535000， China）

Abstract： Objective： To study the residues degradation rule of plant growth regulators 4-chlorophenxyacetate and 6-benzylaminopurine in bean sprout. Method： The ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was used to study the dynamic residues of sodium 4-chlorophenoxyacetate and 6-benzyladenine in soybean sprouts under refrigeration and freezing conditions by standard addition recovery test， and soybean sprouts and mung bean sprouts without detected 4-chlorophenoxyacetic acid sodium and 6-benzyladenine were used as blank matrices. Result： Under freezing conditions， the degradation half-lives of 4-chlorophenxyacetate in soybean sprouts and mung bean sprouts were 44.1 d and 90.0 d， respectively， and the degradation half-lives of 6-benzylaminopurine were 32.4 d and 40.8 d， respectively. Under cold storage conditions， the degradation half-lives of 4-chlorophenxyacetate in soybean sprouts and mung bean sprouts were 37.5 d and 45.3 d， respectively， and the degradation half-lives of 6-benzylaminopurine were 11.8 d and"31.8 d， respectively. Conclusion： The study provide a theoretical study on the situation that the preliminary detection conclusion is overturned due to the degradation of bean sprouts itself.

Keywords： bean sprouts; degradation; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; 4-chlorophenxyacetate; 6-benzylaminopurine

豆芽是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾氖巢模蚱錉I養(yǎng)豐富[1-2]、生長周期短且價格實惠深受人們喜愛。然而，在豆芽生產(chǎn)過程中，不法商販濫用植物生長調(diào)節(jié)劑導致毒豆芽事件頻發(fā)[3-4]。原國家食品藥品監(jiān)督管理總局、原農(nóng)業(yè)部、原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布2015年第11號公告《關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告》[5]。公告發(fā)布后，市面上“毒豆芽”大大減少。但是近年來監(jiān)督抽檢發(fā)現(xiàn)，豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的不合格率依然遠高于其他農(nóng)藥殘留，表明豆芽生產(chǎn)過程中還存在使用植物生長調(diào)節(jié)劑的情況[6-9]，人們也日益關(guān)注豆芽的質(zhì)量安全。不同于2015年之前“毒豆芽”頻頻檢出高含量植物生長調(diào)節(jié)劑的情況，如今不法商販在豆芽中添加低含量的4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤[6-9]，且由于4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤會發(fā)生降解[10-12]，給檢測帶來了難題。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，有關(guān)豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑降解的研究鮮有報道，且相關(guān)文獻中實驗研究所用劑量較高[11-12]，與豆芽生產(chǎn)添加低含量植物生長調(diào)節(jié)劑的實際情況存在較大差異。

《食品安全抽樣檢驗管理辦法》對抽檢和復檢工作的流程和期限進行了嚴格要求，樣品從抽樣、檢驗到復檢結(jié)束最長需70個工作日，從初檢完成到出具復檢結(jié)論，最長需45個工作日[13]。在此期間，豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留因外界環(huán)境和自身性質(zhì)影響會發(fā)生降解，導致承檢機構(gòu)的初檢結(jié)論被推翻，甚至導致承檢機構(gòu)在質(zhì)量考核和監(jiān)督檢查中受到處罰[14]，損害承檢機構(gòu)在行業(yè)內(nèi)的形象，同時影響政府部門對食品安全抽檢的公信力、權(quán)威性和嚴肅性[15-16]。

為進一步明確豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的降解規(guī)律，本研究對黃豆芽、綠豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤在冷藏、冷凍條件下的殘留量隨時間的變化進行了研究，探索其降解半衰期，以期為抽檢工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆芽、綠豆芽：市售，經(jīng)《豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定》（BJS 201703）檢測，均未檢出4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；乙酸銨（色譜純，上海麥克林生化科技股份有限公司）；無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；QuEChERS 管[含300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18，Q-15C02，納譜分析技術(shù)（蘇州）有限公司]；實驗用水為實驗室一級水。

4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤標準品

（1 000 μg·mL-1，批號23060153、23060672，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity UPLC 1-Class Plus超高效液相色譜儀串聯(lián)XEVO TQ-S Cronos質(zhì)譜儀，美國Waters公司；VM04渦旋混合器，蘇州環(huán)美生物醫(yī)療科技有限公司；立邦966C高速攪拌勻漿機，中山市十三郎電器有限公司；Multifuge x3r冷凍離心機，美國Thermo Fisher 公司；LS220A SCS千分之一電子天平，上海天美天平儀器有限公司；mpevae氮吹濃縮儀，瑞萊博儀器（廣州）有限公司；Flex2+Micra超純水機，威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

稱取“1.1”中一定量黃豆芽、綠豆芽，經(jīng)高速攪拌勻漿機充分打碎混勻，制成樣品空白勻漿，取黃豆芽、綠豆芽空白勻漿各3 kg[17]，添加4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤標準品，使其在黃豆芽、綠豆芽勻漿中含量均為0.05 mg·kg-1，充分攪拌并混合均勻制成加標樣品。準確稱取10 g加標樣品分裝于50 mL離心管中密封，避光于冷藏4 ℃和冷凍-18 ℃冰箱中保存。

1.3.2 檢測時間

在樣品加標制備后放置0 d、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、15 d、20 d、25 d以及30 d時進行檢測，每次取2份平行樣品解凍后檢測。

1.3.3 基質(zhì)匹配工作曲線

（1）混合標準中間液（10 μg·mL-1）。分別精密移取4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤標準儲備液（1 000 μg·mL-1）各0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10 μg·mL-1的混合標準中間液。

（2）基質(zhì)標準工作溶液。準確稱取黃豆芽、綠豆芽樣品空白勻漿各10 g，分別精密移取混合標準中間液0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.10 mL，用兩種空白基質(zhì)提取液配制成濃度分別為10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、60 ng·mL-1、80 ng·mL-1、100 ng·mL-1的基質(zhì)標準工作溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 加標回收試驗

加標回收試驗時間與加標樣品檢測時間同步，每次取2份平行樣品，每份重復測定2次，取均值。準確稱取“1.3.1”中黃豆芽、綠豆芽樣品空白勻漿各10 g，添加4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤混合標準中間液，使其含量均為0.03 mg·kg-1，按照《豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定》（BJS 201703）前處理方法提取、凈化并進行檢測[18]，進行加標回收率的驗證。

1.3.5 檢測條件

（1）色譜條件。Waters色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相A：5 mmol·L-1乙酸銨0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；流速：0.35 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～3.5 min，90% B；3.5～4.0 min，95% B；4.0～5.0 min，10% B。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI-）；采集方式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測；毛細管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：30 V；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L·Hr-1；其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離

在1.3.5質(zhì)譜工作參數(shù)下，4-氯苯氧乙酸（4-Chlorophenoxyacetic Acid，4-CPA）和6-芐基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）的離子譜圖具有良好的峰型，見圖1。

2.2 標準曲線、檢出限與回收率

在10～100 ng·mL-1時，4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤的峰面積和濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比計算，得出4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤的檢出限為0.004 mg·kg-1，添加水平為0.03 mg·kg-1的4-氯苯氧乙酸鈉在黃豆芽和綠豆芽中的回收率分別為85.8%～101.3%、83.1%～97.5%，添加水平為0.03 mg·kg-1的6-芐基腺嘌呤在黃豆芽和綠豆芽中的回收率分別為87.4%～96.3%、82.7%～94.9%。回收率結(jié)果符合《豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定》（BJS 201703）要求[18]。

2.3 建立降解模型

4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤在黃豆芽、綠豆芽中初始含量均為0.05 mg·kg-1，兩者在冷藏、冷凍條件下隨時間的降解曲線見圖2，其降解規(guī)律符合一級動力學[19-20]。建立4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤降解一級動力學模型

C=C0×e-kt（1）

式中：C為t天的殘留量，mg·kg-1；C0為初始含量，mg·kg-1；t為降解時間，d；k為降解速率常數(shù)。

4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤降解50%所需要的時間稱為半衰期，以T1/2表示，T1/2=ln2×k-1。結(jié)果表明，兩者在黃豆芽、綠豆芽中的降解動態(tài)與一級動力學模型擬合度良好，可進一步分析降解率和半衰期變化。

2.4 黃豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留降解規(guī)律分析

由表2可知，4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤在黃豆芽中的降解方程相關(guān)系數(shù)較好，R2＞0.92。在4 ℃冷藏條件下，4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的降解速率整體而言快于冷凍條件，表明冷凍可以有效減緩其降解速率。在4 ℃冷藏和-18 ℃冷凍條件下，

6-芐基腺嘌呤的降解速率明顯大于4-氯苯氧乙酸鈉，說明4-氯苯氧乙酸鈉比6-芐基腺嘌呤穩(wěn)定，不易降解。在冷凍條件下，黃豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的理論半衰期分別為44.1 d和32.4 d。依據(jù)《關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告》[5]，豆芽中不得檢出4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤，而《豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定》（BJS 201703）[18]中兩者的定量限均為0.010 mg·kg-1。從降解曲線和理論半衰期分析可知，從抽檢到復檢的60～70個工作日內(nèi)，初檢機構(gòu)對黃豆芽樣品中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的檢驗值低于0.02 mg·kg-1時，有被復檢機構(gòu)推翻結(jié)論的風險。

2.5 綠豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留降解規(guī)律分析

分析表2和表3可知，4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤在綠豆芽中的降解速率較黃豆芽慢，半衰期更長，說明其在綠豆芽中更穩(wěn)定。在冷藏和冷凍條件下，綠豆芽中6-芐基腺嘌呤的降解速率明顯大于4-氯苯氧乙酸鈉，表明6-芐基腺嘌呤更易降解。在冷凍條件下，綠豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的理論半衰期分別為90.0 d和40.8 d。根據(jù)《關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告》[5]和BJS 201703[18]，初檢機構(gòu)對綠豆芽樣品中6-芐基腺嘌呤的檢驗值低于0.02 mg·kg-1時，有被復檢機構(gòu)推翻結(jié)論的風險。

3 結(jié)論與討論

本研究基于《豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定》（BJS 201703），結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對黃豆芽、綠豆芽中的4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤在4 ℃冷藏和-18 ℃冷凍條件下的降解行為，建立了一級動力學模型。研究表明，在冷藏和冷凍條件下，6-芐基腺嘌呤比4-氯苯氧乙酸鈉更易降解，從抽檢至復檢約70個工作日內(nèi)，6-芐基腺嘌呤降解會超過50%；在冷凍條件下，4-氯苯氧乙酸鈉在黃豆芽和綠豆芽中的半衰期分別為44.1 d和90.0 d，6-芐基腺嘌呤在黃豆芽和綠豆芽中的半衰期分別為32.4 d和40.8 d；初檢機構(gòu)對黃豆芽、綠豆芽樣品中6-芐基腺嘌呤的檢驗值低于0.02 mg·kg-1、黃豆芽樣品中4-氯苯氧乙酸鈉的檢驗值低于0.02 mg·kg-1時，被復檢機構(gòu)推翻結(jié)論的可能性較大。

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基金項目：廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局科技項目“豆芽中 4- 氯苯氧乙酸和 6- 芐基腺嘌呤的降解規(guī)律和消除研究”（GSJKJZC2022-20）。

作者簡介：黃彬彬（1987—），女，廣西南寧人，碩士，工程師。研究方向：食品污染元素、添加劑、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等方面檢測。