重構枯草芽孢桿菌的木糖代謝通路生產乙醇酸

摘 要：本研究旨在獲得一株可利用麩皮生產乙醇酸的食品安全菌。通過同時過表達xdh和yjhG，構建了基因工程菌XDH-YjhG，該菌株能夠利用麩皮生產乙醇酸，產量為3.15 g·L-1。本研究首次證明了可利用麩皮作為碳源生產乙醇酸，為乙醇酸的工業化生產奠定了基礎。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；麩皮；乙醇酸

Reconstructing the Xylose Metabolic Pathway of Bacillus subtilis to Produce Glycolic Acid

JI Minghua

（Kinry Food Ingredients Co.， Ltd.， Shanghai 200000， China）

Abstract： This study aims to obtain a food-safe bacterium capable of utilizing wheat bran to produce acetic acid. By co-overexpressing xdh and yjhG， a genetically engineered strain XDH-YjhG was constructed， which could use wheat bran to produce acetic acid with a yield of 3.15 g·L-1. This study is the first to demonstrate the use of wheat bran as a carbon source for the production of acetic acid， laying the foundation for the cost-effective industrial production of acetic acid.

Keywords： Bacillus subtilis; wheat bran; acetic acid

乙醇酸（HOCH2COOH）是最簡單的α-羥基酸，別名羥基乙酸或甘醇酸，可廣泛用于食品、醫藥和化妝品等領域。近年來，全生物法合成乙醇酸因其安全無毒、條件溫和等特點而廣受關注，具有較好的前景。利用代謝工程手段，改造菌株的D-木酮糖-1-磷酸途徑、Dahms途徑或乙醛酸旁路途徑等，可以實現乙醇酸的全生物合成[1]。

枯草芽孢桿菌已獲得“GRAS”和“QPS”雙料認證，菌株安全。本研究以枯草芽孢桿菌為出發菌，通過木糖脫氫酶編碼基因xdh和木糖酸脫水酶編碼基因yjhG的異源表達，構建了一株食品安全菌。實驗證明該菌株可利用麩皮生產乙醇酸，該研究對于以廉價生物質生產乙醇酸具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株質粒

實驗所用菌株164T7P為實驗室保存，T7P-YjhG、XDH、XDH-YjhG為本文構建；質粒pMK4-PxylA-yjhG、pMK4-T7、pUC57-xdh和pMD19T-aea為實驗室保存，pMK4-T7-yjhG為本文構建。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備

細胞培養使用LB培養基。添加1%木糖為誘導培養基；添加1%木糖和1%木糖酸為木糖酸發酵培養基；添加2%木聚糖為木聚糖發酵培養基；添加6%麩皮為麩皮發酵培養基。

1.2.2 質粒構建

采用Simple Cloning的方式在枯草芽孢桿菌中進行質粒pMK4-T7-yjhG的構建[2]，使用引物見表1。在添加氯霉素的LB抗性固體板上篩選出陽性轉化子，提取質粒測序驗證。

1.2.3 基因表達盒的構建

用于敲入xdh基因的基因表達盒xdh cassette通過融合PCR方法構建得到，PCR擴增過程參考文獻[3]。所用的引物序列（5’→3’）見表2。

1.2.4 枯草芽孢桿菌轉化及菌種構建

菌株構建方法參考文獻[3]。質粒pMK4-T7-yjhG轉化枯草芽孢桿菌164T7P，涂布于氯霉素抗性平板篩選，得到的陽性轉化子命名為T7P-YjhG；基因表達盒xdh cassette轉化枯草芽孢桿菌164T7P，涂布于紅霉素抗性平板篩選，得到的陽性轉化子命名為XDH；進一步地，質粒pMK4-T7-yjhG轉化枯草芽孢桿菌XDH，涂布于氯霉素抗性平板篩選，所得到的陽性轉化子命名為XDH-YjhG。

1.2.5 發酵實驗

研究采用搖瓶發酵實驗。在LB中接種，37 ℃、200 r·min-1隔夜培養；然后將過夜培養物轉接至搖

瓶，培養基分別為木糖酸發酵培養基、木糖發酵培養基、木聚糖發酵培養基或麩皮發酵培養基，于搖床中37 ℃、200 r·min-1進行培養。

1.2.6 發酵產物的檢測與分析

發酵液樣品處理：取1 mL發酵液于12 000 r·min-1離心5 min，取上清液進行檢測。液相條件：色譜柱型號為Aminex HPX-87H column，使用硫酸溶液（0.005 mmol·L-1）作為流動相，設置流速為0.6 mL·min-1，柱溫為65 ℃。

2 結果與分析

2.1 在枯草芽孢桿菌中過表達yjhG

枯草芽孢桿菌中缺乏乙醇酸生產的關鍵酶，不能經由木糖酸生成乙醇酸。本實驗室前期研究證明，只需過表達yjhG，后續借助枯草芽孢桿菌內源性酶，即可使枯草芽孢桿菌將木糖酸最終轉化為乙醇酸[4]。為了進一步優化乙醇酸轉化率，本研究從實驗室構建的164T7P出發，采用更高效的T7啟動子作為表達元件，過表達yjhG基因，構建了菌株T7P-YjhG[圖1（a）]。圖1（b）的曲線為發酵72 h上清液液相結果，深色為164T7P發酵液上清樣品，淺色為T7P-YjhG發酵液上清樣品，表明乙醇酸合成通路構建成功。發酵生產乙醇酸的檢測結果如圖1（c）所示，T7P-Yjh共積累乙醇酸0.93 g·L-1，消耗木糖酸3.85 g·L-1，摩爾轉化率為52.74%。前期實驗結果顯示，在使用PxylA為啟動子時，消耗木糖酸生產乙醇酸的摩爾轉化率為42.54%，這表明采用T7作為表達元件，針對木糖酸的轉化率更為高效。

2.2 利用麩皮生產乙醇酸

枯草芽孢桿菌僅能將木糖磷酸化，使其流向磷酸戊糖途徑，但不能將其轉化為木糖酸。為使木糖代謝流向乙醇酸，而不是進入磷酸途徑，本研究首先敲除了xylA-xylB片段[5]，同時將木糖脫氫酶編碼基因xdh通過同源重組的方式，整合到菌株基因組DNA，構建了枯草芽孢桿菌XDH。在木糖培養基中進行搖瓶發酵評價，研究Xdh蛋白的表達效果。發現菌株XDH能夠將木糖轉化為木糖酸，120 h木糖完全消耗，積累木糖酸17.51 g·L-1，摩爾轉化率為79.12%（數據未展示）。

將質粒pMK4-T7-yjhG轉化到枯草芽孢桿菌XDH，構建了XDH-YjhG，評價其對木糖、木聚糖和麩皮的轉化能力，見圖2。

在含20 g·L-1木糖的LB培養基中進行搖瓶發酵評價，研究菌株是否能夠生產乙醇酸，發酵結果見圖2（a）。由結果可知，XDH-YjhG可以生成乙醇酸，最終積累產量為0.99 g·L-1。為探究所構建的XDH-YjhG能夠利用木聚糖生產乙醇酸，本研究在含

20 g·L-1的木聚糖培養基中開展了發酵研究。由結果可知，XDH-YjhG可以利用木聚糖生成乙醇酸，最終積累產量為1.20 g·L-1，與木糖相比，其產量增加了21.21%。本研究進一步在麩皮發酵培養基中開展研究，由圖2（a）可以看到乙醇酸產量最終最高達到3.15 g·L-1。推測枯草芽孢桿菌可通過內源性木聚糖酶，水解出麩皮中的木糖單體，而木糖進一步在Xdh的催化下生成木糖酸，然后經由Dahms途徑生成乙醇酸，見圖2（b）。

3 結論

本研究證明，在枯草芽孢桿菌中僅需表達yjhG基因就可實現木糖酸到乙醇酸的轉化；共表達xdh和yjhG，并敲除xylA-xylB片段，可重構枯草芽孢桿菌的木糖代謝途徑，使其可利用麩皮產乙醇酸。綜合上述研究結果，本研究首次證明了使用麩皮發酵生產乙醇酸的可行性，為食品級生物基的乙醇酸的廉價生產奠定了基礎。

參考文獻

[1]SALUSJ?RVI L，HAVUKAINEN S，KOIVISTOINEN O，et al.Biotechnological production of glycolic acid and ethylene glycol： current state and perspectives[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2019，103：2525-2535.

[2]YOU C，ZHANG X Z，ZHANG Y H P.Simple cloning via direct transformation of PCR product （DNA Multimer） to Escherichia coli and Bacillus subtilis[J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78（5）：1593-1595.

[3]JI M H，LI S J，CHEN A，et al.A wheat bran inducible expression system for the efficient production of α-L-arabinofuranosidase in Bacillus subtilis[J].Enzyme and Microbial Technology，2021，144：109726.

[4]凌翓，紀明華，段海燕，等.木糖酸氧化途徑在枯草芽孢桿菌的構建及轉化乙醇酸的研究[J].生物技術通報，2019，35（6）：76-82.

[5]CHEN J Q， ZHU Y M， FU G，et al.High-level intra-and extra-cellular production of D-psicose 3-epimerase via a modified xylose-inducible expression system in Bacillus subtilis[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2016，43（11）：1577-1591.

作者簡介：紀明華（1989—），男，河北臨西人，博士，工程師。研究方向：生物化工、食品微生物。