葫蘆素B 誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制研究

劉致遠(yuǎn)，曾瑾子,+，鄭桐煜，黃日明,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東湛江 524023）

結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，盡管近年來結(jié)腸癌的診斷和治療取得了一定的進(jìn)展，但該疾病的死亡率仍然很高。這主要是因為缺乏早期篩查和預(yù)后監(jiān)測的生物標(biāo)志物，導(dǎo)致大多數(shù)患者在就診時已處于晚期，使得治療效果大打折扣[1]。近年來，從動物、植物、微生物等生物來源中提取的具有廣泛的生物活性和藥理活性的天然產(chǎn)物分子，被認(rèn)為在新型藥物的開發(fā)中存在巨大潛力。葫蘆素B（Cucurbitacin B，CUB）是一種來自葫蘆科植物的四環(huán)三萜類化合物，在現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)的八種不同結(jié)構(gòu)的葫蘆素中，它的生物活性最為活躍。研究報道，CuB 可以通過調(diào)控信號通路發(fā)揮出強(qiáng)效的抗病毒、抗炎、抗癌等藥理作用[2]。現(xiàn)有大量研究表明，CuB 主要通過抑制細(xì)胞增殖、阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗癌作用[3]。

鐵死亡是Dixon 于2012 年提出的一種不同于自噬和細(xì)胞凋亡的新型細(xì)胞死亡方式[4-6]，主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)鐵的積累和脂質(zhì)過氧化[7]。鐵死亡過程由小分子誘導(dǎo)劑啟動，如erastin[8]和RSL3[9]，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵的積累、胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、活性氧的積累和脂質(zhì)過氧化。此外，針對傳統(tǒng)療法存在的局限性（例如癌細(xì)胞的耐藥性），鐵死亡誘導(dǎo)劑（如erastin 和RSL3）被認(rèn)為能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞對傳統(tǒng)癌癥治療藥物的敏感性[10]。由于其獨(dú)特的作用機(jī)制及克服當(dāng)前癌癥治療難點(diǎn)存在的巨大潛力，鐵死亡被視為癌癥治療的有效新途徑。Huang 等[11]的研究表明CuB 通過誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)鐵離子的積累、谷胱甘肽的消耗和廣泛的脂質(zhì)過氧化，下調(diào)GPX4 的表達(dá)等多條途徑引發(fā)了鐵死亡，進(jìn)而發(fā)揮抗癌作用。目前，大量研究證實(shí)了CuB 具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物活性，主要集中在JAK2/STAT3 信號通路[12]、Notch 信號通路[13]和細(xì)胞凋亡等[14]，但CuB 誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡從而發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制尚缺乏研究。

本研究選擇人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116，用于探究CuB 誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制。通過測定不同濃度的CuB 對HCT-116 細(xì)胞毒作用及其對相關(guān)鐵死亡指標(biāo)（細(xì)胞內(nèi)總鐵濃度、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量和乳酸脫氫酶LDH 釋放量）的影響，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、代謝組學(xué)分析、分子對接及分子動力學(xué)模擬來分析其作用機(jī)制。本研究豐富了CuB 用于人結(jié)直腸癌的治療的科學(xué)依據(jù)，同時，也初步闡明了葫蘆素B 誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葫蘆素B（98%）中國麥克林科技有限公司；鐵死亡抑制劑Fer-1（10 mmol/L）美國Med Chemexpressshen 生物科技有限公司；ATP 試劑盒 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116 武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS 胎牛血清、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA（0.05%）美國Gibco 公司；谷胱甘肽（GSH）含量檢測試劑盒、乳酸脫氫酶LDH 細(xì)胞毒性檢測試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司；總鐵離子測試法比色盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

Thermo 371 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SW-CJ-2 型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SpectraMax i3x 型多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；DGL-50B 型高壓蒸汽滅菌鍋、LC-LXHR165A 型高速冷凍離心機(jī)、HH-4 型恒溫水浴鍋 上海力辰儀器科技有限公司；AB420 型分析天平（0.0001 g）三豐精密量儀（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 CuB 儲備液制備 將CuB 溶解在DMSO 中作為原液（10 mmol/L），并在-20 ℃保存。在實(shí)驗前，CuB 原液需要稀釋到所需濃度（CuB 在實(shí)驗中的最終DMSO 濃度應(yīng)低于0.1%，以避免影響細(xì)胞生長）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在37 ℃、5% CO2環(huán)境下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在含10%（v/v）胎牛血清和1%（v/v）青霉素-鏈霉素的DMEM 中培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116，培養(yǎng)基每2 d 更換一次。所有實(shí)驗都使用了10 到20 代的細(xì)胞。當(dāng)無菌培養(yǎng)皿中裝滿細(xì)胞時，繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗。

1.2.3 CuB 對細(xì)胞增殖能力的影響 HCT-116 細(xì)胞活力通過ATP 試劑盒測定。將HCT-116 細(xì)胞（5000 個/孔）接種在96 孔板中，并用不同濃度（0、50、100、150 nmol/L）的CuB 處理24 h。處理后，在室溫下向每孔加入0.1 mL 的ATP 釋放因子，反應(yīng)10 min，然后從第一孔的每孔中吸取0.1 mL 細(xì)胞溶解液到第二孔板的對應(yīng)孔中。第二孔板放置在溫度低于25 °C 的多孔自動熒光檢測器中。向每孔加入20 μL ATP 反應(yīng)溶液，立即檢測10 s 的熒光強(qiáng)度。通過使用GraphPad Pro Prism 5.0 軟件計算IC50值來評估細(xì)胞增殖能力的影響。IC50的計算公式如下：

式中：X 表示劑量或濃度，未轉(zhuǎn)換為對數(shù)，nmol/L；Y 表示歸一化響應(yīng)，從100%下降到0，隨著X 的增加而減少；IC50表示與X 相同的濃度單位，nmol/L；HillSlope 表示坡度系數(shù)。

1.2.4 谷胱甘肽的定量分析 將HCT-116 細(xì)胞（1.5×106個細(xì)胞/皿）接種在6 孔板中，分別用不同濃度（0、50、100 和150 nmol/L）的CuB 處理24 h，然后洗滌并裂解細(xì)胞。按照GSH 試劑盒的說明，對細(xì)胞內(nèi)GSH 含量進(jìn)行測定，測量450 nm 處的吸光度，生成GSH 濃度和樣品數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線以計算GSH 水平。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)總鐵濃度的測定 將HCT-116 細(xì)胞（5×106個細(xì)胞/皿）接種在10 cm 培養(yǎng)皿中，分別用不同濃度（0、50、100 和150 nmol/L）的CuB 處理24 h，處理過程中，觀察細(xì)胞生長情況。處理完成后，用無血清DMEM 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，再用含有Triton X-100 的緩沖液裂解細(xì)胞。根據(jù)制造商的說明，使用鐵測定試劑盒測定細(xì)胞裂解液中的鐵濃度。

1.2.6 LDH 釋放量的測定 將HCT-116 細(xì)胞（5000 個細(xì)胞/孔）接種在96 孔板中，分別用不同的處理方式對HCT-116 細(xì)胞進(jìn)行處理，包括不同濃度CuB（0、50、100 和150 nmol/L）作用以及不同濃度CuB 和鐵死亡抑制劑（0 nmol/L+Fer-1、50 nmol/L+Fer-1、100 nmol/L+Fer-1 和150 nmol/L+Fer-1）共同作用，其中鐵死亡抑制劑的作用終濃度都為10 nmol/L。處理24 h 后，收集來自處理過的細(xì)胞的上清液，并根據(jù)制造商的說明使用LDH 細(xì)胞毒性檢測試劑盒在490 nm 波長下測定LDH 釋放量。

1.2.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過檢索DrugBank[15]、OMIM[16]、GeneCards[17]、PharmGkb[18]和TTD[19]數(shù)據(jù)庫獲得與結(jié)腸癌相關(guān)的靶點(diǎn)，并將獲得的數(shù)據(jù)整合去除重復(fù)以獲得更全面的癌癥相關(guān)靶點(diǎn)。從Pub-Chem 網(wǎng)站獲得葫蘆素B 的分子結(jié)構(gòu)，并保存為.sdf格式[20]。同時，將葫蘆素的.sdf 格式文件導(dǎo)入SWISS Tartget Prediction[21]、BATMAN-TCM[22]、TCMSP[23]和Pharm Mapper[24]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行CuB 靶點(diǎn)的預(yù)測和采集，剔重后獲得CuB 的潛在靶點(diǎn)。隨后，將CuB 靶點(diǎn)與結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入R 語言CuB 抗結(jié)腸癌關(guān)鍵靶點(diǎn)韋恩圖；隨后將獲得的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，使用軟件Cytoscape 3.7.2 繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；將物種設(shè)置為Homo Sapiens，以P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，選取分子功能（MF）、生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）前10 個結(jié)果，繪制GO 富集直方圖；以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，選取10 個有代表性的KEGG 通路繪制KEGG 氣泡圖[25]。

1.2.8 代謝組學(xué)分析 采用標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 進(jìn)行代謝組學(xué)分析[26]。設(shè)置兩組實(shí)驗，包括對照組（0 nmol/L）和處理組（150 nmol/L），每組3 個生物學(xué)重復(fù)，24 h 后收集細(xì)胞，立即用液氮淬滅，用于后續(xù)實(shí)驗。

將-80 ℃冰箱中保存的樣品在冰上解凍。在細(xì)胞樣品中加入500 μL 甲醇水溶液（甲醇:水=4:1，V/V），渦旋3 min。再將樣品置于液氮中快速冷凍5 min，后又取出置于冰上5 min，并于冰上解凍渦旋2 min，如此凍融循環(huán)重復(fù)3 次。樣品以12000 r/min離心10 min（4 ℃）后，取300 μL 上清液，-20 ℃靜置30 min，12000 r/min 離心3 min（4℃）。準(zhǔn)確吸取200 μL 上清液進(jìn)行LC-MS 分析，所有樣品均由LC-MS 系統(tǒng)按照機(jī)器指令采集。

高效液相色譜-質(zhì)譜分析用于分析和鑒定化合物的種類和含量。Aglient 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統(tǒng)使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱，流速為0.4 mL/min、柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。流動相為0.1%甲酸水（流動相A）和含0.1%甲酸的乙腈（B），梯度洗脫程序為：0～11 min，5%～90% B；11～12 min，90% B；12～12.1 min，90%～5% B；12.1～14 min，5% B。Aglient QTOF/MS-6550 質(zhì)譜檢測器，電噴霧離子源（ESI），分別采用正負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為2.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為-1.50 kV，輔氣流速為8 L/min，鞘氣流速為11 L/min，碎裂電壓為135 V，霧化氣電壓為40 V，離子源溫度為325 ℃。原始數(shù)據(jù)經(jīng)格式轉(zhuǎn)換、峰提取、對齊、保留校正時間和峰面積校正后進(jìn)行過濾，再進(jìn)行代謝物鑒定。

利用R 語言中的MetaboAnalyst 包（v1.0.1）建立正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal 偏最小二乘Discriminant Analysis，OPLS-DA）模型，從中獲得預(yù)測變量重要性（VIP）值，P值由Student'st檢驗生成。VIP 值>1，P<0.05 的代謝物被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義，標(biāo)記為差異累積代謝物（differences cumulative Metabolites，DAMs），選擇P<0.05 的通路進(jìn)行分析。

1.2.9 分子對接 本次對接研究使用Maestro 11.9 程序預(yù)測SLC7A11、GPX4 與CuB 可能的結(jié)合行為[27]。GPX4 和SLC7A11 的三維結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲取并保存為.sdf 格式，CuB 的結(jié)構(gòu)從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5281316）獲得。除去所有的水分子，在對接研究實(shí)驗開始時加入極性氫。對接完成后，采用對接得分最高的模型進(jìn)行進(jìn)一步分析，一般認(rèn)為結(jié)合能越低越穩(wěn)定，得分也越高。

1.2.10 分子動力學(xué)模擬 用GROMACS 軟件包進(jìn)行分子動力學(xué)模擬實(shí)驗，選擇CHARMM36 立場進(jìn)行后續(xù)模擬[28]。然后，將分子對接結(jié)果中的最佳結(jié)構(gòu)導(dǎo)入GROMACS，通過GROMACS 自帶的預(yù)處理工具pdb2gmx 為蛋白質(zhì)分配原子類型和電荷，并生成拓?fù)湮募?。接下來，使用GROMACS 中的editconf 和genbox 工具調(diào)整模擬盒子的大小，將蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物置于模擬盒子的中心，并添加適當(dāng)數(shù)量的溶劑分子（TIP3P 水模型）。為了模擬生物體內(nèi)的條件，在模擬盒子中添加適當(dāng)濃度的鹽離子（Na+和Cl-），使用GROMACS 中的genion 工具替換部分溶劑分子以中和系統(tǒng)的總電荷。在系統(tǒng)準(zhǔn)備完成后，進(jìn)行能量最小化操作以消除系統(tǒng)中的不良接觸和高能構(gòu)象。能量最小化完成后，對模擬系統(tǒng)進(jìn)行短時間的NVT（恒容恒溫）和NPT（恒壓恒溫）平衡模擬，以使系統(tǒng)達(dá)到恒溫和恒壓條件。在NVT 平衡模擬中，使用Berendsen 溫度耦合方法將系統(tǒng)加熱至目標(biāo)溫度（310 K），并將其保持在該溫度。接下來，在NPT 平衡模擬中，使用Berendsen 壓力耦合方法將系統(tǒng)的壓力調(diào)整至目標(biāo)壓力（1 bar）。在完成NVT和NPT 平衡模擬之后，對模擬系統(tǒng)進(jìn)行100 ns 的生產(chǎn)模擬，以收集足夠的軌跡數(shù)據(jù)。在生產(chǎn)模擬過程中，使用Nosé-Hoover 溫度耦合方法和Parrinello-Rahman 壓力耦合方法來分別維持系統(tǒng)的溫度和壓力。此外，定期保存系統(tǒng)的原子坐標(biāo)信息（每10 ps保存一次），以便于后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究實(shí)驗數(shù)據(jù)均表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，每項實(shí)驗至少進(jìn)行過三次獨(dú)立生物學(xué)實(shí)驗，以確保結(jié)果的穩(wěn)定性。實(shí)驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行處理和分析，Student'st檢驗和方差分析（ANOVA）被用于統(tǒng)計比較，以評估實(shí)驗組與對照組之間的差異，P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CuB 對HCT-116 細(xì)胞系增殖的影響

為了研究CuB 是否有抗結(jié)腸癌作用，通過ATP法檢測經(jīng)CuB 處理24 h 后人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116 的細(xì)胞活性。如圖1 所示，CuB 可以抑制HCT-116 的增殖，其半抑制濃度（IC50）為64.48 nmol/L，結(jié)果表明CuB 具有較強(qiáng)的抗結(jié)腸癌作用。

圖1 CuB 對結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116 的影響Fig.1 Effects of CuB on colon cancer cell line HCT116

2.2 CuB 誘導(dǎo)HCT-116 細(xì)胞鐵死亡

細(xì)胞內(nèi)GSH 水平降低會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，這也是鐵死亡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素。細(xì)胞GSH 依賴性抗氧化劑的失活會促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物的積累，并進(jìn)一步引發(fā)鐵死亡[29]。如圖2a 所示，隨著CuB作用濃度增加，細(xì)胞內(nèi)GSH 含量呈現(xiàn)出劑量依賴性下降，在CuB 的濃度為100 mmol/L 時，HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著下降（P<0.01）。這表明CuB 處理可以減少HCT-116 細(xì)胞內(nèi)的GSH 含量，進(jìn)而可能削弱細(xì)胞的抗氧化能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的積累。

鐵在線粒體呼吸鏈中發(fā)揮著重要作用，并在鐵死亡過程中扮演關(guān)鍵角色[30]。為了深入探討CuB 誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制，對CuB 處理后的細(xì)胞內(nèi)鐵濃度進(jìn)行檢測。如圖2b 所示，隨著CuB 作用濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)鐵濃度明顯升高。這一發(fā)現(xiàn)意味著鐵離子濃度的提高可能增加細(xì)胞對鐵死亡的敏感性。鐵離子水平的上升可能會影響線粒體呼吸鏈的正常功能，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加，最終促使鐵死亡的發(fā)生[31]。

此外，本研究還檢測了乳酸脫氫酶（LDH）的釋放情況。LDH 是一種細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時，LDH 會從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，因此LDH 釋放通常被用作評估細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞死亡的指標(biāo)[32]。如圖2c 所示，觀察到LDH 釋放隨CuB 濃度的增加而顯著（P<0.05）升高。這表明CuB 處理可能導(dǎo)致細(xì)胞膜受損和細(xì)胞死亡。為了進(jìn)一步證實(shí)CuB 誘導(dǎo)的HCT-116 細(xì)胞死亡是否與鐵死亡有關(guān)，采用了鐵死亡抑制劑Fer-1 進(jìn)行驗證實(shí)驗。比較了無Fer-1 作用和有Fer-1 作用的兩組細(xì)胞在不同濃度CuB 下的LDH 釋放情況，與無Fer-1 作用組相比，F(xiàn)er-1 作用組在CuB 作用濃度為100 nmol/L 時能顯著（P<0.05）降低細(xì)胞LDH 的釋放。這一結(jié)果表明，鐵死亡抑制劑Fer-1 能夠有效抑制CuB 誘導(dǎo)引起的細(xì)胞膜受損和細(xì)胞死亡。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析

為了挖掘CuB 的潛在作用靶點(diǎn)和信號通路，本研究進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。通過整合公共數(shù)據(jù)庫中的信息，發(fā)現(xiàn)CuB 有276 個潛在靶標(biāo)和1865 個與結(jié)腸癌相關(guān)的基因。這些靶標(biāo)和基因的交集通過韋恩圖（圖3a）展示。利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建CuB 與結(jié)腸癌靶點(diǎn)的交集蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape 軟件篩選核心靶點(diǎn)。如圖3b 所示，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)了許多重要節(jié)點(diǎn)，如STAT3、EGFR、PIK3R1 等。這些靶點(diǎn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療中扮演著重要角色。

圖3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果Fig.3 Results of network pharmacology

R 語言用于GO 通路和KEGG 通路的富集與篩選。圖3c 氣泡圖顯示了P值低于0.05 的前10 條BP、CC 和MF 通路。這些通路主要涉及細(xì)胞氧化還原平衡、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝等過程。此外，通過KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)130 個差異代謝物映射到了159 個KEGG 通路中，前30 條KEGGE 通路如圖3d 所示，值得注意的是，一些KEGG 通路與鐵死亡高度相關(guān)，如PI3K-Akt 信號通路[33]、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化[34]以及MAPK 信號通路[35]。

2.4 代謝組學(xué)結(jié)果分析

為了進(jìn)一步探究CuB 誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制，本文采用代謝組學(xué)分析作深入研究。通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交投影偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）評分圖驗證實(shí)驗結(jié)果的可靠性[36-37]。PCA 是一種無監(jiān)督的多維統(tǒng)計分析方法，對鑒定到的代謝物進(jìn)行PCA 分析，可以從總體上反映樣本組間和組內(nèi)的變異度?？瞻滋幚斫M與CuB 處理組在正負(fù)離子模式下的PCA 得分圖如圖4a 所示。圖中PC1 表示第一主成分，PC2 表示第二主成分，圖中的每個點(diǎn)表示一個樣本，同一個組的樣本使用同一種顏色表示，Group 為分組。從而直觀地觀察到不同處理組間樣本的差異以及同一組內(nèi)樣本的分布趨勢，同一組間的樣本聚集度高，說明樣品的重復(fù)性好。由圖4a 可知，空白處理組和CuB 處理組兩組之間的樣本有明顯的區(qū)分，說明CuB 處理明顯引起HCT-116 細(xì)胞中代謝物的變化，且這一變化在3 個重復(fù)組中穩(wěn)定存在。

圖4 代謝組學(xué)結(jié)果可靠性分析Fig.4 Reliability analysis of metabolomics results

進(jìn)一步采用有監(jiān)督且修正的判別分析統(tǒng)計方法正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Leastsquares Discrimination Analysis，OPLS-DA）進(jìn)行組間、組內(nèi)樣本主成分分析，得分圖如圖4b 所示。圖4b 中體現(xiàn)的信息與PCA 得分圖中相似，圖中空白處理組和CuB 處理組樣本明顯分離，即CuB 處理引起HCT-116 細(xì)胞中代謝物發(fā)生顯著變化；縱坐標(biāo)上則反映了組內(nèi)的變異，可以觀察到空白處理組與CuB 處理組間樣本相對聚集，生物學(xué)重復(fù)較好。

OPLS-DA 模型中得到的變量權(quán)重值（Variable Importance for the Projection，VIP）能夠用于挖掘具有生物學(xué)意義的差異代謝物，通常認(rèn)為VIP>1 的差異代謝物在模型中具有顯著貢獻(xiàn)。本實(shí)驗以VIP>1和P<0.05 為篩選顯著差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到130 種顯著差異代謝物，其中上調(diào)的顯著差異代謝物有39 種，下調(diào)的顯著差異代謝物有91 種。正負(fù)離部分差異代謝物如表1 所示。圖5a 為各分組比較中差異倍數(shù)前20 代謝物表達(dá)的倍數(shù)變化結(jié)果展示，橫坐標(biāo)為差異代謝物的log2FC，即差異代謝物的差異倍數(shù)以2 為底取對數(shù)的值，縱坐標(biāo)為差異代謝物。紅色代表代謝物含量上調(diào)，綠色代表代謝物含量下調(diào)。圖5a 可以觀察到CuB 處理后顯著下調(diào)的差異代謝物明顯多于上調(diào)的差異代謝物，推測CuB 可能下調(diào)HCT-116 細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝。

表1 差異代謝物篩選結(jié)果Table 1 Screening results of differential metabolites

圖5 代謝組學(xué)結(jié)果Fig.5 Results of the metabolomics

圖5b 展示了對照組和實(shí)驗組差異代謝物的上調(diào)和下調(diào)分布。圖5c 以氣泡圖形式展現(xiàn)KEGG 富集分析的結(jié)果，選擇最顯著富集的前20 條通路進(jìn)行繪圖，結(jié)果如圖5c 所示通路主要富集在脂肪細(xì)胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)、鐵死亡、谷胱甘肽代謝等。這些結(jié)果表明，CuB 對結(jié)腸癌代謝產(chǎn)生了顯著影響，可能涉及到鐵死亡通路的調(diào)節(jié)。

2.5 分子對接結(jié)果分析

分子對接技術(shù)作為一種計算化學(xué)方法，可以預(yù)測分子間的相互作用，它可以為深入了解藥物與靶蛋白之間的結(jié)合模式提供依據(jù)。為了進(jìn)一步探討CuB抑制HCT-116 結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制，特別是與鐵死亡相關(guān)的信號通路，本研究選擇了鐵死亡信號通路中的兩個關(guān)鍵蛋白GPX4 和SLC7A11 作為分子對接分析的對象。

如圖6a 所示，CuB 分別可以與SLC7A11 蛋白中Tyr251，Leu252，Ile134，Arg135，Arg340，Thr56的6 個氨基酸形成了6 個氫鍵，與Tyr251，Arg135，Thr56 這3 個氨基酸形成4 個疏水相互作用。如圖6b 所示，CuB 與GPX4 蛋白中的氨基酸Gly79 形成1 個氫鍵。分子對接結(jié)果如表2 顯示，CuB 可能通過與鐵死亡信號通路中的關(guān)鍵蛋白GPX4 和SLC7A11 相互作用來抑制HCT-116 細(xì)胞的增殖，其中CuB 與蛋白SLC7A11 和GPX4 的對接得分分別為-4.819 和-3.833，結(jié)合能分別為-43.34 kcal/mol 和-47.43 kcal/mol，表明CuB 可與SLC7A11 和GPX4蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)合。

表2 CuB 與蛋白質(zhì)分子對接評分Table 2 Scores of the docking between CuB and protein

圖6 分子對接結(jié)果Fig.6 Results of the molecular docking

通過對分子對接結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)CuB 與SLC7A11 結(jié)合的氫鍵主要涉及到SLC7A11 蛋白的若干關(guān)鍵氨基酸殘基。這些氨基酸在SLC7A11 蛋白的功能和穩(wěn)定性中起著重要作用，CuB 與其結(jié)合可能會影響SLC7A11 的正常功能，從而導(dǎo)致鐵死亡信號通路的改變。與此同時，CuB 與GPX4 結(jié)合的模式也顯示了相互作用的存在，但結(jié)合強(qiáng)度較弱，表明CuB 對GPX4 的作用可能較為有限。

2.6 分子動力學(xué)模擬結(jié)果分析

在分子對接過程中發(fā)現(xiàn)SLC7A11 與CuB 的得分更高。因此本研究選擇對SLC7A11 進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。

將SLC7A11 與CuB 進(jìn)行100 ns 的分子動力學(xué)模擬。模擬結(jié)果顯示，體系在50 ns 內(nèi)達(dá)到了平衡。為了進(jìn)一步評估模擬過程中蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的穩(wěn)定性，對模擬過程中的RMSD 圖、RMSF 圖、蛋白回轉(zhuǎn)半徑（Rg）變化趨勢圖和自由能形貌圖等指標(biāo)進(jìn)行分析。

首先，計算模擬過程中蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的RMSD 值，以評估其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。RMSD（Root Mean Square Deviation）是一種描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在模擬過程中穩(wěn)定性的指標(biāo)。如圖7a 所示，在50 ns 時，體系達(dá)到平衡，穩(wěn)定在0.5 nm。這表明CuB 與SLC7A11 的結(jié)合在模擬過程中具有較好的穩(wěn)定性。

圖7 模擬體系的RMSD 及RMSF 結(jié)果Fig.7 RMSD and RMSF results of simulation systems

隨后，計算模擬過程中蛋白質(zhì)各殘基的RMSF值，以評估其在模擬過程中的波動情況。RMSF（Root Mean Square Fluctuation）是一種描述蛋白質(zhì)各個殘基在模擬過程中波動情況的指標(biāo)。如圖7b所示，在殘基數(shù)量為200 和450 左右出現(xiàn)較大波動，表明這些區(qū)域的結(jié)構(gòu)可能較為靈活，暗示這些區(qū)域可能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵部位。

此外，分析模擬過程中蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑（Rg）變化趨勢，以評估蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的緊密程度。結(jié)果如圖8a 所示，在50 ns 時，Rg 值達(dá)到2.24 nm 并保持穩(wěn)定，說明CuB 與SLC7A11 的結(jié)合在模擬過程中結(jié)構(gòu)緊湊。蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑（Rg）是一個描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密程度的指標(biāo)，通過觀察Rg 值的變化趨勢可以更好地了解蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的穩(wěn)定性。

圖8 分子動力學(xué)模擬結(jié)果Fig.8 Results of molecular dynamics simulation

為了對模擬過程中的體系進(jìn)行更全面的評估，對溶劑的可及表面積（SASA）進(jìn)行分析。結(jié)果如圖8b 所示，SASA 圖可以用于描述蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物在模擬過程中的溶劑暴露程度。在50 ns 時，SASA 基本達(dá)到平衡，表明CuB 與SLC7A11 的結(jié)合在模擬過程中與溶劑的相互作用較為穩(wěn)定。

接下來，計算模擬過程中體系的總勢能變化曲線?？倓菽茏兓€可以用于評估體系在模擬過程中的能量穩(wěn)定性。結(jié)果如圖8c 所示，體系能量一直在-740000 kJ/mol 附近，表明CuB 與SLC7A11 結(jié)合在模擬過程中具有較好的能量穩(wěn)定性。

最后，計算了模擬過程中體系的自由能形貌，以評估各個狀態(tài)的穩(wěn)定性。自由能形貌可描述體系中各個狀態(tài)穩(wěn)定性。如圖8d 所示，在Rg 為2.24 nm，RMSD 為0.5 nm 時，自由能最低，與之前的RMSD和Rg 達(dá)到穩(wěn)定的結(jié)果保持一致。這進(jìn)一步證實(shí)了CuB 與SLC7A11 結(jié)合在模擬過程中具有較好的穩(wěn)定性。

綜上所述，通過對SLC7A11 與CuB 進(jìn)行分子動力學(xué)模擬及其相關(guān)指標(biāo)的分析，發(fā)現(xiàn)CuB 與SLC7A11 的結(jié)合具有較好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、波動性以及能量穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

CuB 已經(jīng)被證明可以經(jīng)由多種信號通路發(fā)揮抑制多種類型癌癥的作用，如非小細(xì)胞肺癌[38]、結(jié)直腸癌[39]、前列腺癌[40]、乳腺癌[41]等。目前，已證實(shí)葫蘆素B 具有抑制結(jié)直腸癌的作用，而大多數(shù)研究都集中在細(xì)胞凋亡。相比之下，對于葫蘆素B 在鐵死亡誘導(dǎo)效應(yīng)方面的研究報道較少，其中CuB 誘發(fā)鐵死亡發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的研究尚無報道。因此，本文通過測定不同濃度的CuB 對HCT-116 細(xì)胞的毒作用及相關(guān)鐵死亡指標(biāo)初步明確了CuB 介導(dǎo)鐵死亡發(fā)揮的結(jié)直腸癌抑制作用，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析、代謝組學(xué)分析、分子對接技術(shù)和分子動力學(xué)模擬技術(shù)，進(jìn)一步研究了CuB 對人結(jié)腸癌細(xì)胞作用背后的鐵死亡作用機(jī)制。

在本研究中，首先使用ATP 法測定檢測了CuB對HCT-116 細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示CuB 能夠抑制HCT-116 細(xì)胞的生長，其IC50值為64.48 nmol/L。隨后，通過總鐵離子濃度、GSH 含量、加或不加鐵死亡抑制劑Fer-1 后的LDH 釋放實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)CuB 能夠顯著影響HCT-116 細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度、GSH 含量和LDH 水平。CuB 處理后，細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度以劑量依賴性方式增加，GSH 含量顯著（P<0.05）降低。當(dāng)加入鐵死亡抑制劑Fer-1 后，LDH 釋放水平明顯下降。這些實(shí)驗結(jié)果支持了CuB 通過誘導(dǎo)鐵死亡來抑制HCT-116 細(xì)胞增殖的假設(shè)，這些結(jié)果表明CuB 具有誘導(dǎo)HCT-116 鐵死亡的潛力。

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得CuB 的276 個關(guān)鍵靶點(diǎn)，并且基于CuB的靶點(diǎn)和結(jié)腸癌靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖篩選，發(fā)現(xiàn)STAT3、EGFR、PIK3R1 等關(guān)鍵靶點(diǎn)?；贕O 和KEGG 富集分析結(jié)果，推測鐵死亡可能參與了CuB誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程，CuB 可能通過靶向作用這些關(guān)鍵靶點(diǎn)的方式，引發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)鐵的釋放和蓄積，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵離子超載，從而引起鐵死亡。另外，CuB 可能通過抑制EGFR、JAK2、JAK3 等靶點(diǎn)的信號通路，降低細(xì)胞內(nèi)GSH 含量，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡。此外，CuB 還可能通過激活STAT3、PIK3R1 等靶點(diǎn)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和鐵離子釋放，從而增加細(xì)胞內(nèi)鐵含量，最終導(dǎo)致鐵死亡。代謝組學(xué)分析則揭示了CuB 對結(jié)腸癌細(xì)胞的代謝影響。KEGG通路的富集結(jié)果進(jìn)一步聚焦于谷胱甘肽代謝與鐵死亡，與本文中CuB 顯著（P<0.05）降低HCT-116 細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量、鐵死亡抑制劑Fer-1 逆轉(zhuǎn)由CuB 誘發(fā)LDH 釋放分子而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡相一致。胱氨酸/谷氨酸抗轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11 可以導(dǎo)入胱氨酸進(jìn)行谷胱甘肽生物合成和抗氧化防御，并在多種人類癌癥中過度表達(dá)[42]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與代謝組學(xué)的結(jié)果都將CuB 抑制HCT-116 結(jié)腸癌的作用指向與鐵死亡關(guān)系緊密的谷胱甘肽代謝途徑，由此本研究通過分子對接探究了CuB 與谷胱甘肽代謝途徑中關(guān)鍵蛋白SLC7A11 和GPX4 的結(jié)合情況，分析發(fā)現(xiàn)SLC7A11 蛋白能與CuB 結(jié)合，并且有較低的結(jié)合能。進(jìn)而繼續(xù)采用分子動力學(xué)模擬分析進(jìn)一步證實(shí)了CuB 能與SLC7A11穩(wěn)定結(jié)合。

總之，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、代謝組學(xué)、分子對接和分子動力學(xué)模擬等多種手段，對CuB 誘導(dǎo)鐵死亡抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 增殖的機(jī)制進(jìn)行了深入研究。這些實(shí)驗結(jié)果揭示了CuB 在結(jié)腸癌治療中的潛在作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療提供了新的思路。同時也為后續(xù)研究提供了理論依據(jù)和方向，以期為結(jié)腸癌的治療提供更多的選擇。

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