酶解-動態(tài)高壓微射流制備納米淀粉及對其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

黃佳卉，趙 雷，朱 杰，張書艷

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.東莞理工學(xué)院生命健康技術(shù)學(xué)院，東莞市特色食品精準(zhǔn)設(shè)計重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國輕工業(yè)健康食品開發(fā)與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808）

蠟質(zhì)玉米淀粉（Waxy Maize Starch，WMS）產(chǎn)量豐富、價格低廉，具有較高的膨脹度、透明度、粘度和穩(wěn)定性，是現(xiàn)代食品工業(yè)的重要原料，也是生產(chǎn)變性淀粉的優(yōu)質(zhì)原料[1]。納米淀粉是由原淀粉通過物理、化學(xué)、生物等方法制備而成的一種具有粒徑小、比表面積大、生物相容性好等優(yōu)良特性的淀粉顆粒，在食品、生物、包裝等領(lǐng)域均有較廣泛應(yīng)用[2-3]。目前制備納米淀粉的主要化學(xué)方法包括酸水解法、化學(xué)沉淀法等，此類方法具有良好的可控性，但需要引入化學(xué)試劑且反應(yīng)耗時較長[3-4]；物理方法包括超聲波法、螺桿擠壓法等，此類方法具有耗時短、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，但其制備的樣品較難控制粒徑及均勻度[5-6]。

動態(tài)高壓微射流技術(shù)（Dynamic High Pressure Microfluidization，DHPM）是一種可連續(xù)化作業(yè)的新興均質(zhì)手段，可在短時間內(nèi)同步實(shí)現(xiàn)料液的輸送、混合、超微粉碎、加壓、均質(zhì)等一系列操作[7-9]。在瞬時壓力的推動下，流動的混合物料在相互作用腔內(nèi)受到強(qiáng)烈撞擊、高頻剪切、高速振蕩和氣穴爆炸等一系列綜合作用力達(dá)到剪切破碎、碰撞破碎或聚結(jié)的效果[10]，基于高壓微流射技術(shù)處理淀粉，可實(shí)現(xiàn)對其結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)的調(diào)控。有研究表明，通過動態(tài)超高壓微射流技術(shù)使淀粉顆粒均勻分散在水中，形成的納米顆粒可轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定凝膠，與傳統(tǒng)的均質(zhì)方法相比，動態(tài)超高壓微射流制備的樣品細(xì)碎度更高，穩(wěn)定性更好[5,11]。淀粉顆粒在物理破碎下引起大小、形貌和均勻度的改變，淀粉的分子結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)如分散性、溶解度、糊化性質(zhì)和化學(xué)活性等相應(yīng)發(fā)生變化。然而，利用高壓微射流技術(shù)直接處理蠟質(zhì)玉米淀粉制備納米淀粉顆粒時，易使腔體堵塞，且樣品穩(wěn)定性較差，阻礙其進(jìn)一步應(yīng)用[11-12]，普魯蘭酶（普魯蘭1,6-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.41），是淀粉加工中一種重要的脫支酶，與異淀粉酶相比，其能切下支鏈淀粉和其它相關(guān)多聚糖的α-1,6 糖苷鍵，形成短直鏈淀粉，但酶的成本高、且酶解過度會促使淀粉水解，無法得到預(yù)期的淀粉納米粒子。因此，本文利用酶解-高壓微射流技術(shù)聯(lián)合制備蠟質(zhì)玉米納米淀粉，以期得到均相且粒徑可控的淀粉納米粒子體系，同時探討淀粉多尺度結(jié)構(gòu)、粒徑和熱學(xué)性能的變化，為蠟質(zhì)玉米納米淀粉乳液的制備及其在活性包裝材料中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟質(zhì)玉米淀粉（直鏈淀粉含量為0.67%±0.07%）東莞東美食品有限公司；普魯蘭酶（2000 U/g）、溴化鋰（分析純）、二甲基亞砜（色譜純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溴化鋰 分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司。

MR Hei-Tec（CN）型磁力攪拌器 德國Heidolph 公司；M-110EH-30 型高壓微射流均質(zhì)機(jī) 美國MFIC 公司；SCIENTZ-18 N 型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；EM-30 PLUS+型掃描電子顯微鏡 韓國COXEM 公司；DX-27mini 型X-射線衍射儀 遼寧丹東浩元儀器有限公司；Spectrum Two 型傅立葉紅外光譜儀 美國PE 公司；LS13 320 型激光粒度儀 貝克曼庫爾特有限公司；Eclipse DualTec 型分子排阻色譜-多角度激光光散射聯(lián)用儀美國WYATT 公司；DSC3 型差示掃描量熱儀梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解淀粉的制備 稱取三份50 g 蠟質(zhì)玉米淀粉（WMS），分別置于500 mL 去離子水中，于100 ℃下攪拌30 min，使原淀粉糊化完全，攪拌速率為500 r/min。待WMS 淀粉糊溫度降低至50 ℃，加入添加量均為6 U/g（以淀粉干基計算）的普魯蘭酶，并將其置于50 ℃水浴鍋中進(jìn)行酶解，酶解時間分別為0.5、1、2 h，酶解之后將三種酶解淀粉置于100 ℃水浴鍋中進(jìn)行滅活，滅活時間為30 min，待其降至室溫后得到酶解淀粉并將部分樣品進(jìn)行冷凍干燥保存（樣品分別記為E-0.5、E-1、E-2）。

1.2.2 納米淀粉的制備 分別稱取2 g 不同酶解時間的淀粉置于200 mL 去離子水中，充分分散后經(jīng)動態(tài)超高壓微射流處理，壓力為10000 PSI，循環(huán)次數(shù)為1 次，將處理后的淀粉乳液冷凍干燥后得到納米淀粉（樣品分別記為E-0.5-N、E-1-N、E-2-N）。

1.2.3 微觀形貌觀察 將原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉樣品分散在貼有導(dǎo)電雙面膠的掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）樣品臺上，并用洗耳球輕吹樣品使其單層平鋪樣品臺表面，樣品經(jīng)過離子濺射噴金40 s，電壓為5 kV，后于SEM 中觀察不同放大倍數(shù)下的淀粉顆粒形貌。

1.2.4 結(jié)晶結(jié)構(gòu)測定 分別取原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉置于樣品槽內(nèi)，將樣品表面壓平放入X-射線衍射儀中，X-射線為Cu-Kα射線（λ=0.15 nm），30 kV×15 m A），測量范圍為10°～40°，步長0.02，掃描速度0.1°/s，每個樣品測三次，經(jīng)Jade 6.0 軟件計算樣品的相對結(jié)晶度。

1.2.5 分子結(jié)構(gòu)測定 分別將1 mg 原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉分別與150 mg 溴化鉀混合，充分研磨使二者混合均勻，取適量進(jìn)行壓片處理并用紅外光譜儀進(jìn)行測定，每個樣品平行測定三次，得到傅里葉紅外（Fourier Transform Infrared，F(xiàn)T-IR）圖譜。

1.2.6 粒徑測定 用一次性滴管吸取原淀粉逐滴加入到激光粒度儀的進(jìn)樣口中，待其PIDS 檢測器值達(dá)到40%，開始測量淀粉樣品粒徑，每個樣品平行測定三次。

1.2.7 分子量分布測定 分別稱取4 mg 原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉，將三種淀粉分別用4 mL 二甲基亞砜（DMSO，含溴化鋰（0.5% w/w））進(jìn)行混合，后將溶液置于80 ℃的水浴搖床中過夜，使其充分溶解，待溶液冷卻至25 ℃，利用0.45 μm過濾膜過濾，備用。使用分子排阻色譜測定淀粉的分子量分布，測定過程中洗脫液為含0.5%（w/w）溴化鋰的DMSO，柱溫80 ℃，流速為0.5 mL/min，每個樣品平行測定三次。

1.2.8 熱學(xué)性能測定 分別準(zhǔn)確稱取4 mg 原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉，置于差式掃描量熱儀（Differential Scanning Calorimetry，DSC）專用的鋁坩堝中，加入12 μL 蒸餾水，然后將鋁坩堝密封，于室溫下平衡12 h，同時以空盤作為空白對照。樣品測定溫度為30～120 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)饬魉?0 mL/min。利用DSC 熱譜圖計算起始溫度、峰值溫度、結(jié)束溫度（分別為To、Tp和Tc）以及焓值（ΔH），每個樣品平行測定三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行測定，所得數(shù)據(jù)均利用SPSS 軟件（24.0 版）進(jìn)行方差分析，通過鄧肯多重檢驗(yàn)來表示組間顯著性差異（P<0.05），結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)通過Origin 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微觀形貌觀察

圖1 為不同酶解時長以及進(jìn)一步高壓微射流處理后淀粉經(jīng)冷凍干燥處理后的形貌。由圖1a 所示，原淀粉為圓形或多角形、表面光滑、無氣孔[13]，酶的加入使淀粉顆粒形貌發(fā)生明顯變化，變成無規(guī)則的碎片顆粒（圖1b～圖1d），且隨著酶解時間的延長，酶解淀粉形態(tài)明顯變小且出現(xiàn)更多碎片。該現(xiàn)象可能是糊化引起顆粒的膨脹，從而導(dǎo)致顆粒結(jié)構(gòu)的破壞。

圖1 不同處理?xiàng)l件WMS 的微觀形貌圖Fig.1 SEM of WMS under different treatment conditions

酶解淀粉進(jìn)一步經(jīng)微射流處理后，微射流劇烈的沖擊力使大顆粒破碎成塊狀顆粒，顆粒的比表面積增大，淀粉的形狀發(fā)生改變，且淀粉原本光滑的表面變得粗糙，淀粉顆粒進(jìn)一步被破壞[10,14-15]。納米淀粉的形貌分析證實(shí)了微射流的高壓作用使淀粉顆粒變得更加細(xì)小，并且出現(xiàn)明顯的層狀條帶（圖1e～圖1g）。

2.2 結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

圖2 為不同酶解時長以及進(jìn)一步高壓微射流處理后淀粉的XRD 衍射圖譜。如圖2 所示，原淀粉在2θ為15.01°、17.00°、18.03°、23.08°處有強(qiáng)的衍射峰，為典型的A 型結(jié)晶。原淀粉經(jīng)過糊化處理后，當(dāng)酶解時間為0.5 h 時，結(jié)晶度從66.21%下降到3.04%，隨著酶解時間的進(jìn)一步增加，淀粉呈彌散衍射特征，表明結(jié)晶結(jié)構(gòu)消失[1]。研究表明，當(dāng)?shù)矸劢?jīng)普魯蘭酶水解后，淀粉分子中晶態(tài)和非晶態(tài)結(jié)構(gòu)中氫鍵作用均被破壞[16-18]。

圖2 不同處理?xiàng)l件WMS 的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffractions of WMS under different treatment conditions

進(jìn)一步經(jīng)微射流處理后，淀粉整體仍呈現(xiàn)彌散衍射峰，未有明顯變化，表明酶解淀粉經(jīng)微射流處理后繼續(xù)呈現(xiàn)無定型態(tài)。經(jīng)微射流制備得到的納米淀粉衍射圖譜與酶解淀粉相比變化不大。有研究表明，原淀粉經(jīng)過微射流處理后，X-射線衍射圖譜呈現(xiàn)彌散衍射狀態(tài)，可能是因?yàn)榈矸劢Y(jié)晶有序程度降低或是淀粉顆粒尺寸減小引起的結(jié)晶過小[19]。本實(shí)驗(yàn)中酶解使淀粉結(jié)晶被顯著破壞，且酶解時間越長結(jié)晶結(jié)構(gòu)破壞越顯著，同時高壓微射流處理并沒有對淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)進(jìn)一步產(chǎn)生明顯的影響。

2.3 分子結(jié)構(gòu)分析

圖3 為不同酶解時長以及進(jìn)一步高壓微射流處理后淀粉的紅外光譜圖。如圖3 所示，3300 cm-1處為O-H 伸縮振動和羥基氫鍵締合后的特征吸收峰[1,20]，2930 cm-1處左右為C-H 的伸縮振動，1640 cm-1為C=O 伸縮振動，經(jīng)酶解和微射流處理后，該處波長發(fā)生紅移，可能是因?yàn)槲⑸淞魈幚硪欢ǔ潭壬鲜沟矸鄣墓δ芑鶊F(tuán)發(fā)生變化；也有報道稱1640 cm-1處的峰強(qiáng)和峰位置與淀粉顆粒中結(jié)合水的能力有關(guān)[21]。由圖3可知，經(jīng)酶解處理后，1047 和1018 cm-1處的峰條帶變寬甚至消失，這可能與酶解淀粉的長程有序性（結(jié)晶度）降低有關(guān)[22]。該現(xiàn)象可能是糊化引起顆粒的膨脹，從而導(dǎo)致顆粒結(jié)構(gòu)的破壞。經(jīng)微射流處理后，1047 cm-1處的峰完全消失，該現(xiàn)象是由微射流過程中高壓、高剪切力、湍流力和空化作用導(dǎo)致納米淀粉從有序變?yōu)闊o序構(gòu)象[12]。1040 cm-1為無水葡萄糖環(huán)C-O 拉伸振動特征峰，990 cm-1左右為O-H 彎曲振動吸收峰[23]。對比可知，經(jīng)酶解后，淀粉中的葡萄糖環(huán)C-O 拉伸振動吸收峰向1020 cm-1進(jìn)行藍(lán)移，可能是因?yàn)樵诿附膺^程中α-1,6-糖苷鍵被水解并產(chǎn)生羥基，形成氫鍵。另外，圖3 中所有樣品均沒有出現(xiàn)新的紅外吸收峰，表明酶解淀粉和納米顆粒并沒有產(chǎn)生新的化學(xué)鍵。

圖3 不同處理?xiàng)l件WMS 的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrum of WMS under different treatment conditions

通過去卷積處理后將透射率轉(zhuǎn)換為吸光度，1047 和1022 cm-1處的吸光度比值R 可表征淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)[15,24]。根據(jù)表1 可知，酶解淀粉和納米淀粉的R 值都高于原淀粉，說明經(jīng)過處理后，分子短程有序性增強(qiáng)[18]，這是由于酶解后淀粉鏈間氫鍵數(shù)目增加或淀粉中多尺度聚集結(jié)構(gòu)進(jìn)行了重排所致的[25]。另外，酶解淀粉經(jīng)微射流處理后R 值降低，可能是微射流的高壓作用影響淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)，使R 值略微降低。

表1 不同處理?xiàng)l件WMS 的R 值Table 1 R value of WMS under different treatment conditions

2.4 粒徑分布

由表2 可知，與原淀粉相比，當(dāng)酶解時間為0.5 h時，淀粉粒徑顯著增大（P<0.01），這是由于淀粉在糊化的過程中氫鍵作用促使淀粉分子與水分子發(fā)生強(qiáng)烈的水合作用，使淀粉鏈不斷展開，導(dǎo)致顆粒逐漸膨脹，體積增大[2,26]。當(dāng)酶解時間為1 h 時，粒徑顯著減小（P<0.05），可能是淀粉顆粒的溶脹促進(jìn)了普魯蘭酶與淀粉分子間的接觸，普魯蘭酶分子與淀粉分子結(jié)合后催化糖苷鍵裂解，促使淀粉粒徑降低；隨著酶解時間增加到2 h，支鏈淀粉進(jìn)一步被裂解，線性直鏈淀粉分子的纏繞作用促使淀粉粒徑增大[17,27]。

表2 不同處理?xiàng)l件WMS 的粒徑Table 2 Particle size of WMS under different treatment conditions

與原淀粉和酶解淀粉相比，不同酶解時間的蠟質(zhì)玉米淀粉經(jīng)微射流處理后，淀粉粒徑均顯著減小至納米級（P<0.01）。當(dāng)與酶解時間為0.5 h 相比，酶解時間為1 h 時，納米淀粉粒徑略微增加，可能是因?yàn)槲⑸淞魈幚砗蟮矸垲w粒發(fā)生了一定聚集[10,12]，酶解時間增加到2 h，納米淀粉粒徑明顯減小，表明微射流顯著降低粒徑。

2.5 分子量分布

圖4 為不同酶解時長以及進(jìn)一步高壓微射流處理后淀粉的分子量激光信號，物質(zhì)分子量越大，保留時間越短。由圖4 可知，隨著酶解時間的增加，淀粉的分子量越小，經(jīng)微射流處理納米淀粉的分子量也隨酶解時間增加而降低。重均分子量（Mw）如表3 所示，酶解淀粉分子量與原淀粉相比顯著減小，且隨著酶解時間的增加而進(jìn)一步減小[28]，WMS 經(jīng)普魯蘭酶酶解后，淀粉的α-1,6 糖苷鍵斷裂，形成了短直鏈淀粉，這與已有研究結(jié)果相似[29-30]。在經(jīng)微射流處理后，納米淀粉的分子量較WMS 和酶解淀粉均顯著降低（P<0.05），且分子量隨酶解時間的增加而降低，這主要是因?yàn)槲⑸淞鞯母邏鹤饔檬沟矸鄯肿渔湴l(fā)生斷裂[19,31]。

表3 不同處理?xiàng)l件WMS 的分子量Table 3 Molecular weight of WMS under different treatment conditions

圖4 不同處理?xiàng)l件WMS 的分子量激光信號圖Fig.4 Laser signal pattern of WMS under different treatment conditions

2.6 熱學(xué)性能分析

糊化溫度作為淀粉的一個重要指標(biāo)，與淀粉顆粒結(jié)晶結(jié)構(gòu)、直鏈淀粉含量等因素密切相關(guān)。由表4 可知，與原淀粉的起始糊化溫度To（64.76 ℃）和吸熱峰值溫度Tp（71.23 ℃）相比，酶解淀粉的糊化To（48.04 ℃）和Tp（53.81 ℃）顯著降低，但隨著酶解時間的增加到2 h，To（49.36 ℃）、Tp（55.81 ℃）略有升高。同時，經(jīng)過酶解后，淀粉的焓變（ΔH）出現(xiàn)不同程度降低，是因?yàn)槊附馄茐牧说矸劢Y(jié)晶區(qū)，導(dǎo)致其糊化溫度降低[32]。

表4 不同處理?xiàng)l件WMS 的熱學(xué)參數(shù)Table 4 Thermodynamic parameters of WMS under different treatment conditions

經(jīng)過微射流處理后得到的納米淀粉（E-1-N）的To進(jìn)一步降低（39.72 ℃），Tp也明顯向低溫方向移動（圖5），可能是因?yàn)榈矸鄣慕Y(jié)晶區(qū)被破壞，導(dǎo)致水分子更容易進(jìn)入淀粉結(jié)晶區(qū)[12]。由于動態(tài)超高壓使淀粉鏈降解，使淀粉短側(cè)鏈被打斷致其結(jié)構(gòu)松散，導(dǎo)致E-0.5-N 的ΔH 降低（5.65 J/g），但隨酶解時間增加到2 h，納米淀粉的ΔH 顯著（P<0.05）增大（13.33 J/g），可能和納米淀粉短程有序性結(jié)構(gòu)增加有關(guān)[19]。

圖5 不同處理?xiàng)l件WMS 的DSC 圖Fig.5 DSC curves of WMS under different treatment conditions

3 結(jié)論

蠟質(zhì)玉米淀粉經(jīng)酶解處理后其微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，形成短鏈淀粉分子、分子量顯著減小（P<0.05）；與原淀粉和酶解淀粉相比，進(jìn)一步經(jīng)微射流處理后的淀粉粒徑和分子量均顯著減小（P<0.05），達(dá)到納米級；同時，淀粉顆粒形態(tài)變成更加無規(guī)則的碎片狀，納米淀粉具有更低的糊化溫度。通過酶解-微射流處理，制備了一種粒徑均勻的納米淀粉，使蠟質(zhì)玉米淀粉結(jié)構(gòu)和熱學(xué)性能得到明顯改善；提供了一種環(huán)境友好、操作簡單且穩(wěn)定性良好的納米淀粉制備方法，有利于進(jìn)一步對納米淀粉進(jìn)行開發(fā)利用，為后續(xù)制備淀粉納米乳液及淀粉基納米活性材料提供基礎(chǔ)。

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