反復凍融法制備靈芝多糖工藝優化、結構表征及抗氧化活性分析

任洪飛，逄夢玉，隋昕怡，劉 丹，楊飛燕，劉養山，張 景，杜秀菊

（聊城大學生命科學學院，山東聊城 252000）

靈芝（Ganodermalucidum），又稱瑞草，據《中國藥典》記載，主要有補氣安神，止咳平喘的功效[1]。研究表明，靈芝中含有400 多種生物活性化合物，包括多糖、三萜、甾醇、核苷酸、脂肪酸和多肽等[2]，是一種極佳的食藥同源真菌。多糖是靈芝的主要活性成分之一[3]，主要存在于靈芝子實體和菌絲體中[4]，具有抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抗衰老[7]、抗菌[8]、抗炎[9]、防治心血管疾病[10]、保肝護肝[11]、保護神經[12]、免疫調節[13]等藥理活性及功能。

傳統靈芝多糖提取方法主要包括水提法、酶提法[14]、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法[15]、酸提法、堿提法等[16]，但存在提取率低、設備要求高、經濟效益低等諸多弊端。改進現有的靈芝多糖提取方法和探究新的提取方法以提高靈芝多糖的提取率、降低提取成本仍然具有重大意義。反復凍融法原理是在反復凍結和解凍過程中，細胞內部的水分形成冰晶刺破細胞壁，使得胞內物質更容易透過細胞壁溶出。該技術條件溫和，不會破壞熱不穩定性成分，容易實現工業上放大，是一種環境友好且經濟的提取方法。目前已用于拐棗多糖[17]、刺麒麟菜多糖[18]、枸杞多糖[19]、油菜花粉多糖[20]和小球藻多糖[21]等多種多糖的提取，均取得了較好的效果。此外，反復凍融法已應用于靈芝孢子粉的破壁[22]，但采用反復凍融提取靈芝子實體多糖及其工藝優化鮮有報道。

本研究優化反復凍融法提取靈芝多糖（G.lucidumpolysaccharide freeze-thaw，GLPf）工藝，并利用乙醇對其進行分級（GLPf30、GLPf60、GLPf80）。比較多糖的抗氧化活性并對其進行結構表征，旨在篩選活性較高的多糖組分，為靈芝資源的合理開發奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝子實體 購于山東聊城冠縣，經聊城大學農學院戴明勛副教授鑒定為赤芝；單糖標準品 美國Sigma 公司；苯酚、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市風船化學試劑科技有限公司；濃硫酸 萊陽經濟技術開發區精細化工廠；葡萄糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨（ABTS）、抗壞血酸（vitamin C，VC）北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇 煙臺遠東精細化工有限公司；三氯化鐵、三氯乙酸 國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

xt-200 高速多功能粉碎機 浙江省紅太陽機電有限公司；HHS-22-8 電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司；RE-2000B 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；721 可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；GFL-140 電熱鼓風干燥箱天津市萊玻特瑞儀器有限公司；Sorvall Biofuge Stratos 高速冷凍離心機、Nicolet iS50 傅里葉紅外光譜儀 Thermo Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝樣品預處理 靈芝子實體預處理參照田淑雨等[23]的方法，略作改動。靈芝子實體60 ℃烘干至恒重，粉碎，過80 目篩。按照1:15（g/mL）的比例加入95%的乙醇，浸泡24 h，重復2 次。濾渣60 ℃烘干后備用。

1.2.2 靈芝多糖的提取工藝 精確稱取3.0 g 已處理的靈芝子實體粉末，按照一定的溶脹比加入蒸餾水，充分混勻，置于-27 ℃冰箱中冷凍一定時間后取出，50 ℃水浴解凍10 min，冷卻至室溫后再次凍結，重復數次后利用熱水浸提。

靈芝多糖熱水浸提參照田淑雨等[15]的條件，略作改動。選取料液比1:25（g/mL），提取時間2.5 h，提取溫度85 ℃。提取液4000 r/min 離心10 min，上清液抽濾2 次后蒸發濃縮至原體積的1/3，加入4 倍體積95%的乙醇，醇沉過夜。醇沉后5000 r/min 離心20 min，棄上清，沉淀冷凍干燥，即為靈芝粗多糖。

1.2.3 反復凍融法單因素實驗 以粗多糖提取得率為考察指標，固定溶脹比15:1（mL/g），凍融時間為2 h，凍融次數2 次，對反復凍融過程中的溶脹比、凍融時間和凍融次數三個因素進行單因素實驗設計。固定其他凍融條件，分別選取5:1、10:1、15:1、20:1、25:1（mL/g）得溶脹比，1.5、2、2.5、3 和3.5 h得凍融時間，1、2、3、4、5 次得凍融次數，按照1.2.2 的提取條件進行提取，得靈芝粗多糖。多糖提取得率公式計算如下：

式中，m 為靈芝多糖質量（g）；M 為靈芝子實體粉末質量（g）。

1.2.4 反復凍融法響應面試驗 根據單因素結果，以溶脹比、凍融時間、凍融次數為考察因素，多糖提取得率為考察指標，運用Design-Expert 8.0.5 軟件，設計Box-Behnken 試驗，采用3 因素3 水平響應面分析試驗，各因素水平見表1。

表1 響應面設計因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.2.5 乙醇分級靈芝多糖 乙醇分級靈芝多糖參照張景等[24]的方法，略作改動，具體如下：利用1.2.4 最優條件提取獲得靈芝多糖提取液，濃縮后加入95%的乙醇，邊加邊攪拌均勻，至乙醇濃度達到30%，4 ℃靜置4 h 后，離心（5000 r/min，20 min），收集沉淀，透析（3500 Da），冷凍干燥后即得靈芝多糖GLPf30。同樣操作，將上清液加95%乙醇至乙醇濃度分別為60%和80%，分別獲得靈芝多糖組分GLPf60 和GLPf80。具體流程如圖1。

圖1 乙醇分級靈芝多糖制備圖Fig.1 Preparation diagram of ethanol graded Ganoderma lucidum polysaccharides

1.2.6 多糖和蛋白質含量測定 采用苯酚-硫酸法[25]和DNS（3,5-二硝基水楊酸，3,5-Dinitrosalicylic acid）法[26]測定樣品中總糖含量和還原糖，分別根據公式（2）和公式（3）計算含量。多糖含量的計算按公式（4）進行。

式中，C 為根據標曲計算得到的樣品總糖質量濃度（mg/mL）；V 為樣品溶液總體積（mL）；M 為粗多糖質量（mg）。

式中，C 為根據標曲計算得到的樣品還原糖質量濃度（mg/mL）；V 為樣品溶液總體積（mL）；M 為粗多糖質量（mg）。

蛋白質含量采用考馬斯亮藍法[27]測定，根據公式（5）進行計算。

式中，C 為根據標曲計算得到的樣品蛋白質量濃度（mg/mL）；V 為樣品溶液總體積（mL）；M 為粗多糖質量（mg）。

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除力測定 參考Wei 等[28]的方法，略作改動。取1 mL 不同濃度樣品液（62.5、125、250、500、1000、1500 μg/mL），加入1 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 無水乙醇溶液，混勻后避光反應30 min，測定517 nm 處吸光值，記作Ai；分別將Ai中的DPPH 溶液、樣品溶液換成無水乙醇，同樣方法測得吸光值，分別記作Aj和A0。DPPH 自由基清除率計算公式如下：

1.2.7.2 羥自由基清除力測定 參照Bulu 等[29]的方法，略作改動。將1 mL 30%的H2O2溶液（4 mmol/L）、1 mL 不同濃度樣品液、1 mL FeSO4溶液（4 mmol/L）、1 mL 水楊酸無水乙醇溶液（4 mmol/mL）混勻，37 ℃避光反應30 min，離心（4000 r/min，10 min），取上清液，測定510 nm 處吸光值，記作Ai。分別以無水乙醇代替Ai中的水楊酸無水乙醇溶液，以超純水代替Ai中的樣品液，其余步驟同Ai，測得吸光值，分別記作Aj和A0。以VC為陽性對照。羥自由基清除率公式如下：

1.2.7.3 總還原力測定 總還原力測定方法參照田淑雨等[30]，略作改動。將1 mL 不同濃度樣品液與2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液、2 mL 0.2 mol/L pH=6.6的PBS 緩沖液混合均勻，50 ℃恒溫20 min。再加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻，3000 r/min 離心10 min。取2.5 mL 上清液、2.5 mL 超純水和1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻，靜置10 min，測700 nm 處吸光值。

1.2.7.4 ABTS+自由基清除力測定 ABTS 溶液配制及清除力測定參照劉養山等[31]的方法，略作改動。將50 μL 樣品液與150 μL ABTS 溶液混合均勻，避光5 min 測定734 nm 吸光值，記作Ai。以PBS 緩沖液分別替代Ai中的ABTS 溶液和樣品液，測得吸光值分別記作Aj和A0。以VC為陽性對照。ABTS+自由基清除率計算公式如下：

1.2.8 多糖結構表征

1.2.8.1 傅里葉紅外光譜分析 利用傅里葉紅外光譜對五種單糖的特征性官能團進行分析，參照Xu等[5]的方法，略作改動。取1 mg 多糖樣品混入100 mg KBr 粉末研磨均勻，壓片，掃描范圍為4000～400 cm-1，累積掃描32 次。

1.2.8.2 單糖組分分析 采用高效離子交換色譜（HPAEC）法進行檢測，參照Li 等[32]的方法，略作改動。稱取樣品2 mg 加入10 mL 3 mol/L 三氟乙酸，120 ℃水解6 h，冷卻減壓蒸干，加3 mL 甲醇蒸干，稀釋100 倍，過0.22 μm 的微孔濾膜。利用CarboPac PA20 陰離子交換分析柱，以2 mmol/mL 的NaOH溶液洗脫，流速0.45 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量25 μL。

1.3 數據處理

實驗數據運用 Excel 2021 整理，用SPSS Statistics 19、Origin 2021 進行數據分析及繪圖，每個實驗設置三個平行，結果以均值±標準差表示，不同字母（a～d）表示數據之間有顯著差異（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

由圖2a 可知，隨著溶脹比的增加，多糖提取得率呈現先升高后降低的趨勢，在15:1（mL/g）時提取得率達到最高，之后下降，然后略有上升（圖2a）。可能原因是隨著溶脹比的增大，在一定時間內無法形成足夠的冰晶刺破細胞壁，阻礙了多糖的溶出。所以選取溶脹比為15:1（mL/g）進行后續響應面試驗。

圖2 不同因素對靈芝多糖提取得率的影響Fig.2 Influence of different factors on Ganoderma lucidum polysaccharide extraction yield

隨著凍融時間的增加，多糖提取得率呈現先升高后降低的趨勢，在2.5 h 時提取得率達到最大（圖2b）。分析其原因可能是隨著凍融時間的增加，細胞內水結晶度升高，更容易刺破細胞壁，多糖釋放的阻力減小。但時間過長導致分子熱運動長時間處于抑制狀態，多糖難以溶出[32]。所以選取2.5 h 進行后續試驗。

隨著凍融次數的增加，多糖提取得率呈現先升高后降低的趨勢，在凍融2 次時提取得率達到最高（圖2c）。分析其原因可能是隨著凍融次數的增加，細胞破壁更加充分，提取得率提高。凍融次數過多導致機械強度過大，使得多糖結構變化，提取得率降低[33]。所以凍融次數2 次進行后續試驗。

2.2 響應面試驗結果

Box-Behnken 試驗方案及結果見表2。響應面分析的回歸方程為：Y=2.64-0.012A+0.033B+0.12C-0.10A2-0.050B2-0.090C2+0.057AB-0.0075AC-0.063BC。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Designs and results of Box-Behnken test

根據表3 可知，響應面模型P<0.01，表示該模型極其顯著；失擬項P>0.05，不顯著。R2=0.9671，表明該模型擬合度較好；R2Adj=0.9247，表明該模型能夠解釋92.47%的響應值變化。C.V.<10%，表明實驗可信度和精確度較高；精密度>4 為合理[34]，模型精密度為13.633，符合精密度要求。

表3 響應面結果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface results

響應面及等高線圖如圖3 所示。響應面曲線越陡，交互作用越強；陡峭程度越低，交互作用越弱。等高線越趨于橢圓形，因素間的交互作用越強，越趨于圓形，交互作用較弱。由圖3 可以看出：BC 的交互作用對響應值的影響最強，AB 次之，AC 最弱。

圖3 不同因素交互作用對靈芝多糖（GLPf）提取得率的影響Fig.3 Effect of different factor interactions on GLPf extraction yield

響應面試驗預測條件為：溶脹比14.21:1（mL/g）、凍融時間2.38 h、凍融次數2.75 次，預測提取得率為2.68%；對預測條件稍作調整進行驗證，提取條件為：溶脹比14:1（mL/g）、凍融時間140 min、凍融次數3 次，多糖實際提取得率為2.71%±0.035%，與預測值誤差1.2%。

2.3 靈芝多糖抗氧化活性結果

5 種靈芝多糖清除DPPH 自由基試驗結果如圖4（a）和表4 所示。利用不同濃度的樣品進行測定，每種多糖對于DPPH 自由基清除能力均具有濃度依賴性，濃度越高清除能力越強。根據DPPH 自由基清除力的EC50值可知，清除能力大小排序為：GLPf30>GLPw>GLPf>GLPf80>GLPf60。GLPw 與GLPf 的DPPH 自由基清除能力接近，GLPf60 與GLPf80 的DPPH 自由基清除能力相對較弱，30%乙醇分級組分GLPf30 相較于其他4 種多糖具有較強的DPPH 自由基清除能力。

圖4 5 種靈芝多糖抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of 5 polysaccharides from Ganoderma lucidum

表4 不同多糖抗氧化活性EC50 值（mg/mL）Table 4 EC50 values of antioxidant activity of different polysaccharides from Ganoderma lucidum (mg/mL)

5 種靈芝多糖清除羥自由基能力如圖4（b）和表4 所示。每種多糖對于羥自由基清除能力均具有濃度依賴性，濃度越高清除能力越強。清除能力大小排序為：GLPf30>GLPf60>GLPw>GLPf>GLPf80。GLPw 與GLPf 的羥自由基清除力相近，GLPf80 的清除力最弱，GLPf60 清除力略低于GLPf30，30%乙醇分級組分GLPf30 相較于其他4 種多糖具有較高的羥自由基清除能力。

以VC為陽性對照，5 種靈芝多糖清除ABTS+自由基能力如圖4（c）和表4 所示。每種多糖對于ABTS+自由基清除能力均具有濃度依賴性，濃度越高清除能力越強。ABTS+自由基清除力大小排序為：GLPf30>GLPf>GLPw>GLPf60≈GLPf80。5 種多糖均表現出了較強的ABTS+自由基清除能力，GLPf30甚至高于陽性對照VC。

5 種靈芝多糖總還原力如圖4（d）和表4 所示。利用不同濃度的樣品進行測定，每種多糖總還原力均具有濃度依賴性，濃度越高清除能力越強。GLPf30的總還原力最強（RP0.5AU=3.32），反復凍融提取所得的多糖GLPf 總還原力（RP0.5AU=4.84）略強于熱水浸提多糖GLPw（RP0.5AU=5.94）。

2.4 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜法是根據不同波數吸收峰鑒定多糖分子中原子或官能團振動情況的方法，5 種多糖的紅外光譜結果如圖5 所示。各多糖的紅外吸收峰大致相似，而峰面積有較大差異，具體分析如下：

圖5 5 種靈芝多糖傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FT-IR of five Ganoderma lucidum polysaccharides

首先對水提靈芝多糖GLPw 和凍融靈芝多糖GLPf 進行分析。2 種多糖在3415.98 和3393.75 cm-1處存在較寬的吸收峰，為O-H 鍵伸縮振動引起，表明多糖中含有羥基[35]；2927 cm-1左右存在的較窄的吸收峰為C-H 鍵振動峰，表明多糖中含有-CH、-CH2、-CH3[36]；在1600 cm-1左右的吸收峰是是由于多糖結合水引起或C=O 的伸縮振動峰[37]；1401.65 和1407.61 cm-1處的吸收峰是糖醛酸中的-COOH 伸縮振動峰，暗示多糖中含有糖醛酸[38]，這與單糖組成結果相吻合；1322.44 和1321.96 cm-1為C-H 的振動峰[5]；1261.21 和1245.79 cm-1為S=O 振動峰，表明多糖中有硫酸鹽的存在[39]；GLPw 中1078.46、1047.16 cm-1和GLPf 中1077.78、1046.68 cm-1均為吡喃環中的糖苷鍵伸縮振動引起的[40]；890.47 和894.33 cm-1為典型的β糖苷鍵吸收峰[41]；610.66 和613.09 cm-1有吸收峰，說明多糖中含有吡喃糖骨架[14]。

對乙醇分級所得3 種多糖（GLPf30、GLPf60、GLPf80）進行分析。3416.69、3396.96、3416.69 cm-1處的吸收峰為羥基吸收峰；2924.81、2927.73、2927.15 cm-1處為C-H 鍵振動峰；1600 cm-1左右的吸收峰是是由于多糖結合水引起或C=O 的伸縮振動峰；1407.29、1409.15、1408.18 cm-1處的吸收峰暗示多糖中有糖醛酸的存在，與單糖組成結果相互佐證；1384.59（GLPf30）、1321.28（GLPf30）、1384.63（GLPf60）、1384.63（GLPf80）cm-1為C-H 的振動峰；1262.18、1260.73、1260.25 cm-1為S=O 振 動峰；1076.53、1043.30、1077.16、1045.71、1081.45、1050.53 cm-1均為吡喃環糖苷鍵伸縮振動引起；890.47、889.99、893.84 cm-1為β糖苷鍵吸收峰；3 種多糖在500～900 cm-1均有吸收峰，說明多糖中含有吡喃糖骨架[36]。

綜上所述，5 種多糖均是以吡喃糖為骨架的酸性多糖，且均含有β構象。5 種多糖的紅外吸收峰在4000～500 cm-1范圍內非常相似，表明反復凍融和乙醇分級不會影響靈芝多糖的主要結構。

2.5 靈芝多糖理化性質和單糖組分分析

靈芝粗多糖中糖含量及蛋白含量如表5 所示，總糖、還原糖及蛋白含量標準曲線如圖6 所示。相較于熱水浸提法提取所得的靈芝多糖，反復凍融法所得的多糖中還原糖含量較低，蛋白含量也較低。有研究表明反復凍融法可用于多糖的脫蛋白[42]，為本研究結果提供了佐證。經乙醇分級后所得三個組分中，GLPf30 質量占比偏低，GLPf60 與GLPf80 占比相近。利用不同濃度的乙醇分級最終得到的各組分質量占比有所不同，田淑雨等[30]利用乙醇分級得到GLP40、GLP60 和GLP80 的質量占比分別為45%、29%、26%。不同組分的物理性狀也有所差異，五種多糖均以棕色為主，GLPf30 凍干后為片狀，而其余四種組分均為塊狀。

圖6 總糖（a）、還原糖（b）及蛋白質（c）的標準曲線圖Fig.6 Standard curves for total sugars (a),reducing sugars (b)and proteins (c)

表5 靈芝多糖的理化性質與單糖組成Table 5 Analysis of polysaccharide content and monosaccharide composition

5 種多糖的HPAEC 結果如圖7 及表5 所示。5 種多糖均由巖藻糖（Fuc）、氨基葡萄糖（GlcN）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）六種單糖組成，且均含有少量的葡萄糖醛酸（GlcA）；GLPw、GLPf、GLPf30、GLPf60、GLPf80 摩爾比分別為2.70:15.06:5.43:37.44:2.38:4.31，3.04:13.72:6.11:41.31:2.63:4.69，1.73:20.79:1.60:27.95:1.18:1.96，5.32:13.74:12.39:40.38:3.24:5.86，2.85:14.08:6.27:49.71:4.11:6.22。不同提取方法以及乙醇分級后獲得多單糖組成種類相同，但摩爾比有較大差異。

圖7 5 種靈芝多糖的高效陰離子色譜圖Fig.7 High performance anion exchange chromatography of 5 polysaccharides from Ganoderma lucidum

3 討論與結論

本研究表明反復凍融法提取靈芝多糖（GLPf）比傳統的水提得率（2.36%）提高了14.8%，且凍融多糖（GLPf）的抗氧化活性高于水提多糖（GLPw），此方法可以提高靈芝多糖的提取得率及抗氧化活性。楊靜等[17]利用反復凍融與回流技術相結合提取拐棗多糖，最終拐棗中多糖的含量為1.68%；陳玉芳等[18]利用冷凍法提取刺麒麟菜多糖，多糖得率達到53.98%，硫酸酯基含量23.76%；溫梓辰等[19]利用反復凍融提取枸杞多糖，多糖融出率可達到15.651%。以上研究均表明反復凍融是一種有效的多糖提取方法，與本研究結論相吻合。

采用乙醇分級法，由GLPf 成功分離獲得3 種靈芝多糖，GLPf30 的抗氧化能力明顯高于其他兩種多糖（GLPf60 和GLPf80）及其前體物GLPf，是一種具有抗氧化活性潛力的多糖組分，值得進一步深入研究。王宣東[43]利用乙醇分級得到3 種金耳多糖，發現TAP30 的抗氧化能力最強；常雪飛等[44]利用乙醇分級獲得3 種辣木葉多糖，發現80%乙醇分級組分MP-3 具有較強的抗氧化能力；景永帥等[45]利用乙醇對北沙參多糖進行分級，發現50%乙醇分級所得多糖抗氧化性較強；吳楊洋等[46]分級得到四種蛹蟲草多糖，發現CMP60 的還原力和DPPH 自由基清除率均為最高，CMP80 的羥自由基的清除率最高。本研究再次表明，乙醇分級法對于篩選靈芝多糖的抗氧化活性部位是一個有效的方法。

HPAEC 和FT-IR 結果表明，GLPf30 與其他4 種多糖的單糖組分相似，但其摩爾比、理化性質有明顯不同，尤其是GLPf30 的氨基葡萄糖（GlcN）占比為最高（達到37.66%）。推測這大概就是GLPf30的抗氧化活性明顯優于其他組分的物質基礎。

后續將對GLPf30 進一步純化，對其一級結構和空間結構進行深度解析，并對其構效關系做進一步的研究。

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