一種有效采集核酸氣溶膠的方法

孫世雄，焉 鑫，孫翔翔，孫明軍，高玉斌，孫 靜，張培培，王毓秀，孫淑芳

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266114）

經(jīng)過新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染和非洲豬瘟疫情，不管是醫(yī)院、疾病預(yù)防控制部門，還是規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)、動(dòng)物疫病預(yù)防控制部門，其核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)量都快速增長(zhǎng)[1]。作為核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的必備技術(shù)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）具有極高的靈敏度。這也意味著，微量的核酸污染即可導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)[2]。核酸氣溶膠便是常見的污染之一，也是核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必須預(yù)防和控制的一個(gè)問題。因此，實(shí)驗(yàn)室在開展核酸檢測(cè)之前，首先要做的便是判斷室內(nèi)是否存在核酸氣溶膠污染，而判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于核酸氣溶膠采樣方法的有效性。

對(duì)于核酸氣溶膠的采樣，實(shí)驗(yàn)室常用空氣沉降法[3]。將裝有超純水的離心管開蓋置于實(shí)驗(yàn)室不同區(qū)域，靜置一段時(shí)間后，不經(jīng)核酸提取，直接加入擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)[4-5]。該方法是在靜止?fàn)顟B(tài)下，用水被動(dòng)溶解核酸氣溶膠，其最大的缺陷在于偶然性，只有當(dāng)環(huán)境中的核酸氣溶膠擴(kuò)散并接觸到離心管內(nèi)的超純水時(shí)，才能被采集。為此，本試驗(yàn)引入氣體采樣泵和過濾吸頭，變靜態(tài)采樣為動(dòng)態(tài)采樣，變被動(dòng)溶入為主動(dòng)吸附，能夠顯著提高目標(biāo)核酸的檢出率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 噴霧瓶（廣州名創(chuàng)優(yōu)品有限責(zé)任公司，50 mL）、氣體采樣泵（河南省保時(shí)安電子科技有限公司，吸氣流量500 mL/min）、生物安全柜（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，HFsafe-1200LC）、 熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher Scientific，QuantStudio 5）。

1.1.2 試劑耗材 pBR322 質(zhì)粒DNA（上海生工生物工程股份有限公司，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，由E. coli菌株抽提得到）、布魯氏菌核酸（羊種3型，質(zhì)量濃度為15.7 ng/μL，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家動(dòng)物布魯氏菌病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存）、超純水（取自德國(guó)默克密理博Milli-Q Integral 3 超純水機(jī)）、過濾吸頭（BBI 生命科學(xué)有限公司，規(guī)格為200 μL，滅菌，無DNA 酶、RNA 酶，盒裝）、一次性乳膠管（河南省保時(shí)安電子科技有限公司，內(nèi)徑3 mm，長(zhǎng)10 cm）、離心管（BBI 生命科學(xué)有限公司，1.5 mL，滅菌，無DNA 酶、RNA 酶）、八連管（德國(guó)Greiner 公司，規(guī)格為200 μL）、2×酶預(yù)混液（湖南艾科瑞生物工程有限公司，ProTaqHS Premix Probe qPCR Kit）、滅菌雙蒸水（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 模擬核酸氣溶膠污染

選取一間體積為23 m3的房間，靠墻放置一張桌子。房間內(nèi)無定向氣流，每天開窗通風(fēng)。吸取100 μL pBR322 質(zhì)粒DNA，加入盛有50 mL 超純水的噴霧瓶?jī)?nèi)，混勻后均勻噴灑于房間內(nèi)，靜置30 min。

1.3 樣品采集

在房間內(nèi)選取6 個(gè)采樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)1、2 和3均勻分布于桌面，采樣點(diǎn)4、5 和6 均勻分布于地面。在噴灑后0 d（即噴灑當(dāng)天）、5 d 時(shí)，對(duì)每個(gè)點(diǎn)同時(shí)用對(duì)照組和試驗(yàn)組方法采樣。

對(duì)照組：取6 個(gè)1.5 mL 離心管，均加入500 μL超純水，然后開口靜置于房間內(nèi)30 min，以管內(nèi)溶液為核酸檢測(cè)模板。

試驗(yàn)組：取6 個(gè)氣體采樣泵，在進(jìn)氣端連接一次性乳膠管。過濾吸頭剪半后，將帶濾芯的一半插入乳膠管的另一端，確保連接處不漏氣（圖1）。打開采樣泵，置于房間內(nèi)30 min 后，將過濾吸頭取下放入盛有500 μL 超純水的離心管中，振蕩、離心后，以管內(nèi)溶液為核酸檢測(cè)模板。

圖1 采樣裝置示意圖

1.4 樣品實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

根據(jù)pBR322質(zhì)粒DNA序列，設(shè)計(jì)上游引物（pBR322-F：5'-TCCAACCCGGTAAGACACGA-3'）、下游引物（pBR322-R：5'-AGAACTCTGTAGCACCGCCT-3'）和探針（pBR322-P：5'-FAM-TATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTA-BHQ1-3'），交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照，pBR322質(zhì)粒DNA（10 ng/μL）為陽性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系25.0 μL：2×酶預(yù)混液10.0 μL、pBR322-F（10 μmol/L）0.6 μL、pBR322-R（10 μmol/L）0.6 μL、pBR322-P（10 μmol/L）0.6 μL、模板5.0 μL、滅菌雙蒸水8.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s（收集熒光），40 個(gè)循環(huán)。

1.5 日常監(jiān)測(cè)應(yīng)用

1.5.1 核酸氣溶膠采樣 選取一間布魯氏菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在桌面設(shè)置3 個(gè)采樣點(diǎn)，對(duì)每個(gè)采樣點(diǎn)同時(shí)用上述兩種方法進(jìn)行布魯氏菌核酸氣溶膠采樣。每周采樣檢測(cè)1 次，直至出現(xiàn)陽性結(jié)果。

1.5.2 核酸氣溶膠檢測(cè) 布魯氏菌核酸實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)所用引物、探針參照動(dòng)物布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法（T/CVMA 20—2020）合成，分別為上游引物（Bru-F：5'-CGCTCGCGCGGTGGAT-3'）、下游引物（Bru-R：5'-CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC-3'）和 探 針（Bru-P：5'-FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-BHQ1-3'），交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系25.0 μL：2×酶預(yù)混液10.0 μL、Bru-F（10 μmol/L）0.6 μL、Bru-R（10 μmol/L）0.6 μL、Bru-P（10 μmol/L）0.6 μL、DNA 模板5.0 μL、滅菌雙蒸水8.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s（收集熒光），40 個(gè)循環(huán)。以無菌無核酸酶水為陰性對(duì)照，布魯氏菌核酸為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 pBR322 質(zhì)粒DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

結(jié)果（圖2）顯示，陽性對(duì)照Ct 值為7.734，且有特征性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無Ct 值且無特征性擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)成立。噴灑后0 d 采樣檢測(cè)時(shí)，試驗(yàn)組在5 個(gè)采樣點(diǎn)的擴(kuò)增曲線起峰均早于對(duì)照組；噴灑后5 d 采樣檢測(cè)時(shí)，試驗(yàn)組在全部6 個(gè)采樣點(diǎn)的擴(kuò)增曲線起峰均早于對(duì)照組。

圖2 pBR322 質(zhì)粒實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果（表1）顯示：噴灑后0 d 采樣檢測(cè)時(shí)，試驗(yàn)組6 個(gè)采樣點(diǎn)的Ct 平均值為22.732，低于對(duì)照組的25.027；噴灑后5 d 采樣檢測(cè)時(shí)，對(duì)照組只有3 個(gè)采樣點(diǎn)能檢測(cè)到Ct 值，且皆高于相應(yīng)試驗(yàn)組數(shù)值。

表1 pBR322 質(zhì)粒實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Ct 值

2.2 日常監(jiān)測(cè)結(jié)果

日常監(jiān)測(cè)中，共連續(xù)采樣6 次。前5 次采樣后，對(duì)照組和試驗(yàn)組皆未檢測(cè)到布魯氏菌核酸，說明在這段時(shí)間內(nèi)該實(shí)驗(yàn)室不存在布魯氏菌核酸氣溶膠污染。第6 次采樣后，對(duì)照組在3 個(gè)采樣點(diǎn)皆未檢測(cè)到布魯氏菌核酸，而試驗(yàn)組皆可檢測(cè)到，且Ct 值均為34（圖3、表2）。結(jié)果表明，在第6 周時(shí)該實(shí)驗(yàn)室已受到布魯氏菌核酸氣溶膠污染，應(yīng)該暫停相關(guān)試驗(yàn)活動(dòng)，及時(shí)清除核酸污染。

表2 布魯氏菌核酸實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Ct 值

圖3 布魯氏菌核酸氣溶膠實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

本研究創(chuàng)新采用氣體采樣泵與過濾吸頭相結(jié)合的方式，發(fā)明了一個(gè)有效采集核酸氣溶膠的裝置。該裝置具有以下特點(diǎn)：一是高效，試驗(yàn)組方法所用氣體采樣泵的吸氣流量為500 mL/min，在30 min內(nèi)有1.5 L 室內(nèi)空氣通過吸頭濾芯，核酸氣溶膠在濾芯部位富集；二是輕巧便攜，采樣泵作為裝置的主體，僅有手掌大小，使用時(shí)連接吸頭即可；三是可防交叉污染，采樣泵通過一次性塑料管與一次性過濾吸頭連接，一用一換，能夠有效防止不同采樣過程之間交叉污染。

當(dāng)空間內(nèi)核酸氣溶膠的濃度較高時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組Ct 值均小于30，且都出現(xiàn)了特征性擴(kuò)增曲線。此時(shí)，使用兩種方法均能檢測(cè)到核酸氣溶膠污染的存在。但是試驗(yàn)組在6 個(gè)采樣點(diǎn)的平均Ct值較小。結(jié)果提示，使用試驗(yàn)組方法采集到了更多的核酸氣溶膠。當(dāng)空間內(nèi)核酸氣溶膠濃度較低時(shí)，對(duì)照組僅在一半采樣點(diǎn)檢測(cè)到Ct 值，且出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線。而試驗(yàn)組在全部采樣點(diǎn)均檢測(cè)到Ct值，且出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線。結(jié)果提示，使用試驗(yàn)組方法采集到了更多的核酸氣溶膠，且在污染較輕的情況下優(yōu)勢(shì)更明顯，能夠避免假陰性結(jié)果出現(xiàn)。

采樣的科學(xué)性對(duì)于環(huán)境監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。如果不能有效采集樣本，得到的可能會(huì)是“假陰性”結(jié)果[6-7]。例如，本試驗(yàn)對(duì)照組在噴灑后5 d 采樣時(shí)，一半采樣點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明使用對(duì)照組方法在這3 個(gè)點(diǎn)上未能采集到目標(biāo)核酸。優(yōu)化樣本采集，除了開發(fā)應(yīng)用新技術(shù)，還可以采取以下措施：一是延長(zhǎng)裝水離心管在空間內(nèi)的放置時(shí)間，二是在空間內(nèi)設(shè)置多個(gè)采樣點(diǎn)。若任一采樣點(diǎn)核酸檢測(cè)結(jié)果為陽性，均應(yīng)暫停實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行，并采取相應(yīng)措施加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室清潔、消毒和除核酸，直至環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果全部合格[8]。

在判斷實(shí)驗(yàn)室是否存在核酸氣溶膠污染的問題上，采樣方法各異。周志圖[9]在其發(fā)明專利中，為驗(yàn)證所發(fā)明的核酸氣溶膠清除劑的效果，在實(shí)驗(yàn)室中軸線上、中、下3 個(gè)方位，分別放置濾膜，用于采集并回收空氣中的核酸氣溶膠。在對(duì)潔凈工作臺(tái)或生物安全柜進(jìn)行空氣采樣時(shí)，馬祥等[10]建議打開風(fēng)機(jī)，將用水浸潤(rùn)過的多層紗布置于排風(fēng)口，在5～10 min 后洗脫紗布上捕獲的核酸。受此啟發(fā)，可以將用水潤(rùn)濕的紗布置于實(shí)驗(yàn)室排風(fēng)口處，用于對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè)。北京大學(xué)第三醫(yī)院的袁曉寧等[11]在評(píng)價(jià)武漢市某定點(diǎn)醫(yī)院SARSCoV-2 污染情況時(shí)，采用北京鼎藍(lán)科技有限公司生產(chǎn)的便攜式生物氣溶膠采樣器WA-15 對(duì)病區(qū)環(huán)境中可能存在的病毒進(jìn)行采樣，效果顯著。該設(shè)備是一款旋風(fēng)式生物氣溶膠采樣器，可與凍存管結(jié)合使用，將空氣中的顆粒物直接采集到液體中。它不僅可以采集細(xì)菌、真菌、病毒等微生物，還可以采集懸浮在氣體介質(zhì)中的核酸氣溶膠[12]。類似的氣溶膠采集儀器價(jià)格昂貴，難以在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。除上述直接對(duì)空氣進(jìn)行采樣的方法，羅冰科等[13]在應(yīng)用核酸清潔劑清除法醫(yī)DNA 實(shí)驗(yàn)室核酸污染的研究中，參照干濕兩步法，采用棉簽擦拭試驗(yàn)臺(tái)面、移液器、金屬浴、離心機(jī)的表面，間接采集實(shí)驗(yàn)室氣溶膠，據(jù)此驗(yàn)證清潔劑對(duì)氣溶膠的去除效果。與上述方法相比，本文發(fā)明的采樣裝置簡(jiǎn)單易用，變被動(dòng)溶入為主動(dòng)吸附，直接采集氣溶膠，能夠提高目標(biāo)核酸的檢出率。