miR-21低表達對垂體瘤細胞系RC-4BC增殖、凋亡的影響及與PTEN靶向關系

宋志遠，任洪波，韓曉正，牛國棟

邯鄲市中心醫院神經外三科，河北 邯鄲 056009

垂體瘤是僅次于腦膜瘤和神經膠質瘤的第三常見顱內腫瘤，占所有顱內腫瘤的10%～15%［1］。盡管大多數垂體瘤是良性和生長緩慢的惡性腫瘤，但患者可能會出現嚴重的頭痛、視覺問題和激素相關癥狀［2］。一些垂體瘤具有侵襲性，可導致嚴重的癥狀甚至死亡。垂體瘤發生發展的病因和機制尚不清楚，闡明垂體瘤的發生發展的潛在分子機制有助于其早期發現、治療和改善患者的預后。微小RNA（miRNA）是一類17～27個核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，miRNA作為機體內在調節因子，參與包括細胞增殖、分化和凋亡等一些系列細胞生理過程。越來越多的研究［3］表明，miRNA可以通過與靶基因的3′非翻譯區（3′UTR）特異性結合來調節靶基因的表達。研究［4］顯示，垂體瘤中miRNA的異常失調可能參與垂體瘤的發生發展。miR-21是近年來發現的與細胞增殖分化有關的miRNA家族成員。既往研究［5-6］發現，miR-21在垂體瘤組織細胞和血漿中表達異常升高，并且與垂體瘤的侵襲性相關，但miR-21對垂體瘤細胞增殖、凋亡的影響及機制尚不明確。第10號染色體丟失的張力蛋白同源磷酸酶基因（PTEN）是目前研究較多的公認的抑癌基因之一，既往研究［7-8］顯示miR-21能靶向PTEN參與包括腫瘤細胞在內的機體細胞功能的調控。2022年2月—2022年10月，我們觀察了miR-21低表達對垂體瘤細胞系RC-4BC增殖、凋亡的影響，并分析其與PTEN的靶向關系。

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑 人垂體瘤細胞系RC-4BC購自美國典型培養物保藏中心。總RNA提取試劑TRIzol購自北京天根公司；PCR引物、脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和RT-PCR熒光定量試劑盒購自大連寶生物公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自北京達科為公司；miR-21模擬物miR-21 mimics、模擬物陰性對照NC-mimics、miR-21抑制物miR-21 inhibitor、抑制物陰性對照NC-inhibitor、野生型PTEN熒光素酶報告基因質粒PTEN-WT、突變型PTEN熒光素酶報告基因質粒PTEN-MUT購自上海吉瑪制藥公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博公司。

1.2 細胞培養、轉染及分組 RC-4BC細胞置于RPMI-1640培養基（含10% FBS），在5%二氧化碳、37℃恒溫環境中培養，2～3 d更換培養基一次。轉染操作時，取對數生長期的RC-4BC細胞接種于12孔細胞板，按照脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑說明書操作分別將miR-21抑制物miR-21 inhibitor、抑制物陰性對照NC-inhibitor轉染至RC-4BC細胞，轉染后細胞標記為兩組：沉默組（轉染miR-21 inhibitor）和陰性對照組（轉染 NC-inhibitor），轉染后12 h更換新鮮培養基，24 h后收集細胞用于后續實驗。

1.3 兩組細胞中miR-21、PTEN mRNA檢測 采用RT-PCR法。TRIzol試劑提取兩組細胞總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度合格。取總RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，加入PCR引物，應用RT-PCR熒光定量試劑盒配置反應體系，進行進行熒光定量PCR擴增反應。PCR引物序列：miR-21正向引物為5′-GCCGCTAGCTTATCAGACT-3′，反向引物為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；U6正向引物為5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；PTEN正向引物為5′-AAAACAGTAGAGGAGCCGTCAAATC-3′，反向引物為5′-AAAACAGTAGAGGAGCCGTCAAATC-3′；GAPDH正向引物為5′-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3′，反向引物為5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。PCR反應條件如下：95 ℃ 2 min，40個循環（95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s）。miR-21以U6作為內參基因，PTEN以GAPDH作為內參基因，以2-ΔΔCt表示細胞中受檢基因mRNA的相對表達量。

1.4 兩組細胞增殖能力觀察 采用CCK8實驗。取兩組RC-4BC細胞，采用胰酶消化后制備單細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/ml，以每孔100 μL接種于96孔細胞板中，繼續培養24、48、72 h時向每孔加入10 μL CCK溶液，在37 ℃繼續孵育2 h，于酶聯免疫檢測儀檢測各孔波長490 nm的OD值，以OD值表示細胞增殖能力。

1.5 兩組細胞集落形成能力觀察 采用平板克隆實驗。取兩組RC-4BC細胞，采用胰酶消化后制備單細胞懸液，以每個培養皿200個細胞的密度接種到含10 mL培養液的細胞培養皿中，在5%二氧化碳、37 ℃的恒溫環境中孵育14 d后，肉眼可見細胞集落，吸棄培養液，PBS洗滌2遍，加入4%多聚甲醛固定細胞，染色細胞20 min，去除染色液，室溫下干燥，顯微鏡下計數集落形成數，以大于50個細胞的集落表示為一個克隆細胞數。

1.6 兩組細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。取兩組RC-4BC細胞，胰蛋白酶消化后，PBS洗滌3遍，加入結合液500 μL重懸細胞，避光加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，再加入PI 5 μL，充分混勻后，室溫孵育15 min，立即上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 兩組細胞周期分布情況觀察 采用流式細胞術。取兩組RC-4BC細胞，PBS洗滌2遍，加體積分數70%的預冷乙醇固定，4 ℃固定24 h后，1000 r/min離心5 min分離乙醇，去上清，PBS洗滌3遍，加適量RNaseA，37 ℃水浴30 min后加入適量PI混勻，4 ℃避光染色30 min，最后上流式細胞儀檢測G0/G1期、S期細胞占比。

1.8 miR-21與PTEN的靶向關系驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。收集RC-4BC細胞制備單細胞懸液，接種于12孔板，按照脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑說明書操作分別將miR-21 mimics或NC-mimics與PTEN-WT或PTEN-MUT共轉染至RC-4BC細胞，轉染后細胞標記為四組：miR-21 mimics+PTEN-WT組、NC-mimics+PTEN-WT組、miR-21 mimics+PTEN-MUT組、NC-mimics+PTEN-MUT組。轉染24 h后收集并裂解各組細胞，應用熒光素酶檢測試劑盒檢測相對熒光素酶活性。

1.9 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析檢驗，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞中miR-21、PTEN mRNA相對表達量比較 沉默組RC-4BC細胞中miR-21、PTEN mRNA相對表達量分別為0.30 ± 0.08、2.89 ± 0.14，陰性對照組RC-4BC細胞中miR-21、PTEN mRNA相對表達量分別為1.01 ± 0.02、0.99 ± 0.03，兩組相比，P均＜0.05。

2.2 兩組細胞增殖能力比較 沉默組RC-4BC細胞24 h、48 h、72 h時OD值分別為0.40 ± 0.11、0.77 ±0.13、1.51 ± 0.15，陰性對照組RC-4BC細胞24 h、48 h、72 h時OD值分別為0.69 ± 0.08、1.50 ± 0.18、2.81 ± 0.26，兩組相比，P均＜0.05。

2.3 兩組細胞集落形成數目比較 沉默組RC-4BC細胞集落形成數為（108 ± 18）個，陰性對照組RC-4BC細胞集落形成數目為（215 ± 29）個，兩組相比，P＜0.05。

2.4 兩組細胞凋亡率比較 沉默組RC-4BC細胞凋亡率為22.30% ± 5.64%，陰性對照組RC-4BC細胞凋亡率為5.59% ± 2.08%，兩組相比，P＜0.05。

2.5 兩組細胞周期分布情況比較 沉默組RC-4BC細胞G0/G1期占比65.65% ± 7.82%、S期占比19.25% ± 3.70%，陰性對照組RC-4BC細胞G0/G1期占比45.62% ± 5.03%、S期占比35.72% ± 4.67%，兩組相比，P均＜0.05。

2.6 miR-21與PTEN的靶向關系驗證結果miR-21 mimics+PTEN-WT組、NC-mimics+PTEN-WT組、miR-21 mimics+PTEN-MUT組、NC-mimics+PTEN-MUT組細胞的相對熒光素酶活性分別為0.39 ± 0.07、1.02 ± 0.03、1.01 ± 0.04、1.00 ±0.03，其中miR-21 mimics+PTEN-WT組相對熒光素酶活性與其他各組相比，P均＜0.05，提示miR-21的靶基因是PTEN。

3 討論

垂體瘤是常見顱內腫瘤之一，影響患者的生長發育、生殖、學習和工作能力。由于其復雜的發病機制，垂體瘤的治療是一個臨床難題。目前垂體瘤的治療通常包括手術、藥物和放射治療，這些治療方法的目的是減少或消除腫瘤占位性病變的影響，糾正腫瘤分泌過多的激素，并保持正常的垂體功能。然而，垂體瘤手術后的復發率很高，還可能會導致尿崩癥、腦脊液滲漏、視力障礙惡化和腦癱等手術后并發癥。因此，探索調控垂體瘤細胞生長的基因通路，開發新的有效治療方法很重要。

miRNA是一種內源性非編碼小分子RNA，在各種疾病的發生和發展過程中發揮著重要作用。隨著測序技術的發展，已經發現了大量的miRNA與腫瘤細胞的生長有關。miRNA被認為有望成為診斷和治療各種疾病的新靶點。2005年BOTTONI等［9］人首次研究并報道了垂體瘤和miRNA之間的相關性，發現miR-15a和miR-16-1在垂體瘤中的表達水平較正常垂體組織低。近年來相繼研究［10］發現許多miRNA可能與垂體瘤的發生發展有關，但目前研究尚沒有發現在垂體瘤發生進展中起關鍵作用的miRNA。miR-21是近年來發現的與細胞生長、發育和衰老等生命過程有關的miRNA家族成員之一，在腫瘤的生長中可能起著重要作用［11］。在腫瘤細胞的研究［12］顯示，miR-21在大多數腫瘤中表達上調，具有促進腫瘤細胞生長及轉移的高致癌特性，并且與腫瘤的化療耐藥有關。近期AMARAL等［5］發現，垂體瘤手術樣本中miR-21的表達明顯高于從尸檢中獲得正常垂體組織標本。郝良超等［6］還發現，在侵襲性垂體瘤患者瘤組織和血漿中miR-21的表達水平明顯高于非侵襲性垂體瘤患者。但目前有關miR-21在垂體瘤中的研究仍較少，并且其作用機制并不明確。為了探討miR-21在垂體瘤發生發展中的可能的作用機制，本研究通過脂質體轉染技術，成功沉默了miR-21表達水平最高的垂體瘤細胞系RC-4BC細胞中miR-21的表達水平，通過CCK-8實驗、平板克隆實驗、流式細胞術等實驗介紹發現，沉默miR-21表達的RC-4BC細胞，24、48、72 h時OD值明顯下降，集落形成能力明顯降低，細胞凋亡率、細胞周期G0/G1占比明顯升高，S期占比明顯下降，說明沉默miR-21表達能夠抑制垂體瘤細胞的增殖，并促進其細胞凋亡。

通過調控下游靶基因的轉錄或翻譯，從而影響靶基因的功能，是目前發現的miRNA調控的主要機制。PTEN位于人染色體10q23.31染色體上，是目前研究較多的公認的抑癌基因之一，PTEN通過不同的機制發揮著調控腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、轉移等多個過程［13］。目前有關PTEN在垂體瘤中的研究較多，研究［14-16］發現垂體瘤組織中PTEN的表達明顯降低，并且與垂體瘤的侵襲性相關。大量的研究［17-20］已經證實，過表達垂體瘤細胞中PTEN基因，可顯著抑制瘤細胞的增殖及遷移侵襲能力，并能夠促進瘤細胞的凋亡。本研究中，我們通過RT-PCR檢測發現，沉默miR-21表達的垂體瘤細胞中PTEN mRNA的表達明顯升高，雙熒光素酶報告基因顯示miR-21能夠靶向PTEN基因從而影響熒光素酶活性，提示沉默miR-21表達對垂體瘤細胞生長的影響可能與其對PTEN基因的靶向調控有關。

綜上所述，沉默miR-21能夠抑制垂體瘤細胞增殖活性及集落形成能力，將細胞周期阻滯于G0/G1期，并誘導其凋亡，其機制可能與其對PTEN基因的靶向調控有關，為垂體瘤的治療提供了新的研究思路。