miR-135a-5p通過調控CXCL12表達降低嗎啡耐受

何華美，陸 巍

1.貴州醫科大學 麻醉學院，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫科大學附屬醫院 疼痛科，貴州 貴陽 550000

嗎啡是臨床上治療重度癌痛的“金標準”藥物[1],然而長期使用會形成嗎啡耐受(morphine tolerance,MT),主要表現為隨著嗎啡的使用出現鎮痛效果下降或需要增加劑量才能維持原有的鎮痛效能,這會導致患者使用依從性下降,陷入鎮痛控制不佳及副作用增加的惡性循環[2]。目前MT的具體機制仍然未知,了解MT的分子機制,尋找新的治療靶點至關重要。研究顯示MT模型中CXC趨化因子配體12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)水平顯著上調[3],中腦導水管周圍灰質內注射高劑量CXCL12可降低阿片類藥物的鎮痛作用[4]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一種小的非編碼的內源性RNA,可與靶mRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)的特定互補序列結合,從而調控細胞轉錄和蛋白編碼翻譯。研究表明miRNA在轉錄后水平介導MT的發展[5],長期使用嗎啡會引起某些miRNAs表達變化,這些miRNAs與μ阿片受體(μ opioid receptor,MOR) mRNA的3′-UTR互補結合以阻止MOR的翻譯,導致MOR生物合成降低,最終導致嗎啡耐受[5]。既往研究表明miR-135a-5p調控CXCL12影響心肌梗死后的炎性反應和細胞凋亡[6],但在MT模型中尚無文獻報道。本研究通過建立嗎啡耐受小鼠模型,以探討miR-135a-5p靶向Cxcl12對MT的影響及機制,為預防及治療MT提供新見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級健康雄性6～8周C57BL/6J小鼠64只,體質量18～22 g,尾部完好,小鼠均購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證編號:SCXK(京)2019-0010。所有小鼠均飼養于貴州醫科大學動物實驗中心,飼養條件:12 h循壞燈光,溫度20～24 ℃,濕度50%～70%,給予動物標準飼料并自由飲水。本實驗所有操作均符合動物倫理要求,并通過貴州醫科大學動物實驗倫理委員會批準(倫理審查表編號:2201404)。

1.1.2 細胞來源:人胚胎腎母細胞HEK 293T購自長沙市檀溪生物科技有限責任公司。

1.1.3 主要試劑:CXCL12-siRNA、NC-siRNA、miR-agomir、miR-NC、LV-CXCL12、LV-control[慢病毒(lentivirus,LV)上海吉瑪制藥技術有限公司合成];CXCL12抗體(Abcam公司,ab275879);β-actin抗體(proteintech公司,81115-1-RR);辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(Merck Millipore公司);鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司);雙熒光素酶檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,RG021S);總RNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司);實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:采用隨機數字表法將64只小鼠分為:1)對照(NS)組、2)嗎啡耐受(MT)組、3)CXCL12沉默(CXCL12-siRNA)組、4)沉默陰性對照(NC-siRNA)組、5)miR-135a-5p 激動劑(miR-agomir)組、6)激動劑陰性對照(miR-NC)組、7)miR-135a-5p 激動劑+CXCL12過表達(miR-agomir+LV-CXCL12)組、8)miR-135a-5p 激動劑+過表達陰性對照(miR-agomir+LV-control)組。處理:1)組全程每日大腿內側皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液給藥,30 min后進行行為學測試。2)組全程每日大腿內側皮下注射嗎啡(0.1 mg/mL)10 mg/kg 1次,注射完畢后30 min進行行為學測試。3)組和4)組第1～3日大腿內側皮下注射嗎啡(0.1 mg/mL)10 mg/kg 1次,行為學測試完成后分別鞘內注射CXCL12-siRNA(5 pmol/μL)5 μL、NC-siRNA(5 pmol/μL)5 μL;5)組和6)組第1～3日大腿內側皮下注射嗎啡(0.1 mg/mL)10 mg/kg 1次,行為學測試完成后分別鞘內注射miR-agomir(20 pmol/μL)5 μL、miR-NC(20 pmol/μL)5 μL;7)組和8)組第1～3日大腿內側皮下注射嗎啡(0.1 mg/mL)10 mg/kg 1次,行為學測試后鞘內注射miR-agomir (20 pmol/μL)5 μL,第4～6日行為學測試后分別鞘內注射LV-CXCL12(1×108TU/L)5 μL、LV-control(1×108TU/L,TU:transducing unit)5 μL。所有分組小鼠均于第7日給藥完畢后處死,取L4～L5脊髓組織-80 ℃保存待檢。

1.2.2 鞘內注射:小鼠在2%七氟烷麻醉狀態下,定位L5～L6棘突間隙作為穿刺點,左手拇指和中指握住小鼠髂嵴以定位L6的棘突,同時向外繃緊皮膚,右手持微量注射器插入L5和L6椎骨的凹槽之間,尾部輕彈表明針頭成功進入硬膜下間隙。當尾巴輕彈時,用另一只手緩慢地將agomir或siRNA 5 μL遞送到鞘內空間。注射完畢后針頭在穿刺點滯留1 min后拔出,用酒精棉球對穿刺點進行消毒。

1.2.3 行為學測試:參照文獻[7],每次給藥后30 min把小鼠尾部末端1/3放入恒溫的熱水中(52±0.5)℃,用秒表記錄從小鼠尾部入水到開始甩尾的時間(test tail flick latency,TL),連續測定3次,兩次間隔5 min。取實驗開始前1日的3次潛伏期的平均值作為基礎甩尾潛伏期(basal tail flick latency,BL)。如果小鼠在10 s內不甩尾則將尾部拿離熱水,將潛伏期定為10 s(cut-off time)。當TL恢復至基礎水平可認為已產生耐受。計算最大效應分率%MPE(percent of maximal potential effect)用以表示藥物對疼痛反應的影響。%MPE=(TL-BL)/(cut-off time-BL)×100。

1.2.4 RT-qPCR檢測脊髓組織中CXCL12、miR-135a-5p mRNA表達水平:TrizolTM試劑提取L4～L5脊髓組織中總RNA,按照反轉錄試劑盒合成 cDNA,參照RT-qPCR 試劑盒說明書進行 RT-qPCR 反應。根據2-△△Ct法計算各組CXCL12、miR-135a-5p mRNA 相對表達量。引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers of RT-qPCR

1.2.5 Western blot 檢測脊髓組織中CXCL12、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62蛋白表達:脊髓組織中加入裂解液提取各組蛋白,使用BCA試劑盒檢測蛋白質總濃度,依次進行電泳、轉膜、封閉。加入適宜濃度的CXCL12、LC3、p62一抗于 4 ℃ 冰箱孵育過夜,PBS 清洗后,再加入二抗室溫孵育 2 h,PVDF膜用增強型化學發光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)進行化學發光反應,Image J 軟件測定各顯色條帶的灰度。以β-actin為內參,分析目的蛋白質的表達水平,用 LC3-Ⅱ和 LC3-Ⅰ的灰度值比值做為 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值結果。

1.2.6 生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因實驗驗證 miR-135a-5p與CXCL12關系:利用生物信息學預測工具 TargetScan (http://www.targetscan.org/vert _71/)預測 miR-135a-5p和CXCL12的結合位點。設計合成含有 CXCL12 3′-UTR 野生型 (CXCL12-Wt) 或突變型 (CXCL12-Mut) 片段的psicheck2-CXCL12 3′-UTR 重組報告質粒。將質粒與miR-135a-5p mimic或NC mimic共轉染至 HEK-293T 細胞中,設置分組為 miR-135a-5p mimics+CXCL12 Wt組、 mimics-NC+CXCL12 Wt組、 miR-135a-5p mimics+CXCL12 Mut組和 mimics-NC+CXCL12 Mut組,48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 嗎啡耐受模型的建立

皮下注射嗎啡后MT組的%MPE顯著高于同時間點的NS組(P<0.05)(圖1A),隨著嗎啡給藥時間的延長,MT組的%MPE逐漸降低,直至第7天恢復至基線值(圖1A)。與對照組相比,模型組小鼠L4～L5脊髓CXC12的mRNA、蛋白表達較對照組均升高(P<0.05)(圖1B～D),而miR-135a-5p表達下顯著降(P<0.05)(圖1E)。

A.the percent of maximal potential effect (MPE) in the two groups; B.relative expression of CXCL12 mRNA in the two groups; C,D.Western blot assay of CXCL12 in the two groups;E.relative expression of miR-135a-5p in the two groups;NS: normal saline group;MT: morphine tolerance group;*P<0.05 compared with NS.

2.2 下調CXCL12表達可緩解嗎啡耐受小鼠的熱痛刺激

相比于NC-siRNA組,CXCL12 siRNA組CXCL12 mRNA及蛋白水平均下降(P<0.05)(圖2A～C)。溫水甩尾法測試結果顯示,連續皮下注射嗎啡后,NC-siRNA組%MPE逐漸減低,第7天恢復至基線值。然而,CXCL12-siRNA 組%MPE從第3天開始高于同時點的NC-siRNA組(P<0.05)(圖2D)。

A.relative expression of CXCL12 mRNA in the two groups; B,C.Western blot assay of CXCL12 in the two groups;D.the percent of maximal potential effect (MPE) in the two groups;CXCL12-siRNA:silence CXCL12 group;NC-siRNA: negative control group of CXCL12-siRNA;*P<0.05 compared with NC-siRNA.

2.3 上調miR-135a-5p可緩解嗎啡耐受小鼠的熱痛刺激

與miR-NC組相比,miR-agomir組miR-135a-5p 表達明顯升高(P<0.05)(圖3A)。連續皮下注射嗎啡后,miR-NC組%MPE升高,但在第7天降至基線值。與miR-NC組相比, miR-agomir組%MPE從第2天開始升高(P<0.05)(圖3B),持續至第7天。與miR-NC組相比,miR-agomir組CXCL12 mRNA、蛋白表達下降(P<0.05)(圖3C～E)。

A.relative expression of miR-135a-5p in the two groups; B.the percent of maximal potential effect (MPE) in the two groups; C.relative expression of CXCL12 mRNA in the two groups;D,E.Western blot assay of CXCL12 in the two groups; miR-agomir: overexpression miR-135a-5p group;miR-NC.negative control group of miR-agomir;*P<0.05 compared with miR-NC.

2.4 Cxcl12與miR-135a-5p的靶向關系

生物信息學預測到 miR-135a-5p和Cxcl123′-UTR存在結合位點(圖4A)。miR-135a-5p過表達顯著降低了含有預測的野生型Cxcl123′-UTR質粒相對熒光素酶活性(P<0.05)(圖4B),而在Cxcl123′-UTR翻譯區含有突變結合位點的質粒未觀察到該效應。

A.prediction of the targeting relationship between miR-135a-5p and Cxcl12 3′-UTR; B.dual-luciferase reporter gene assay to detect the targeting relationship between miR-135a-5p and Cxcl12; miR-135a-5p mimic: over-expression miR-135a-5p group;mimic NC.negative control group of miR-135a-5p mimic;Wt.wide type;Mut.mutant; *P<0.05 compared with mimic NC.

2.5 miR-135a-5p通過CXCL12緩解小鼠熱痛刺激

與agomir+LV-control組相比,agomir+LV-CXCL12組的CXCL12 mRNA與蛋白表達均顯著上升(P<0.05)(圖5A～C)。溫水甩尾法測試結果顯示,與agomir+LV-control組相比,agomir+LV-CXCL12組 %MPE從第4天開始下降(P<0.05)(圖5D)。

A.relative expression of CXCL12 mRNA in the two groups; B,C.Western blot assay of CXCL12 in the two groups;D.the percent of maximal potential effect (MPE) in the two groups; miR-agomir: overexpression miR-135a-5p;LV-CXCL12: overexpression CXCL12;LV-control: negative control of LV-CXCL12; *P<0.05 compared with miR-agomir+LV-control.

3 討論

在中重度癌痛患者中嗎啡使用率占89.7%,1周內出現嗎啡増量的占35.1%,2個月內出現嗎啡增量的達 71.4%[8]。隨著嗎啡耐受的發生發展,為達到滿意的鎮痛效果,患者需不斷增加嗎啡劑量,然而劑量的增加不僅會加速耐受的形成,還會提升不良反應的發生,造成惡性循環[9]。故除了疾病本身進展導致疼痛以外,阿片藥物耐受也是目前最亟待解決的難點,尋求預防及治療嗎啡耐受的方法,對提高癌痛嗎啡耐受患者的生活質量有重要意義。既往研究認為MT與MOR的內吞、脫敏、下調;阿片受體亞型的異聚化;細胞內信號分子及信號通路的改變和神經炎性反應等機制相關[10-11],但目前仍無統一定論。

嗎啡耐受通常與痛覺過敏同時出現,并且兩者的發生機制十分相似,故可通過使用無痛生理狀態下動物建立疼痛模型,測試其痛閾的變化,根據疼痛閾值下降這一特征性表現來表征嗎啡耐受[12-13]。CXCL12是CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)唯一的配體,研究表明CXCR4與MOR在疼痛傳遞的神經解剖結構中共定位,包括背根神經節、脊髓背角和中腦導水管周圍灰質,用CXCR4拮抗劑預處理能顯著增強嗎啡鎮痛[14]。本研究建立嗎啡耐受小鼠模型,檢測了嗎啡耐受小鼠脊髓組織中CXCL12的表達,結果發現CXCL12表達升高,敲低Cxcl12表達可緩解嗎啡耐受小鼠的熱痛覺刺激,這與先前的研究一致。

為明確CXCL12的調控機制,本研究基于microRNA作用機理進行了進一步的預測和研究,利用生物信息學網站預測發現Cxcl12的3′-UTR與miR-135a-5p存在結合位點,最終選擇miR-135a-5p作為Cxcl12的上游研究對象。既往文獻報道miR-135a-5p在骨癌痛小鼠疼痛中起到重要作用[15],故有理由推測miR-135a-5p參與嗎啡耐受的發生,本研究檢測發現嗎啡耐受小鼠脊髓中miR-135a-5p表達水平下降,增加miR-135a-5p表達可緩解MT小鼠的熱痛刺激,從而減緩耐受形成。為驗證CXCL12與miR-135a-5p的靶向關系,本研究檢測了過表達miR-135a-5p的模型組織中CXCL12的表達,發現過表達miR-135a-5p可導致CXCL12表達下降,說明它們存在負向調控關系。此外,進行了雙熒光素酶基因實驗,結果證實了Cxcl12是miR-135a-5p的下游靶基因。為驗證CXCL12對嗎啡耐受的影響是受miR-135a-5p的調控的,進行了回復驗證實驗,結果顯示,miR-135a-5p對嗎啡耐受小鼠的熱痛保護作用可以被CXCL12的過表達所消除。

綜上所述,本實驗初步明確了miR-135a-5p能靶向調控CXCL12的表達從而減緩嗎啡耐受的形成,為尋求嗎啡耐受潛在的機制提供新的見解,并為嗎啡耐受的臨床治療提供潛在的靶點。