褪黑素抑制H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化應激及凋亡標志蛋白質的表達

楊瀚毅，寧佳怡，汪小蘭，張益萌，謝婷珂1，，陳奕玄1，，韓 靜*

1.西安醫學院 眼科學教研室，陜西 西安 710068；2.空軍軍醫大學第二附屬醫院 眼科，陜西 西安 710038

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是一種導致失明的嚴重并發癥,是成人失明的主要原因[1],但其發病機制尚不清楚。目前,氧化應激(oxidative stress, OS) 導致內皮受損被認為是DR中血管功能異常的重要因素[2]。H2O2是一種常見的氧活性物質(reactive oxygen species, ROS),其可以在內皮細胞(endothelial cells,ECs)中產生或外源性添加[3]。H2O2可以誘導ECs的氧化應激,這導致了一系列的負面結果,如ECs的凋亡、壞死、老化、增殖受抑制、黏附分子表達增加、一氧化氮合成減少等[4-5]。褪黑素(melatonin,MT)具有很強的抗氧化作用,可以清除ROS和氮活性物質(reactive nitrogen species, RNS),保護細胞免受氧化物的侵害[6]。MT調節氧化應激在衰老疾病中已經有廣泛研究[7],有研究表明MT可能通過超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase,SOD2)發揮抗氧化功能[8],但MT對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中氧化應激的調控的機制研究還尚未見報道。因此,該研究旨在探究MT抑制H2O2誘導的HUVECs氧化應激的機制,以及對凋亡標志蛋白質表達的影響,從而為探索糖尿病視網膜病變的新治療靶點提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內皮細胞系(HUVECs)(美國標準生物品收藏中心);DMEM/F12 培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素(Gibico公司);CCK8試劑盒、活性氧物質(reactive oxygen species,ROS)染色試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)檢測試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA) 檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司); p65抗體、p-p65抗體、cleaved-caspase3抗體(Cell Signaling Technology公司);SOD2抗體(武漢三鷹生物技術有限公司);β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司);BCA 試劑盒和酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)和MT(Cayman chemical公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:將細胞分為分為對照組(control),H2O2組:先用CCK8法確定H2O2損傷細胞的濃度依賴曲線,選用400 mmol/L處理48 h,和MT干預H2O2組:同時加入1 mmol/L MT[9]。HUVECs單層培養于含 10%胎牛血清和雙抗的DMEM/F12 培養基中,培養箱溫度為 37 ℃、CO2濃度為 5%。當細胞處于對數增殖期時(匯合度大約為 80% ～90%),進行傳代和鋪板。

1.2.2 CCK8法檢測細胞活性:將 6×103細胞接種在 96 孔板中一個孔內,等待細胞密度達到約 80%后進行實驗:用 H2O2(100、200、300、400、600、700 mmol/L)的不同濃度處理48 h后,換上完全培養基培養 24 h,根據IC50,確定模型濃度,實驗結束后,在每孔中加入 10 μL CCK-8,37 ℃孵育2 h,在酶標儀中以450 nm波長測定吸光度(A)值。每組設置5個復孔,重復3次。

1.2.3 光學顯微鏡觀察細胞形態:倒置顯微鏡(上海尼康精機有限公司)觀察control組和H2O2組細胞形態與生長狀態,并進行鏡下拍照。

1.2.4 Western blot檢測各蛋白質表達水平:將各組細胞培養和處理后,用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的中性裂解液在冰上裂解細胞,用BCA法測定蛋白質濃度,每組取30 μg蛋白質進行SDS-PAGE電泳和轉膜操作,用5%牛奶封閉膜后,在4 ℃過夜孵育一抗( p-p65、p65、SOD2、cleaved-caspase 3和β-actin均為1∶ 1 000)。第2天,用TBST洗膜3次,每次8 min,再用相應的二抗在室溫下孵育1.5 h。洗膜后,用ECL顯色液檢測信號,重復實驗3次。

1.2.5 ROS染色檢測細胞內活性氧的含量和分布情況:將各組細胞在共聚焦皿中培養和處理后,去除培養基,用PBS洗滌3次,加入無血清培養基稀釋的DCFH-DA探針(最終濃度為10 μmol/L),在細胞培養箱中孵育25 min,再用PBS洗滌3次,進行熒光觀察。實驗重復3次。

1.2.6 試劑盒檢測SOD活性和MDA、CAT濃度:將各組細胞在10 cm培養皿中培養和處理后,收集各組細胞蛋白質,并按照相應試劑盒的操作說明進行處理。用酶標儀設定不同波長(SOD:450 nm;MDA:532 nm;CAT:520 nm),讀取各孔的A值,并計算結果。

2 結果

2.1 H2O2誘導HUVECs氧化應激損傷模型的濃度

如圖1所示,CCK8結果顯示,與對照組相比,100 mmol/L(88.30±8.48)、200 mmol/L(72.35±8.50)、300 mmol/L(69.09±7.24)、400 mmol/L(47.88±5.88)、500 mmol/L(47.88±5.88)、600 mmol/L(16.91±1.01)和700 mmol/L(13.82±1.32)的H2O2造成HUVECs的活性呈濃度依賴性的降低。根據IC50416.8,選擇400 mmol/L的濃度進行造模(圖1)。

A.measure the absorbance values of HUVECs treated with different concentrations of H2O2 at 450 nm, the x-axis represents the concentration of H2O2, and the y-axis represents the absorbance value at 450 nm; B.the x-axis represents the logarithm of the H2O2 concentration, and the y-axis represents the cell survival rate.

2.2 H2O2誘導HUVECs形態變化

與對照組相比,在用400 mmol/L H2O2處理48 h后,HUVECs形態發生了變化,明顯回縮,由鋪路石樣變為梭形和長條形。同時,活細胞的比例也顯著下降,漂浮細胞明顯增多(圖2)。

Control group; H2O2 group: 400 mmol/L H2O2 treatment for 48 hours.

2.3 MT降低了H2O2誘導的氧化應激反應與凋亡標志物的表達

H2O2組細胞中p-p65/p65(1.15±0.02)、cleaved-caspase 3(0.91±0.04)的表達水平明顯高于對照組(p-p65/p65:0.81±0.03,cleaved-caspase 3:0.60±0.03 )(P<0.001),而SOD2(0.66±0.01)的表達水平明顯低于對照組(0.84±0.10)(P<0.05)。相較于H2O2組,H2O2+MEL組細胞中SOD2(1.02±0.06)的表達水平顯著上升(P<0.001),而p-p65/p65(0.73±0.04)(P<0.001)、cleaved-caspase 3(0.69±0.04)(P<0.01)的表達水平顯著下降(圖3)。

The expression of p-p65, p65, SOD2 and cleaved-caspase 3 in control, H2O2 and H2O2+MT group; The expression of p-p65/p65 in control and H2O2 group; **P<0.001 compared with control group; The expression of p-p65/p65 in H2O2 and H2O2+MT group; ##P<0.001 compared with H2O2 group; The expression of SOD2 in control and H2O2 group; *P<0.05 compared with control group; The expression of SOD2 in H2O2 and H2O2+MT group; ##P<0.001 compared with H2O2 group; the expression of cleaved-caspase 3 in control and H2O2 group; **P<0.001 compared with control group; The expression of cleaved-caspase 3 in H2O2 and H2O2+MT group; #P<0.01 compared with H2O2 group.

2.4 MT降低了H2O2引起的ROS含量增多

H2O2組(6.38±2.25)細胞中綠色熒光的強度明顯高于對照組(38.99±3.27)(P<0.001),說明細胞內活性氧的含量顯著增加。而MT處理(4.47±1.11)能有效降低綠色熒光的強度(P<0.001),表明MT能減少細胞內活性氧的產生(圖4)。

Fluorescence staining was used to detect the ROS levels in control, H2O2 and H2O2+MT group; The ROS levels in control and H2O2 group; *P<0.001 compared with control group; The ROS levels in H2O2 and H2O2+MT group; #P<0.001 compared with control group.

2.5 MT處理氧化應激損傷的HUVECs后檢測SOD活性和CAT、MDA濃度

與對照組相比, H2O2組的SOD活性(0.20±0.02)(P<0.001)和CAT濃度(2.72±0.68)(P<0.01)明顯低于對照組(SOD:0.55±0.03,CAT:5.86±0.56),MDA濃度(6.12±0.23)明顯高于對照組(2.57±0.24)(P<0.001)。而相較于H2O2組,MT處理能夠有效改善氧化應激狀態,提高SOD活性(0.42±0.03)(P<0.001)與CAT濃度(4.62±0.93)(P<0.05),降低MDA濃度(3.20±0.40)(P<0.001)(圖5)。

Detection of SOD activity, MDA, and CAT content using kits in control group, H2O2 group and H2O2+MT group; The SOD activity in control and H2O2 group; **P<0.001 compared with control group; The SOD activity in H2O2 and H2O2+MT group; ##P<0.001 compared with control group; The MDA concentration in control and H2O2 group; **P<0.001 compared with control group; The MDA concentration activity in H2O2 and H2O2+MT group; ##P<0.001 compared with control group; The CAT concentration in control and H2O2 group; *P<0.01 compared with control group; The CAT concentration activity in H2O2 and H2O2+MT group; #P<0.05 compared with control group.

3 討論

糖尿病視網膜病變目前仍是全球勞動適齡人口失明的主要原因之一。由于其發病機制尚未明確,目前的治療手段也存在諸多局限性,主流的注射抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物的治療手段可能會由于內皮細胞突變和血管重塑等原因導致一部分患者對其產生耐藥[10]。因此,研究新的有效的靶點及藥物治療手段不僅能夠為患者提供新的治療選擇,也對進一步明確糖尿病視網膜病變的發病機制具有重要意義。

氧化應激導致的血管受損嚴重影響著眼部血管的健康,特別是在糖尿病視網膜病變中發揮重要的作用[11]。MT已經在衰老疾病領域中展現出不俗的抗氧化能力。有研究表明,MT能夠改善楓糖尿病中神經系統氧化應激引起的記憶障礙[12]。同時,MT也能夠抑制凋亡相關因子的釋放和表達,達到抗凋亡的目的[13]。但是,MT對氧化應激的作用機制還尚未明確,以及MT調控HUVECs中氧化應激的機制也鮮有報道。該研究用MT處理H2O2介導的氧化應激損傷的HUVECs,觀察其氧化應激水平以及相關標志蛋白質的表達情況。研究結果表示,MT能夠上調H2O2介導的氧化應激SOD2的表達降低以及減少ROS的含量。SOD2作為一種重要的抗氧化劑,能直接在線粒體內清除ROS,避免線粒體受到氧化應激損傷。因此,MT介導的ROS含量減少可能是通過增加SOD2的表達實現的,除此之外,試劑盒檢測總SOD、MDA和CAT結果表示,MT能增加總SOD的活性以及CAT濃度,并減少MDA濃度。這些因子中,MDA在一定程度上反應氧化應激的水平,而CAT則是一種重要的抗氧化酶。該結果更說明了MT有強大的抗氧化能力。同時,MT減少了H2O2介導的p-p65/p65和cleaved-caspase表達升高。p-p65/p65能夠反應NF-κB通路的活性,其與炎性反應有著密切關系[14],而caspase 3是一種關鍵的凋亡執行因子,它可以被激活并裂解為cleaved-caspase 3發揮作用,促進細胞凋亡。總之,H2O2通過減少SOD2的表達,介導HUVECs的氧化應激損傷,同時增加了NF-κB通路的活性以及凋亡因子cleaved-caspase 3的表達,而MT能夠抑制這一過程。因此,MT有望成為糖尿病視網膜病變和其他氧化應激損傷和凋亡相關血管疾病的潛在治療方法。