糖尿病合并TREM2突變相關認知功能障礙的生物信息學分析

劉 瀟，王曌慧，魏心怡，周 玥，趙 麗，王 玥，3，李俊發*

1.首都醫科大學 基礎醫學院 神經生物學系，北京 100006；2.首都醫科大學附屬北京安定醫院 國家精神心理疾病臨床醫學研究中心 精神疾病診斷與治療北京市重點實驗室，北京 100088；3.首都醫科大學 人腦保護高精尖創新中心，北京 100069

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的主要臨床表現為認知功能障礙。糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病。AD和DM之間密切相關,研究發現,DM患者患有AD的風險增加[1],但具體分子聯系尚不清楚。

AD的全基因組關聯研究得出的髓系細胞觸發受體-2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)與神經變性病發生發展密切相關[2]。與此同時,有一些實驗發現TREM2和DM神經功能失調相關,本實驗室前期工作發現,第8和第15周DM小鼠前額葉皮層TREM2蛋白mRNA水平明顯增加[3]。以上研究提示TREM2可能是AD和DM的共同致病相關基因。

本研究在PubMed找到一個數據集GSE143951,展示了TREM2R47H突變AD患者iPSCs分化為神經元的基因表達情況。目前只在PubMed數據集檢索到GSE161355數據庫記錄了DM患者腦組織轉錄組的變化。本研究將兩個數據集聯合起來,探討了DM和AD認知功能障礙中TREM2突變相關的核心基因及可能的治療靶點,為DM合并AD患者治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:6～8周齡的SPF級雄性成年野生型(wild-type,WT)C57BL/6J小鼠和Trem2小膠質細胞特異性敲除(Trem2CKO)C57BL/6J小鼠,體質量18～22 g(北京維通利華實驗動物有限公司)。已經通過首都醫科大學倫理委員會審查(AEEI-2021-023)。

1.1.2 試劑:鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ購自Sigma Aldrich公司);血糖試紙(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司);SNAP25多克隆抗體(Proteintech公司);羊抗兔IgG抗體 (Thermo Fisher Scientific公司);羊抗鼠IgG抗體 (Jackson ImmunoResearch公司)。

1.2 方法

1.2.1 微陣列數據的收集:微陣列表達譜數據集GSE161355,GSE143951和 GSE36980從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載。其中微陣列數據集GSE161355基于平臺GPL570 ([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array);微陣列數據集GSE143951基于平臺GPL16043[ GeneChip?PrimeViewTMHuman Gene Expression Array(with External spikes-in RNAs)];微陣列數據集GSE36980基于平臺GPL6244 ([HuGene-1_0-st] Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array[transcript (gene) version])。GSE161355包含:糖尿病患者和健康人大腦皮層神經元,皮質星形膠質細胞和神經血管的內皮細胞的基因表達變化; GSE143951分組為:AD患者和健康人iPSCs的基因表達變化;GSE36980分組為:AD患者和健康人額葉皮層,海馬和顳葉皮層的基因表達變化。

1.2.2 差異表達的分析:采用在線分析工具GEO2R進行差異表達分析;在GSE131655中,比較DM患者和健康對照的表達譜來鑒定DEGs。在GSE143951中,通過比較TREM2中攜帶R47H突變的患者和正常對照個體的iPSCs的表達譜來鑒定DEGs。P值和調整后的P值采用t檢驗計算。保留每個樣本中符合以下標準的基因: 1)|log2(fold-change)|>1;2)調整后的P<0.05。根據細胞類型將GSE131655數據集分為3組。星形膠質細胞、內皮細胞和神經元分別獨立分析,3組的DEGs取交聯合集。使用在線工具Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制了DEGs的維恩圖。

1.2.3 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡分析:PPI網絡分析基于兩種疾病中DEGs共同改變的Venn圖結果,使用在線數據庫STRING (https://string-db.org/)。將交互得分>0.4作為閾值。此外,利用Cytoscape v3.6.0軟件對PPI網絡進行可視化和構建。與相鄰節點交互次數最多的節點稱為中心節點。使用Cytohubba鑒定該網絡中的核心基因。利用MCC(maximum Clique Centrality)算法,根據得到每個基因的度并排序,根據排序,將前4位確定為核心基因。MCODE(minimum Common Oncology Data Elements)算法用于識別顯著基因簇并獲得聚類得分(篩選標準:度截止值=2;節點評分截止值=0.2;k-core=2;最大深度=100)。最后,將所有結果相結合得到最終的核心基因。

1.2.4 Morris水迷宮:Morris水迷宮是檢測動物空間學習記憶能力的一種行為學方法。具體步驟參考文獻[4]的實驗方法。

1.2.5 Western blot檢測蛋白質表達:取小鼠大腦海馬組織,加入RIPA、蛋白酶抑制劑,磷酸酶抑制劑,研磨組織,超聲30個循環,每個循環持續30 s,間隔30 s,12 000×g,4 ℃,離心12 min,取上清,用BCA法測定蛋白質濃度,4 ℃一抗孵育過夜(稀釋比例均為1∶500),TBST清洗3次,室溫孵育二抗2 h,TBST清洗3次,顯影,Image J測定蛋白質吸光度值,以β-肌動蛋白(β-actin)為內參,計算蛋白質條帶吸光度值的比值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 差異表達基因的篩選

在本研究中,選擇了2種不同疾病的微陣列數據集,通過生物信息學方法探索2種疾病中起作用的DEGs及其顯著性。在GSE161355中,星形膠質細胞中有2 282個DEGs,1 145個上調和1 137個下調基因;內皮細胞中有2 682個DEGs,包括1 545個上調和1 137個下調基因;神經元中有993個DEGs,包括653個上調和340個下調基因。GSE143951共有19 152個DEGs,其中上調基因10 176個,下調基因8 976個。接下來,使用熱圖和火山圖來可視化2個微陣列數據集中的DEGs,如圖1A～H所示。此外,在2個數據集中,有53個DEGs在DM和AD之間重疊,其中14個基因上調共存,5個基因下調共存(圖1I)。

A-C.respective volcano plots of three different cell types in GSE161355; The red plots represented upregulated genes (logFC>1 and P<0.05); The black plots represented nonsignificant genes (|logFC|<1 or P>0.05)); The blue plots represented downregulated genes (logFC<-1 and P<0.05);D-F.respective heatmaps of three different cell types of DEGs in GSE161355; Red rectangles represented high expression; Blue rectangles represented low expression;G.volcano plot of GSE143951;The red plots represented upregulated genes (logFC>1 and P<0.05); The black plots represented nonsignificant genes (|logFC|<1 or P<0.05); The blue plots represented downregulated genes (logFC<-1 and P<0.05);H.heatmap of DEGs in GSE143951; Red rectangles represented high expression; Blue rectangles represented low expression;I.venn diagram of DEGs from two microarray datasets.

2.2 DEGs的PPI網絡分析

本實驗使用STRING對GSE161355和GSE143951中發現的19個共同改變的DEGs進行了PPI分析,并通過Cytoscape進行了可視化(圖2A)。通過MCC算法計算9個DEGs(圖2B)。使用MCODE插件識別基因簇模塊。在這個PPI網絡中,確定了一個得分為3.33的模塊(圖2C)。根據基因的秩分布和MCODE插件的計算結果,本實驗選擇了DNER、GFAP、GRM5、SNAP25作為核心基因,是PPI網絡中最重要的基因,可能在DM和AD中發揮重要作用。

A.based on the STRING online database, 8 DEGs were filtered into the DEGs PPI network; cytoscape network visualization of the 8 nodes and 8 edges; the nodes represented DEGs; the edges represented links between DEGs,Red represented upregulated genes; blue represented downregulated genes;B.based on cytohubba analysis Module 1 contained 8 nodes and 8 edges; different colors represented different rank of genes; C.based on Mcode analysis Module 2 which represented the most significant module from the PPI network contained 4 nodes and 5 edges.

2.3 4個核心基因在AD中的ROC曲線

通過網站(https://www.bioinformatics.com.cn)分析4個核心基因在GSE36980中,額葉皮質、海馬和顳葉皮質的表達譜,并繪制ROC曲線。曲線下面積(AUC)可以用來評價ROC曲線的凹凸程度。結果顯示,SNAP25在額葉皮層(AUC:0.764)(圖3D)和海馬(AUC:0.889)(圖3H)的診斷價值最高,而GFAP在顳葉皮層的診斷價值最高(AUC:0.840)。其他基因的診斷價值如下::在額葉皮層,DNER(AUC:0.692),GFAP(AUC:0.662),GRM5(AUC:0.582)(圖3A～C);在海馬區,DNER(AUC:0.521)、GFAP(AUC:0.643)、GRM5(AUC:0.809)(圖3E～G);在顳葉皮層,DNER(AUC:0.676),GRM5(AUC:0.818),SNAP25(AUC:0.800)(圖3I～L)。由于SNAP25在額葉皮質和海馬中均具有良好的診斷性能,假設SNAP25可能是額葉皮質和海馬中DM和AD的生物標志物。

A-D.ROC curve of 4 hub genes in frontal cortex;E-H.ROC curve of 4 hub genes in hippocampus;I-L.ROC curve of 4 hub genes in temporal cortex;AUC area under the ROC curve; X-axis showed the 1-specifity and Y-axis showed the Sensity of each gene;M.Western blot showed the expression of SNAP25 in hippocampus of mice in each group;N.relative quantitative analysis of the total amount of SNAP25 in hippocampus of mice in each group;n=6-7; control.wild normal mice; DM.wild diabetes mice; DM+TREM2-/-.TREM2 CKO diabetes mice; *P<0.001 compared with each group.

2.4 Trem2敲除加重T1DM小鼠空間學習記憶障礙

與正常對照組相比,DM小鼠血糖和體質量水平在STZ注射后第2周開始分別升高和降低。說明DM小鼠模型構建成功(圖4A,B)。STZ注射后8周通過Morris水迷宮測試發現與正常對照組小鼠相比,DM小鼠在水中找到平臺的潛伏期明顯延長(圖4C),在平臺所在象限游動所占時間百分比明顯減少(圖4D),游泳路徑較為混亂(圖4E)。Trem2敲除DM小鼠在學習記憶階段潛伏期更長(圖4C),平臺所在象限所占時間百分比更少(圖4D),游泳路徑更加混亂(圖4E)。同時,為了排除小鼠游動速度和小鼠個體視力差異對實驗結果的影響,統計各組小鼠每天的游泳速度發現差異均無統計學意義(圖4G),另外在實驗的第9天,通過可視平臺測試各組小鼠的視力情況,發現各組間差異均無統計學意義(圖4F),說明DM小鼠出現的空間學習記憶功能障礙不會受到逃逸動機及感覺運動能力的影響。

A.changes of blood glucose in each group of mice at different periods; B.weight changes in each group; C.Morris water maze escape latency of mice in each group; D.the percentage of swimming time in each quadrant after the platform was removed on day 7 of the Morris water maze test; E.swimming tracks of mice in each group on day 7 of Morris water maze test; F.the escape latency of mice in each group was tested by visual platform on day 9 of the Morris water maze experiment; G.the average daily swimming speed of each group of mice in the Morris water maze experiment;CON+TREM2+/+.wild normal mice; CON+TREM2-/-.TREM2 CKO mice; DM+TREM2+/+.diabetes mice; DM+TREM2-/-.TREM2 CKO diabetes mice; n=6; *P<0.05, **P<0.001 compared with the normal control group.

2.5 DM小鼠海馬SNAP25表達增加,TREM2影響DM小鼠海馬SNAP25的表達

得到SNAP25為核心基因后,本研究利用DM WT和DMTrem2敲除小鼠,應用Western blot,檢測了DM小鼠第8周時海馬區SNAP25表達的變化。結果表明,DM小鼠海馬區SNAP25表達明顯增加,特異性敲除小膠質細胞Trem2的DM小鼠海馬區SNAP25表達顯著降低(圖3M,N)。

3 討論

TREM2在DM和認知功能障礙中兩個疾病之間的聯系和潛在的作用靶點尚不清楚。在本研究中所納入的兩個數據庫分別涵蓋了DM患者腦組織和TREM2R47H突變AD患者神經元基因的表達變化。

在本研究獲取的4個核心基因中,結合本實驗后續的ROC曲線驗證和疾病相關生物過程關聯的結果,SNAP25相較于其它3個基因更具有較大的研究潛力,它是一種在神經元中特異高表達的突觸前膜蛋白。SNAP25在遲發性AD患者的腦脊液中明顯升高。也有實驗發現SNAP25多態性在DM中發揮一定作用[5]。但有趣的是,有實驗發現AD患者大腦皮層、海馬等特定區域突觸喪失,SNAP25的表達顯著降低[6]。本實驗顯示在DM小鼠大腦海馬區域SNAP25蛋白表達水平與生物信息學分析結果相一致。Trem2敲除后表達降低提示TREM2可能上調SNAP25的表達,其具體的作用機制還需后續實驗進一步探索。總之,結合以上研究,本研究結果提示TREM2有可能通過上述核心基因參與DM認知功能障礙。

綜上所述,本研究成功篩選出與DM合并TREM2突變相關認知功能障礙的4個核心基因,這為治療DM認知功能障礙提供了新的靶點。這項研究同時也存在了一些不足,目前尚未檢索到TREM2突變DM患者的數據庫,因此隨著數據庫的擴大,后續還需要進一步的實驗探索。