腫瘤壞死因子受體3 相互作用蛋白2與心房顫動相關性的臨床研究

耿金 李濤 李偉 袁國良 王丙劍 章延春

隨著人口的老齡化以及心血管疾病患者的增多，心房顫動（下稱房顫）的發病率日益升高，其致死、致殘率較高，極大影響患者的生活質量及生存率，同時增加家庭、社會的經濟負擔[1-2]。目前認為房顫是一種慢性炎癥性疾病，以心房纖維化為主要特點，伴隨心房電活動和結構的紊亂。盡管關于房顫的研究很多，但其具體發病機制仍不詳，臨床中也缺乏有效的生物學標志物來預測其發病風險。腫瘤壞死因子受體3 相互作用蛋白2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 interacting protein 2，TRAF3IP2）調節多種炎癥因子信號通路，在動脈粥樣硬化以及易損斑塊的形成中發揮重要作用[3]。近來有研究表明，TRAF3IP2 在小鼠心肌肥大和缺血再灌注模型中與心肌纖維化有因果關系[4-5]。本研究旨在探討TRAF3IP2 與房顫的相關性，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2021 年6 至12 月南京醫科大學附屬淮安第一醫院收治的瓣膜性心臟病患者41 例，其中男17 例，女24 例，年齡40～76（58.68±10.70）歲。根據是否合并房顫，分為房顫組（22 例）和非房顫組（19 例）；其中有8 例患者轉至心臟外科行瓣膜置換或修復手術，房顫患者5 例，非房顫患者3 例。入選標準：（1）心臟彩超明確診斷為瓣膜性心臟病；（2）紐約心臟病協會（New York Heart Association，NYHA）心功能分級Ⅱ～Ⅲ級；（3）年齡＜80 歲。排除標準：（1）急性左心衰竭、心功能Ⅳ級；（2）重癥感染和活動性風濕熱；（3）甲狀腺功能紊亂；（4）嚴重的腎功能不全；（5）病態竇房結綜合征或其他需要起搏器治療的情況；（6）陣發性房顫。本研究經南京醫科大學附屬淮安第一醫院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 心臟超聲檢查 采用荷蘭飛利浦公司Epic7 彩超儀對所有患者行心臟彩超檢查，在入院3 d 內完成，記錄左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic dimeter，LVEDd）、左心房直徑（left atrial dimeter，LAD）和左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.2.2 全血TRAF3IP2 表達水平檢測 所有患者入院當天抽取靜脈血5 mL。采用DNA 提取試劑盒（中國凱基，KGA1206）按照說明書提取全血DNA，簡單步驟如下：全血RNA 以Trizol 試劑提取并以NanoDrop 2000 分光光度計定量。1 μg 的RNA 以cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉錄為DNA。定量PCR 在Stepone Plus Real-Time PCR system 儀器（美國Bio-Rad）上進行。DNA 的表達水平以2-ΔΔCt法分析。PCR 引物序列如下：GAPDH 正義鏈，5'-AGAACATCATCCCTGCCTCTACT-3'，反義鏈，5'-GATGTCATCATATTTGGCAGGTT-3'；TRAF3IP2正義鏈，5'- ACCGTGATGATAATCGTAGCAATC -3'，反義鏈，5'-CTGTAGACATGAGTGTTCTGAAGC3 -3'。TRAF3IP2 結果以2-ΔΔCt表示。

1.2.3 心房肌組織TRAF3IP2 表達水平檢測 8 例患者手術過程中在左心耳的適當部位取少許心房肌組織，-80 ℃冰箱保存行后續檢測。采用免疫組化法，心房肌組織標本以甲醛固定，無水乙醇脫水后制備石蠟切片。石蠟切片脫水后，以2%胎牛血清孵育30 min，以TRAF3IP2 一抗（美國Santa Cruze，sc-398161）4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗后，以二抗孵育30 min，并以蘇木精復染細胞核5 min，脫水后封片。TRAF3IP2 的表達水平采用Image Pro Plus 軟件以整合光密度值分析。

1.2.4 心房肌組織膠原含量檢測 標本同1.2.3，采用馬松染色，按照試劑盒（中國凱基，KGMST-8004）說明書進行，簡單步驟如下：石蠟切片脫水后以蒸餾水清洗，以蘇木精染核5 min，充分水洗后以麗春紅染色液染色5 min，冰醋酸溶液和磷鉬酸溶液清洗后，以苯胺藍染色液染色5 min，脫水后封片。采用Image Pro Plus 軟件分析心房肌組織膠原含量，評估其纖維化程度。

1.2.5 心房肌組織TRAF3IP、α 平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）蛋白表達水平檢測 標本同1.2.3，采用Western blotting 法。以全蛋白提取試劑盒（中國凱基，KGP250）提取組織蛋白，BCA 法定量蛋白濃度。在配好的膠中加入蛋白樣品后電泳，然后轉膜至PVDF 膜上。脫脂牛奶封閉該膜后以TRAF3IP2一抗（美國Santa Cruze，sc-398161）和α-SMA 一抗（美國Santa Cruze，sc-32313）4 ℃孵育過夜，以二抗孵育30 min 后ECL 法顯影，以GAPDH（美國Santa Cruze，sc-47724）作為參照蛋白。采用Image J 軟件定量分析TRAF3IP、α-SMA 蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0 分析軟件。正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數檢驗。計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。對LAD 進行分層分析，采用Spearman 直線相關法分析TRAF3IP2 與LAD 的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者年齡、性別、伴隨疾病、LVEDd、LVEF 及生化指標等比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。房顫組LAD、LAD＞3.5 mm的比例及TRAF3IP2 表達水平均大于非房顫組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 LAD 與TRAF3IP2 表達水平的相關性分析和分層分析 相關性分析顯示，LAD 與TRAF3IP2 表達水平呈直線相關（r=0.33，P=0.037），見圖1。分層分析顯示，LAD＜3.5 mm 者及LAD＞3.5 mm 者中，房顫患者的TRAF3IP2 表達水平均高于非房顫患者（均P＜0.01），見表2。

圖1 LAD 與TRAF3IP2 表達水平相關性分析的散點圖

表2 不同LAD 患者TRAF3IP2 表達水平比較

2.3 兩組患者心房肌組織膠原含量和TRAF3IP2、α-SMA 蛋白表達水平比較 8 例患者于心臟外科行瓣膜置換術或修復術，其中非房顫組3 例，房顫組5 例。馬松染色顯示房顫組心房肌組織膠原含量高于非房顫組（P＜0.01），免疫組化染色顯示房顫組心房肌組織TRAF3IP2 蛋白表達水平高于非房顫組（P＜0.01），見圖2A、B。Western blotting 法顯示房顫組左心房組織的TRAF3IP2 和α-SMA 蛋白表達水平均高于非房顫組（均P＜0.01），見圖2C、D。

3 討論

TRAF3IP2 是位于細胞質內的銜接蛋白，能直接與TNF-α、IL-1 等結合，通過激活其下游的JNK 和NF-κB 通路調節炎癥因子的合成與分泌、參與多種疾病的發生、發展，目前關于TRAF3IP2 的研究多在動物和細胞模型中進行。部分研究表明，TRAF3IP2在動脈粥樣硬化以及易損斑塊的形成中發揮重要作用[3]，其潛在機制可能是通過TRAF3IP2 參與泡沫細胞的形成、誘導內皮細胞功能障礙和促進平滑肌細胞遷移、增殖[6-8]。近期，Sakamuri 等[4]以醛固酮皮下注射小鼠構建心肌肥大模型，發現心肌的TRAF3IP2表達水平明顯升高，抑制TRAF3IP2 的表達后小鼠心肌肥大的程度減輕，同時心肌纖維化的程度也得到了抑制。在小鼠缺血再灌注模型中，心肌TRAF3IP2的表達水平同樣明顯升高，而敲除TRAF3IP2 基因后，小鼠心肌梗死面積以及纖維化程度均明顯減少[5]。進一步的研究表明，TRAF3IP2 通過JNK 通路調節成纖維細胞的增殖與遷移，且促進其分泌各型膠原最終誘導纖維化[9]。這些動物和細胞的研究結果均表明，TRAF3IP2 作為一種炎癥相關蛋白，廣泛參與了動脈粥樣硬化、心肌重構和心肌纖維化的發生、發展。TRAF3IP2 在人體中同樣廣泛表達，但健康狀態表達量較低，病理狀態下表達則明顯升高[10]。目前尚缺乏TRAF3IP2 與人類心血管疾病相關性的研究數據。

心房肌纖維化是心房顫動的主要特征之一，因此TRAF3IP2 可能參與房顫進展。為驗證該假說，本研究入選瓣膜病房顫患者，發現房顫患者的TRAF3IP2表達水平較非房顫患者明顯升高，此外，TRAF3IP2 表達水平與患者LAD 呈直線相關，由于房顫患者的左心房顯著大于非房顫患者，因此行分層分析以校正其對結果的影響。最終發現TRAF3IP2 表達水平與房顫的相關性不受左心房大小的影響。有部分患者行外科手術，術中取其左心耳心房肌組織行馬松染色、免疫組化及Western blotting，發現房顫患者心房肌組織的TRAF3IP2 表達水平和纖維化程度高于非房顫患者，這些結果表明TRAF3IP2 表達水平可能與心房肌的纖維化相關，進而參與房顫的進展。根據本研究的結論，推測在房顫發展過程中TRAF3IP2 通過調節心肌纖維化參與房顫的進展，但尚需進一步的研究證實。

本研究在臨床標本中證實TRAF3IP2 與房顫存在相關性，但由于樣本量較小，且并未行動物以及細胞實驗明確TRAF3IP2 與房顫的因果關系，因此仍需更多的臨床以及基礎研究證實本結論。