基于網絡藥理學和分子對接探討白及治療潰瘍性結腸炎的作用機制

潘 峰

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是位于直腸至結腸黏膜及黏膜下層的慢性非特異性炎癥性疾病，臨床主要表現為腹痛、腹瀉和黏液膿血便反復發作[1]。常見病因包括腸道通透性改變、腸道菌群失調、黏膜免疫應答、心理因素以及腸神經結構和功能異常[2]。目前，臨床尚無根治性治療手段，治療難度大，并且需要長期維持治療，有進展為結腸癌的潛在風險，嚴重影響患者的生活質量[3]。根據UC 的臨床表現，中醫將其歸屬于“泄瀉”“痢疾”范疇[4]。脾虛、濕熱內蘊是UC 活動期的的核心病機，治療以清熱解毒、健脾化濕、斂瘡生肌為大法[5]。白及苦、甘、澀，微寒，歸肺、肝、胃經，具有收斂止血、消腫生肌的作用，可用于治療瘡瘍腫毒、潰瘍病出血。藥理學研究[6]發現，白及及其有效成分具有抗菌、抗腫瘤、止血、抗潰瘍、促進傷口愈合等作用。國醫大師朱良春提出辨證加用白及或單用白及粉可廣泛用于治療UC、腸潰瘍等病。本研究通過網絡藥理學以及分子對接技術對白及治療UC 的潛在作用機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 白及活性成分及作用靶點的篩選 將“白及”作為關鍵詞在TCMSP 數據庫（http://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）平臺中進行檢索，并設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選出白及的有效活性成分，利用Pubchem 數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取有效成分的SDF 文件，將篩選出的有效成分利用SwissTarget Prediction 數據庫（http://swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測，設置概率（probability）＞0.1，最后利用Uniport 數據庫（http://www.uniprot.prg）將所得到的靶點名稱進行標準化。

1.2 UC 靶點的獲取 將“Ulcerative Colitis”作為關鍵詞，在Genecards、OMIM 和Disgenet 數據庫中進行檢索，并將得到的靶點去重后進行匯總。利用R 語言軟件繪制白及有效活性成分作用靶點和UC 疾病相關靶點的韋恩圖。

1.3 “藥物-活性成分-靶點”網絡構建 利用Uniport 網站將白及的有效藥物成分及對應的靶點轉換為Gene Symbol，將其導入Cytoscape 3.9.1 軟件繪制“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，利用軟件中的Network Analyzer 插件進行拓撲分析，根據度（degree）值高低將各個節點進行排序，篩選出關鍵成分。

1.3.1 靶點蛋白互作（PPI）網絡圖構建 將白及和UC 交集的靶基因導入String 數據庫，將物種限定為“人類（homo sapiens）”，最低交互置信度設置為“高置信度（high confidence）0.9，獲取相關數據并導出，再進一步導入Cytoscape 軟件中進行可視化，應用Cytoscape 軟件中Cytohubber 插件的degree 功能篩選出排名前15 的Hub 基因。

1.3.2 基因本體（gene onto-logy，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用Metscape 對交集靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，導出分析數據結果，再利用R4.2.0 軟件中對應的包對富集分析進行可視化處理。

1.3.3 分子對接 根據繪制的“藥物-活性成分-靶點”網絡及PPI 網絡圖篩選出degree 值排名前10的核心靶點和排名前5 的關鍵成分進行分子對接。通過PDB 數據庫下載關鍵靶點蛋白的3D 結構，利用Pymol 軟件和AutoDockTools1.5.7 軟件對蛋白和有效成分的3D 結構進行去水、去除原有配體、加氫以及計算結合能等處理，最后將處理后的結果進行可視化。

2 結 果

2.1 白及活性成分及作用靶點篩選結果 設定OB≥30%，DL≥0.18，白及活性成分共9 個，見表1。將有效成分導入Swiss Target Prediction 數據庫中檢索其作用靶點，得到Probability＞0.1 的靶點蛋白277 個。

表1 白及高活性的9 種化合物

2.2 UC 靶點篩選結果 通過檢索Genecards、OMIM和Disgenet 三個數據庫，并將所獲取的靶點去重后得到UC 相對應的靶點蛋白共1159 個。利用R 語言軟件繪制藥物和疾病相關靶點交集圖，得到交集基因68 個，見圖1。

圖1 白及有效活性成分和潰瘍性結腸炎相關靶點的韋恩圖

2.3 “藥物-活性成分-靶點”可視化結果“藥物-活性成分-靶點”網絡，見圖2。經計算后得到degree值排名前5 的活性成分分別是1-4 叔丁基芐基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-對羥基芐基-4-甲氧基-9，10-二氫菲、4，7-二羥基-1-對羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲、菲螺醇。

圖2 白及治療潰瘍性結腸炎潛在活性成分及作用靶點網絡圖

2.4 PPI 網絡構建結果 通過PPI 網絡篩選出白及治療UC 排名前15 的Hub 基因，如圖3 所示，顏色越深代表degree 值越大，degree 值排名前10 的基因分 別 為：CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC、PTGS2、MCL1、IGF1R。

圖3 白及治療潰瘍性結腸炎的Hub 基因篩選圖

2.5 GO 和KEGG 分析結果 對PPI 網絡核心靶點進行GO 功能富集分析后，結果獲得生物過程（biological process，BP）297 條、細胞組分（cellular component，CC）58 條、分子功能（molecular function，MF）62 條。將各自結果根據P 值由小到大排序后選取前10 條進行可視化分析，如圖4 所示。由圖可知，BP 主要涉及信號傳導（signal translation）、肽基-酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）、蛋白磷酸化（protein phosphorylation）等過程。CC 可能主要與質膜（plasma membrane）、胞漿（cytosol）、細胞質（cytoplasm）有關。MF 可能主要涉及蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、蛋白質結合（protein binding）、ATP結合（ATP binding）等功能。KEGG 通路富集分析結果共獲得143 條相關作用通路，按照P 值從小到大選取前20 條通路進行可視化分析，結果顯示白及治療UC 的靶點基因主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺腫瘤、Rap1、MAPK 等信號通路，見圖5。

圖4 白及治療潰瘍性結腸炎的GO 功能富集分析

圖5 白及治療潰瘍性結腸炎的KEGG 通路富集分析

2.6 分子對接結果 為進一步明確白及治療UC 潛在活性成分與關鍵靶點蛋白之間的分子結合能力，基于網絡藥理學的分析結果，選取degree 值排名前5 的活性成分1-4 叔丁基芐基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-對羥基芐基-4-甲氧基-9，10-二氫菲、4，7-二羥基-1-對羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲、菲螺醇與degree 值排名前10 的核心靶點CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC、PTGS2、MCL1、IGF1R 進行分子對接，對接結果詳見表2。自由結合能越小說明分子與蛋白之間對接越好，結合能＜-5 kcal/mol 說明有效成分和靶點之間結合活性強。白及活性成分與UC 核心靶點蛋白的結合能基本＜-5 kcal/mol，其中有20 個結合能＜-7 kcal/mol，由此可見白及的潛在有效成分與UC 的關鍵靶點之間關聯性很強，這些成分與靶點很有可能是白及治療UC 的物質基礎與關鍵作用靶點。使用PyMOL 軟件對白及治療UC 中結合能最強的活性成分和靶點的對接結果進行可視化（MOL005773-HRAS、MOL0057 73-SRC、MOL005768-SRC、MOL005756-SRC），見圖6。菲螺醇與HRAS 的ASP-119、LYS-117、SER-145、LYS-147、ALA-146 殘基各形成1 個氫鍵，與SER-17 殘基形成2 個氫鍵，氫鍵的長度分別為1.8、2.2、1.9、2.2、2.4、1.9、2.3 nm。菲螺醇與SRC 的ARG-293、ARG-296、ASP-224、ARG-296 殘基各形成1 個氫鍵，與ARG-217 殘基形成2 個氫鍵，氫鍵長度分別為2.1、2.5、1.9、2.8、2.0、2.5 nm。4，7-二羥基-1-對羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲與SRC 的ASN-292殘基形成2 個氫鍵，與HIS-163、CLN-192 殘基形成各3 個氫鍵，氫鍵的長度分別為2.8、1.9、2.1、1.9、1.8、1.6、1.9、2.8 nm。2，3，4，7-四甲基菲與SRC 的HIS-163 形成3 個氫鍵，與ARG-296 殘基形成4 個氫鍵，氫鍵的長度分別為1.9、2.1、2.1、1.9、2.2、2.8、2.3 nm。

圖6 白及主要活性成分與關鍵靶點分子對接圖

表2 白及活性成分與關鍵靶點的結合能（kcal/mol）

3 討 論

隨著生活水平的提高，UC 近年發病率不斷攀升，UC 長期遷延難愈，導致患者消化能力逐步下降、腸道吸收功能不良，進而出現營養不良、免疫功能失調等并發癥，臨床治療頗為棘手[7]。治療UC 的關鍵是抑制腸道炎癥活動，目前臨床上包括免疫抑制劑、抗腫瘤壞死因子-α、單克隆抗體在內的治療手段大多都存在價格昂貴、療程長、副作用多以及復發率高等問題[8]。中醫藥在治療UC 方面具有豐富的臨床經驗，并且不良反應少、患者可接受度高[9-10]。謝晶日教授在治療UC 方面主張在行氣活血的基礎上加用白及、白蘞斂瘡生肌，以達祛瘀生新的效果[11]。徐喆等[12]通過對國家專利數據庫進行分析，發現治療UC 的高頻藥物共49 味，其中白及排名第5，在多種治療UC 的中藥復方中被頻繁使用。

本研究利用網絡藥理學探究白及治療UC 的作用機制，提示中藥白及可以通過多成分、多靶點發揮治療UC 的作用，其中主要的活性成分包括1-4 叔丁基芐基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-對羥基芐基-4-甲氧基-9，10-二氫菲、4，7-二羥基-1-對羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲、菲螺醇，后四種活性物質都屬于菲類化合物，其中二氫菲類化合物是白及塊莖中含量最多的化合物，也是白及中的主要活性成分[13]，具有抗炎、抗癌等藥理作用[14]。俞蘇杭等[15]研究證實白及中的菲類化合物大多對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌以及枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌有中等強度的抗菌作用。

PPI 網絡互作分析結果提示，白及可能通過作用于CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC 等核心靶點來治療UC。細胞周期蛋白（cyclin D1，CCDND1）作為重要調節因子參與調控細胞周期，通過使周期抑制蛋白失活促進細胞由C1 向S 期轉變，從而促進細胞的增殖和生長，以此加速組織的修復促進創面愈合[16-17]。雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）是一種參與多種細胞信號傳遞的轉錄因子，具有促進基因轉錄的功能[18]，可以改變組織細胞的增殖和分化，減輕疼痛的傳導[19]。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGFR）是跨膜酪氨酸激酶受體表皮受體家族的成員，可以介導細胞分化、增殖、生長和遷移，組織損傷時刺激EGFR 表達上調，EGFR 激活后可以減輕早期腸道炎癥，促進結直腸傷口的愈合[20]。HRAS 屬于Ras 家族中的一員，是細胞外向細胞核傳遞生長信號的關鍵調節蛋白，激活Ras可以上調細胞生長，誘導其轉化[21]。HSP90AA1 可特異性激活細胞毒T 細胞，HSP90AA1 表達與白介素6（IL-6）表達成正相關，通過抑制HSP90AA1 可以抑制細胞免疫并減少炎癥因子的分泌[22]。ERBB2 編碼HER-2，HER-2 在免疫微環境調節中起著重要作用，HER-2 與酪氨酸激酶結合后可通過激活PI3KAkt 通路和MAPK 通路改善炎癥反應[23]。SRC 蛋白具有酪氨酸蛋白激酶活性，參與細胞內外重要信號的傳遞，參與生物活動的周期轉錄、細胞粘附、免疫反應、細胞周期等過程的調控，抑制SRC 磷酸化可以抑制缺氧誘導因子的表達，從而減輕炎癥反應[24]，并且SRC-3 具有促進腸道黏液分泌的功能，可以保護腸道免受腸腔內細菌的侵襲、抑制毒素的擴散[25]。綜上所述，白及可能通過調節上述靶點蛋白的功能，減輕腸道炎癥反應、調節免疫功能、抑制細菌侵襲、促進潰瘍愈合進而達到治療UC 的目的。

GO 功能富集分析結果提示，白及治療UC 的機制可能與促進質膜、胞漿、細胞質的生成，正向調節信號轉導、肽基-酪氨酸磷酸化、蛋白磷酸化等生物過程，促進蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白質結合、ATP 能量結合等功能相關。KEGG 通路富集分析結果提示PI3K-Akt、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺腫瘤、Rap1、MAPK 等信號通路與白及治療UC密切相關。PI3K/Akt/核因子κB（NF-κB）與UC 進展關系密切[26]，抑制PI3K/Akt/NF-κB 信號通路可以改善小鼠的UC[27]。線粒體動力學失衡誘發的能量代謝障礙是UC 的核心病理過程，PI3K/Akt 通路可以促進下游抗氧化系統表達谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），加速氧自由基的清除，促進細胞能量代謝恢復[28]。環磷酸腺苷（cAMP）是細胞內多種生理活動和新陳代謝調節的重要信號分子，PKA-Rap1 及Epac1/Rap1 信號通路均可介導cAMP 信號的調節，通過下調Rap1 可以減輕氧化應激損傷[29]。MAPK 信號通路與結腸炎癥反應相關，EPK、p38 是MAPK 家族的成員，調節EPK MAPK 通路，可以促進潰瘍的愈合[30]，抑制結腸組織中的p38 MAPK，可以減輕炎癥反應，促進結腸黏膜修復以及創口愈合[31]。

氫鍵長度不超過3.5 nm 提示對接結構穩定[32]。本研究分子對接結果中，白及中的菲螺醇與靶點SRC 之間的結合活性最強（-11.15 kcal/mol），菲螺醇與SRC 殘基共形成6 個氫鍵，最短的氫鍵長度為1.9 nm，最長的氫鍵長度為2.8 nm，均小于3.5 nm，由此可見，白及中的活性成分與潛在核心靶點蛋白之間能形成穩定的相互作用的氫鍵，白及可以有效發揮治療UC 的作用。

綜上，本研究提示白及可能通過1-4 叔丁基芐基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-對羥基芐基-4-甲氧基-9，10-二氫菲、4，7-二羥基-1-對羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲、菲螺醇等關鍵成分，作用于CCND1、ESR1、EGFR 等核心靶點，通過抑制腸道炎癥反應、調節腸道免疫功能、促進腸道黏液分泌以及加速腸道潰瘍愈合等功能，實現治療UC 的藥理作用。本項研究結果為臨床使用白及治療UC 提供了理論基礎，后期可進一步進行體內外實驗對該機制進行驗證。