肺癌合并肺結核患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 的表達與臨床病理特征的相關性研究

施 佳 王天香 耿艷華 梁木鳳 王 新

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的一種傳染病，根據《2022 年全球結核病報告》，2021 年有1060萬人患結核病，并且有160 萬人死于結核病[1]。研究[2]表明，肺結核與癌癥風險增加有關，其中與肺癌相關性最高。近年來，腫瘤的免疫治療獲得了廣泛研究，其中相關靶點程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）、程序性死亡配體1（PD-L1）和細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）的免疫檢查點抑制劑已經成為肺癌的一線治療用藥，并且為患者提供了生存益處[3-4]。研究[5-6]表明，結核感染和肺癌均可發生T 細胞相關的免疫逃逸，使共抑制分子的表達增加。因此，本研究探討肺癌合并肺結核患者病變組織中CTLA-4、PDL1 的表達與臨床病理特征的關系，旨在進一步探索結核感染與肺癌發生發展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集杭州市紅十字會醫院2013—2022 年胸外科及結核外科收治的96 例患者為研究對象，其中肺癌合并肺結核患者38 例（肺癌合并肺結核組）、單純肺結核患者29 例（肺結核組）、單純肺癌患者29 例（肺癌組）。本研究獲得醫院倫理委員會審核通過，批準編號：【2022】研審第（79）號。

1.2 納入及排除標準 納入標準：（1）所有患者均經臨床、影像學檢查及病理診斷證實[7-8]，肺癌合并肺結核組需患者肺結核及肺癌病灶位于同一側肺；（2）首次接受手術治療者；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）術前接受抗腫瘤治療者；（2）伴其他部位原發性腫瘤者；（3）合并自身免疫性疾病的患者。

1.3 免疫組織化學實驗 分別取肺結核組患者的結核病灶組織及肺癌組和肺癌合并肺結核組患者的肺癌病灶組織作為研究標本，經10%中性甲醛固定，按常規標準石蠟包埋、制片，并進行蘇木精伊紅染色（HE）和免疫組化染色。免疫組化實驗片經過烤片、脫蠟、3%雙氧水封閉、乙二胺四乙酸（EDTA）高壓修復20 min 后，按照SP 法二抗試劑盒進行孵育，二甲基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精襯染，DM1000 光學顯微鏡（德國徠卡公司）下觀測CTLA-4、PD-L1 的蛋白表達。濃縮型兔抗人CTLA-4 抗體（一抗，工作濃度：1∶500，批號1005930-6）購自英國Abcam 公司；PDL1（批號220507C02X）購自廈門艾德生物公司；羊抗兔/小鼠IgG 聚合物（二抗，批號22011）購自廣州安必平醫藥科技股份有限公司；抗體稀釋劑（批號23081401）、DAB 顯色劑（批號221101）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 結果判讀[9]CTLA-4 和PD-L1 定位于細胞膜，出現完整的棕黃色膜染色判定為陽性細胞。隨機選取5 個高倍鏡視野，按陽性細胞占總細胞數的百分比計分：＜3%為0 分；3%～9%為1 分；10%～24%為2分，≥25%為3 分。陽性細胞著色程度計分：陰性為0分，弱陽性為1 分，中等陽性為2 分，強陽性為3 分。將上述兩項評分的乘積作為最終結果：0～2 分為陰性表達，3～9 分為陽性表達。本實驗經由兩名經驗豐富的病理醫生獨立閱片并進行判讀。

1.5 統計學方法 應用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，符合正態分布和方差齊性的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t 檢驗或非參數檢驗；計數資料以例（%）表示，采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。兩組間相關性分析，符合正態分布者，使用Spearman 相關性分析，不符合正態分布者使用Kendall's tau-b 等級相關性分析。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組患者一般資料比較 96 例患者中男48例，女48 例，年齡18～84（52.54±15.70）歲，中位年齡55.5 歲。肺癌合并肺結核組38 例，其中男21 例，女17 例，年齡24～74（57.84±11.41）歲；肺結核組29 例，其中男18 例，女11 例，年齡18～46（37.76±2.13）歲；肺癌組29 例，其中男10 例，女19 例，年齡32～84（60.38±2.65）歲，三組性別、年齡比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。肺癌合并肺結核組鱗癌11 例，腺癌27 例[8]；腫瘤分化程度高分化11 例，中+低分化27 例[8]；腫瘤最大徑（2.67±1.66）cm，≥2.7 cm 16 例，＜2.7 cm 22 例；TNM 分期[8]Ⅰ期25 例，Ⅱ～Ⅲ期13例。肺癌組鱗癌4 例，腺癌25 例；腫瘤分化程度高分化11 例，中+低分化18 例；腫瘤最大徑（1.85±0.20）cm，≥1.85 cm 10 例，＜1.85 cm 19 例；TNM 分期Ⅰ期26例，Ⅱ期3 例。

2.2 三組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 陽性表達率比較 免疫組化結果顯示，CTLA-4 表達于肺癌及肺結核病灶的淋巴細胞，PD-L1 表達于肺結核病灶的間質巨噬細胞及肺癌病灶的腫瘤細胞及間質巨噬細胞。CTLA-4 在肺癌合并肺結核組、肺結核組、肺癌組患者病變組織淋巴細胞中的陽性表達率分別為65.79%、24.14%、20.70%，肺癌合并肺結核組的陽性表達率高于其余兩組，差異均具統計學意義（均P＜0.01）。PD-L1 在肺癌組、肺癌合并肺結核組患者的腫瘤細胞中陽性表達率分別為6.90%、10.53%，兩者比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。PD-L1 在肺結核組、肺癌組、肺癌合并肺結核組患者病變組織間質巨噬細胞中的陽性表達率分別為48.28%、31.03%、39.47%，肺癌合并肺結核組與其他兩組差異無統計學意義（均P＞0.05）。見圖1、表1。

表1 肺結核組、肺癌組、肺癌合并肺結核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 陽性表達率比較[例（%）]

圖1 肺結核組、肺癌組、肺癌合并肺結核組CTLA-4、PD-L1 的表達情況及肺癌合并肺結核組病變組織HE 染色情況

2.3 肺癌合并肺結核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 表達情況與臨床病理特征的關系 CTLA-4陽性表達率在鱗癌、低+中分化癌、腫瘤最大徑≥2.7 cm 的病例中顯著高于腺癌、高分化癌、腫瘤最大徑＜2.7 cm 的病例（均P＜0.05）；CTLA-4 陽性表達率與年齡、性別、淋巴結轉移、TNM 分期無關（均P＞0.05）。腫瘤細胞的PD-L1 陽性表達率在TNM 分期Ⅱ～Ⅲ期的病例中高于TNM 分期Ⅰ期的病例（P＜0.05），與其他特征無關（均P＞0.05）。間質中的PDL1 陽性表達率在不同的臨床病理特征中的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 肺癌合并肺結核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 表達情況與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.4 肺癌合并肺結核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 表達與臨床病理特征的相關性 CTLA-4 表達與腫瘤類型具有相關性，相關系數為0.460，P＜0.05；與腫瘤分化程度和腫瘤大小相關系數分別為0.268、0.395，無明顯相關性（P 均＞0.05）。腫瘤細胞中PD-L1 表達與腫瘤分期無相關性，相關系數為0.105，P＞0.05。見表3。

表3 肺癌合并肺結核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1表達與臨床病理特征的相關性

2.5 肺癌合并肺結核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 表達的相關性 肺癌合并肺結核組患者腫瘤細胞中PD-L1 表達與淋巴細胞中CTLA-4 表達之間的相關系數為0.067，間質巨噬細胞中PD-L1 表達與淋巴細胞中CTLA-4 表達之間的相關系數為0.128，均無顯著相關性（P 均＞0.05）。見表4。

表4 肺癌合并肺結核組患者病變組織中CTLA-4與腫瘤/間質中PD-L1 表達的相關性

3 討 論

免疫耐受和逃逸近年來在腫瘤和慢性感染方面均是研究熱點。結核感染與腫瘤微環境在免疫方面具有很多相似性，兩者均可以導致T 細胞進行性損害，使免疫細胞表面的免疫抑制分子表達升高，導致機體發生免疫逃逸，促進疾病的發生發展[10]，因此結核感染可能為腫瘤的發展提供了有利的微環境。

CTLA-4 是免疫球蛋白超家族成員，表達于T 淋巴細胞表面，通過與T 細胞表面的共刺激分子CD28競爭結合抗原提呈細胞表面的配體B7 分子（CD80、CD86）發揮作用，結合后產生抑制性信號，抑制T 細胞的增殖與活化[11]。CTLA-4 抑制T 細胞增殖與活化的作用，可能與白細胞介素-2（IL-2）產生減少[12]和B淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）等抗凋亡因子表達上調有關[13]。研究[14]表明，CTLA-4 在乙肝等慢性感染疾病中存在差異表達，并且參與了病原體的致病過程。在小鼠實驗中證實了CTLA-4 阻斷可增強慢性感染中的T 細胞反應[15]。結核桿菌在人體中被巨噬細胞吞噬之后，刺激T 細胞增殖，使Th1/Th2 型T 細胞平衡失調，CD8+T 細胞表面的CTLA-4 等共抑制分子表達增加[5]。上述T 細胞平衡失調現象在肺癌患者體內亦被發現[16-17]。本研究發現，三組患者病變組織中CTLA-4 表達于肺結核及肺癌病灶的淋巴細胞，并且肺癌合并肺結核組的表達率顯著高于其余兩組（P＜0.01），提示結核感染可能促使CTLA-4 在肺癌組織中的表達升高。在結核肉芽腫以及腫瘤微環境中，巨噬細胞逐漸轉化為M2 型，M2 巨噬細胞有助于促進血管的生成和免疫抑制因子的表達，促進腫瘤生長[18]。實驗[19]證實CTLA-4 表達的上調能促進結核相關巨噬細胞由M1 向M2 極化。由此推測在肺癌合并肺結核的病例中，結核免疫導致CTLA-4 的表達升高，有助于腫瘤微環境中的巨噬細胞向M2 型極化。綜上所述，CTLA-4 在免疫調節中主要發揮了負性作用，并且結核感染可能是通過提高CTLA-4 的表達和巨噬細胞向M2 型極化這兩個途徑促進免疫逃逸和形成適宜微環境，促進肺癌的發生發展。

PD-1/PD-L1 是協同抑制分子，PD-L1 與CTLA-4 的作用相似，PD-L1 作為PD-1 的配體主要表達于腫瘤細胞與抗原提呈細胞的表面，兩者結合后能夠通過啟動胞內磷酸化級聯反應抑制T 細胞的活化和增殖，使免疫細胞耐受并減弱其抗腫瘤免疫反應的能力[20]。PD-L1 在活動性肺結核患者的巨噬細胞上表達，并且當PD-1/PD-L1 通路阻斷時，巨噬細胞的吞噬作用顯著增加，說明在結核患者中此通路抑制巨噬細胞的功能發揮[21]。在一項結核促進腫瘤發展的研究中發現，結核分枝桿菌可以促進CD4+Foxp3+調節性T 細胞（Tregs）增殖，使非小細胞肺癌的腫瘤細胞增長，誘導PD-L1 表達，促進免疫逃逸[22]。也有相關研究提出，PD-1/PD-L1 信號通路是結核感染導致T 細胞耗竭和促進腫瘤在肺中轉移的關鍵途徑[23]。本研究顯示，PD-L1 在TNM 分期更高的肺癌合并肺結核病例中表達更高，說明PD-L1 的表達升高可能有利于腫瘤的發展。但PD-L1 與肺結核促進肺癌發展的相關性需要更多實驗來證實。

CTLA-4 和PD-L1 作為重要的免疫負性分子，均通過受體-配體結合的方式發揮抑制T 細胞免疫和促進腫瘤發展的作用，相關的免疫檢查點抑制劑已廣泛應用。但免疫抑制通路具有多樣性，不同人、不同疾病的機制都可能不同，因此單靶點抗體藥物具有一定的局限性。目前臨床實驗發現，PD-L1 和CTLA-4 的聯合靶向治療比單獨治療更有效[24]，并且單獨阻斷PD-1/PD-L1 會導致CTLA-4 表達上調，從而發生治療抵抗[25]，由此可以推測兩者可能存在協同作用，由它們導致的雙重免疫抑制可以促進疾病的發展。但本研究樣本量較小，有一定的局限性，兩者之間的相關性有待進一步研究探討。

綜上所述，我們推測CTLA-4、PD-L1 均可能在結核感染過程中發生免疫負性調節，進而促進肺癌發生發展。由此，可以認為CTLA-4、PD-L1 是未來免疫調節治療的潛在藥物靶點，可能對肺癌的治療以及結核等慢性感染的治療有積極意義，可能干預結核進一步發展為癌癥的進程。