羅哌卡因對大鼠脂肪干細胞增殖、凋亡及成骨分化的影響觀察

王靜，唐琳，宋雙榮，蘇小麗，任麗潔，王萍

滄州醫學高等專科學校口腔系，河北 滄州 061001

脂肪干細胞（adipose derived stem cell，ADSCs）來源于脂肪組織中非脂肪細胞的基質血管成分，具有自我更新及多項分化潛能［1］，可分化為內胚層、中胚層和外胚層三個譜系的細胞［2］，其釋放的生長因子、miRNA及外泌體可調節細胞的微環境，具有抗炎和促進血管生成的作用［3］。ADSCs易于自體取材、來源廣泛、免疫源性低，目前已被廣泛用于骨組織工程、創面治療和骨質疏松癥骨缺損修復［4-6］。目前臨床上主要通過脂肪抽吸術或脂肪切除術來獲取脂肪組織，采用酶消化法將脂肪組織分離、培養，獲得ADSCs。在手術獲取人脂肪組織時，需要對患者進行局部腫脹麻醉或局部浸潤麻醉。酰胺類局麻藥物羅哌卡因，具有藥效時間長、鎮痛作用好、不良反應小且不影響運動功能等特點，是整形外科常用的局部麻醉藥。目前羅哌卡因對ADSCs生物學特性的影響尚無深入報道。由于大鼠與人類脂肪組織的細胞生物學特性相似，且涉及的倫理問題少，2022年1月—2023年6月，我們觀察了羅哌卡因對大鼠ADSCs增殖、凋亡及成骨分化的影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 羅哌卡因、大鼠、試劑 羅哌卡因購自美國Sigma公司。雄性SD大鼠購于河北省實驗動物中心，L-DMEM、胎牛血清FBS、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司，CCK-8購自博士德公司，Annexin V APC凋亡檢測試劑盒購自美國BioGems公司，堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購自碧云天公司，骨鈣素（OCN）單克隆抗體購自美國Thermo公司，抗壞血酸、地塞米松、β-磷酸甘油鈉購自美國Sigma公司。

1.2 大鼠ADSCs的提取、培養與分組 安樂死處死SD大鼠3只，迅速分離出腹股溝及附睪周圍的脂肪組織，剪成漿糊狀后加入Ⅰ型膠原酶，37 ℃消化60 min，篩網過濾后1000 r/min離心10 min，DMEM重懸細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3天換液一次，當細胞融合達80%時胰蛋白酶消化并傳代。取對數生長期ADSCs，胰酶消化、離心后棄上清，取100 μL濃度為2×1010/L的細胞懸液移入96孔板，分別加入含0 mg/mL、200 mg/mL、500 mg/mL羅哌卡因的培養基100 μL，使羅哌卡因的終濃度分別為0 mg/mL、200 mg/mL和500 mg/mL，分別記為對照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組。

1.3 各組細胞增殖能力觀察 采用CCK-8實驗。取各組細胞，繼續培養24、48、72 h時，向每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育1.5 h，使用酶標儀檢測450 nm波長的OD值，以OD值表示細胞增殖能力。

1.4 各組細胞凋亡情況觀察 取各組細胞，繼續培養24 h，胰酶消化細胞，染色緩沖液清洗，調整細胞濃度為1×106/mL，吸取100 μL細胞懸液，分別加入5 μL Annexin V和7-AAD溶液，混勻后避光孵育15 min，加入400 μL Annexin V結合緩沖液，使用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.5 各組細胞成骨分化能力觀察 取各組細胞，加入等量的成骨誘導培養基（含0.1 μmol/L地塞米松、0.05 g/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉），每3天換培養基一次，觀察各組細胞成骨分化能力，包括成骨潛能、礦化能力和成骨相關蛋白OCN表達水平。

1.5.1 各組細胞成骨潛能觀察 連續誘導7 d，棄原培養基，TritonX-100裂解細胞40 min，提取上清液，按照ALP檢測試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定405 nm下的OD值，繪出標準曲線，根據樣品的OD值在標準曲線上查出樣品的濃度，即為ALP活性，以ALP活性表示細胞成骨潛能。

1.5.2 各組細胞礦化能力觀察 連續誘導14 d，4%多聚甲醛4 ℃固定細胞25 min，PBS緩沖液沖洗三遍，40 mmol/L茜素紅（pH 4.1）室溫染色20 min，倒置顯微鏡下觀察拍照，之后用10%氯化十六烷基吡啶溶解，酶標儀測定562 nm波長處OD值，以OD值表示細胞礦化能力。

1.5.3 各組細胞成骨相關蛋白OCN檢測 采用免疫熒光法。連續誘導14 d，多聚甲醛固定細胞25 min，PBS緩沖液沖洗，0.5% Triton X-100透膜處理15 min，PBS緩沖液清洗，5%BSA封閉1 h，PBS緩沖液清洗，加入一抗OCN（1：100）孵育，4 ℃過夜，PBS緩沖液清洗，加入相應二抗（1：50），避光孵育1 h，DAPI染色15 min，共聚焦顯微鏡觀察拍照，用Image J軟件進行免疫熒光定量分析，以熒光強度表示細胞OCN蛋白表達水平。

1.6 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件。計量資料呈正態分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞OD值比較 各組細胞OD值比較見表1。由表可知，與對照組相比，200 mg/mL組、500 mg/mL組細胞培養24、48、72 h時的OD值均顯著下降，且500 mg/mL組低于200 mg/mL組。

表1 各組細胞OD值比較（±s）

表1 各組細胞OD值比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與200 mg/mL組比較，#P＜0.05。

組別對照組200 mg/mL組500 mg/mL組OD值72 h 1.616 ± 0.0211.299 ± 0.001*1.026 ± 0.004*#24 h 1.093 ± 0.0600.734 ± 0.030*0.519 ± 0.010*#48 h 1.357 ± 0.0050.936 ± 0.025*0.773 ± 0.009*#

2.2 各組細胞凋亡率比較 對照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組細胞凋亡率分別為2.78% ±0.23%、4.15% ± 0.62%、5.88% ± 0.78%，組間相比，P均＜0.05。

2.3 各組細胞成骨分化能力比較

2.3.1 各組細胞成骨潛能比較 對照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組細胞ALP活性分別為（0.385 ± 0.005）、（0.233 ± 0.005）、（0.195 ± 0.005）mmol/（g·min），組間相比，P均＜0.05。

2.3.2 各組細胞礦化能力比較 對照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組細胞OD值分別為0.457 ± 0.040、0.388 ± 0.003、0.226 ± 0.001，組間相比，P均＜0.05。

2.3.3 各組細胞OCN蛋白表達水平比較 對照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組細胞OCN蛋白表達水平分別為96.354 ± 0.367、84.926 ± 0.138、74.095 ± 0.046，組間相比，P均＜0.05。

3 討論

隨著組織工程與再生醫學、干細胞理論與技術的發展，ADSCs已被廣泛用于各種組織缺損與疾病治療。CAETANO、陳立峰等將ADSCs與新型支架組合，發現“支架—干細胞復合體”修復骨組織缺損效果更好，骨再生更為明顯［7-8］。此外，間充質干細胞在治療肝硬化、肝衰竭以及對肝移植后排斥反應中也已經獲得了臨床有效性的結果［9-10］。

羅哌卡因是一種長效酰胺類局部麻醉藥，可通過與特定受體結合，阻滯鈉離子通道，抑制鈉內流，可逆地抑制神經興奮的產生和傳導，發揮有效的麻醉鎮痛作用。但是當羅哌卡因給藥劑量過大時，會出現一定的不良反應，且局麻藥的不良反應呈濃度依賴性。與布比卡因相比，等量的羅哌卡因被認為不太可能引起肌肉毒性和全身毒性，包括神經毒性和心臟毒性［11］。由于個體差異，患者對麻藥的耐受程度不同，羅哌卡因的安全濃度為200～750 mg/mL，被廣泛應用于各種麻醉處理［12-13］。洪婷婷等［14］研究顯示，300 mg/mL羅哌卡因效果確切，能有效緩解疼痛，不良反應發生率低。鑒于此，本課題選用200 mg/mL、500 mg/mL兩個濃度，研究其對細胞生物學特性的影響。

羅哌卡因可抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡［15-17］。羅哌卡因可影響細胞的生物學特性，包括抑制細胞增殖、遷移，誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期等。在本研究中，CCK-8結果顯示羅哌卡因呈濃度依賴性降低ADSCs的增殖能力。cyclinD1蛋白在細胞周期的調控中起關鍵作用，羅哌卡因可通過下調cyclinD1的蛋白水平，阻止細胞從G1期向S期轉移，從而抑制細胞生長［18-19］。

細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，貫穿整個生命過程，可受細胞內外部多種因素調控。當細胞受到外界刺激時，在細胞的內質網腔中，錯誤折疊的蛋白會增多，引起內質網應激，通過激活下游細胞凋亡相關信號分子，導致細胞凋亡［20-21］。在本研究中，隨著羅哌卡因濃度的增高，細胞的凋亡率顯著增高。其具體作用機制可能與以下幾種因素有關［22-27］：①酰胺類麻醉藥物羅哌卡因屬于高度親脂性分子，可破壞細胞膜的通透性，且濃度越高，破壞程度越大，因此羅哌卡因對細胞凋亡的影響呈濃度依懶性。②羅哌卡因可通過影響鈉離子電流，改變跨膜電位，影響細胞的能量代謝。③羅哌卡因還可能通過抑制IkB-NF-κBICAM-1信號轉導通路，干擾細胞線粒體中的能量代謝，抑制細胞間的有效通訊，實現對抑制細胞增殖，促進細胞凋亡的作用的。OCN是成骨細胞轉向礦化期分化的重要標志性蛋白，在骨形成過程中可調節晶體生長，被用于評價細胞后期的成骨分化水平。本研究結果顯示，羅哌卡因呈濃度依賴性降低了ADSCs的成骨分化能力。關于其具體作用機制，還需進一步的深入研究。

綜上所述，羅哌卡因可降低ADSCs的增殖能力、成骨分化能力，促進其凋亡，且濃度越高，抑制能力越強。因此，在臨床進行脂肪抽吸術操作時，要在保證麻醉的前提下，盡量的降低羅哌卡因的濃度，以減少對ADSCs的毒性作用，維持細胞正常的生物學特性。