姜黃素灌胃對脂肪肝大鼠腸黏膜屏障損傷的改善作用及其機制

侯洪濤，張建，裘艷梅，李蘋蘋，鄭吉敏，王玉珍，劉改芳

1 河北省人民醫院消化科，石家莊 050051；2 河北醫科大學第二醫院兒科

長期高脂飲食會引起高血脂、高血糖、非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、肥胖等多種疾病［1］。NAFLD是以肝臟脂質蓄積為病理改變的肝臟代謝性疾病［2］。隨著人們飲食及生活方式的改變，NAFLD發病率逐年升高，流行病學調查［3］顯示，NAFLD的全球患病率約為25.24%。“腸—肝軸”概念的提出為尋找肝病的發病機制和診療方法提供了新思路。NAFLD時常伴有腸黏膜屏障損傷，腸黏膜屏障損傷會加快NAFLD的病理生理進程［4］。NAFLD時腸黏膜氧化應激水平的升高是腸黏膜損傷的重要機制之一。核因子-E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）是體內抵御氧化應激的重要轉錄因子，抗氧化反應元件可以與Nrf2結合，上調Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達，改善機體的氧化應激狀態［5］。血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1， HO-1）是一種抗氧化酶，能夠對抗細胞的氧化應激［6］。姜黃素是從植物姜黃中提取的疏水性多酚，現代藥理研究表明姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用［7］。2020年6—10月，我們觀察了姜黃素灌胃對脂肪肝大鼠腸黏膜屏障損傷的改善作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 姜黃素、大鼠、試劑及儀器 姜黃素購自美國Sigma公司。SPF級雄性SD大鼠45只，大鼠體質量190 ± 20 g克，動物許可證號：SCXK（冀）2018-004，實驗動物、普通飼料及高脂飼料（10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽鹽+87.5%普通飼料）均購自河北醫科大學實驗動物中心。SOD試劑盒和MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；脂多糖（lipopolysaceharide， LPS）試劑盒購自湛江安度斯公司；二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗Nrf2多克隆抗體購自美國Bioworld公司；小鼠抗HO-1單克隆抗體購自武漢三鷹公司；兔抗β-actin單克隆抗體購自上海Abways公司；山羊抗兔IgG二抗購自柏奧易杰（北京）科技有限公司；山羊抗小鼠IgG二抗購自柏奧易杰（北京）科技有限公司。電子天平購自德國Sartorius公司，高速離心機購自德國Eppendorf公司，轉移脫色搖床購自海門其林貝爾儀器制造公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，低溫離心機購自德國Eppendorf公司，垂直電泳槽購自北京六一儀器廠，醫用X射線膠片購自美國柯達公司，石蠟病理切片機購自德國LEIKA公司，光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 脂肪肝大鼠模型制備、分組、姜黃素給予方法 SD大鼠45只，適應性喂養1周，隨機選取10只作為對照組，應用普通飼料喂養。其余35只繼續高脂飼料喂養，每周測量大鼠體質量，建立脂肪肝模型。8周后，隨機處死5只高脂喂養大鼠，通過肝組織切片確認脂肪肝模型制備成功。高脂喂養的其余30只大鼠進一步分為模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組，每組10只。姜黃素溶于1%的羧甲基纖維素鈉，模型組繼續給予高脂飼料喂養；姜黃素低劑量組在髙脂喂養的同時給予200 mg/（kg·d）姜黃素灌胃，每日1次；姜黃素高劑量組在髙脂喂養的同時給予400 mg/（kg·d）姜黃素灌胃，每日1次；對照組和模型組大鼠予以相同劑量的1%羧甲基纖維素鈉灌胃；各組大鼠灌胃8周后，處死大鼠，留取肝臟、小腸組織和門靜脈血用于后續實驗。

1.3 各組大鼠肝臟、小腸組織病理學觀察 取各組大鼠肝臟組織，制備石蠟切片，蘇木精—伊紅染色后，應用光鏡觀察肝臟脂肪變的程度。取各組小鼠小腸組織，制備病理學切片，蘇木精—伊紅染色后，應用光鏡觀察小腸黏膜絨毛的變化。

1.4 各組大鼠腸黏膜屏障功能指標觀察 取大鼠門靜脈血，按試劑盒說明書測定門靜脈血漿LPS及門靜脈血漿二胺氧化酶（DAO），使用全自動生化儀檢測大鼠血清ALT、AST。

1.5 各組大鼠小腸組織氧化應激指標觀察 取小腸組織，制備小腸組織勻漿，按試劑盒說明書，檢測小腸組織丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.6 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白檢測采用Western Blotting法。取小腸組織，剪碎后加入蛋白裂解液，制備勻漿液，提取細胞核蛋白Nrf2和胞漿蛋白HO-1并測定蛋白含量。蛋白煮沸變性后，將20 μg蛋白樣品上樣至12%SDS-PAG凝膠孔中，進行電泳，蛋白分離后將其轉移至PVDF膜上，后將其置于5%脫脂牛奶中常溫封閉1 h；將膜置于稀釋后的第一抗體中［兔抗Nrf2多克隆抗體（1∶1000稀釋）、小鼠抗HO-1單克隆抗體（1∶1000稀釋）、兔抗β-actin單克隆抗體（1∶5000稀釋）］，4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液對PVDF膜漂洗3次，以1∶10000的山羊抗兔、山羊抗小鼠第二抗體溶液孵育2 h；以TBST漂洗3次，增強化學發光法顯色，使用凝膠成像儀觀察蛋白條帶并拍照，用Image J軟件分析圖像，以β-actin作為內參照，結果以目的條帶和內參照的OD比值來表示。

1.7 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料呈正態分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟、小腸組織病理學變化 ①各組大鼠肝臟組織病理學變化見圖1。對照組大鼠肝細胞結構正常，無炎癥反應；模型組大鼠可見肝細胞內可見大小不等的脂肪堆積，并有炎細胞浸潤；姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組肝細胞脂肪變減輕，炎癥浸潤減少，并與給藥劑量有關。②各組大鼠小腸組織病理學變化見圖2。各組小腸黏膜形態未見明顯異常，對照組絨毛高大、完整，無充血及水腫；模型組絨毛低矮、間隙增寬，結構破壞，不完整；姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠小腸絨毛比較完整，絨毛缺失減少，并與給藥劑量有關。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學變化（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠小腸組織病理學變化（HE染色，×100）

2.2 各組大鼠腸黏膜屏障功能指標比較 各組大鼠血漿LPS、DAO及血清AST、ALT水平比較見表1。由表1可知，與對照組相比，模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠血漿LPS、DAO及血清AST、ALT水平均升高（P均＜0.05），但姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組低于模型組（P均＜0.05），且有劑量依賴性（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠血漿LPS、DAO及血清AST、ALT水平比較（±s）

表1 各組大鼠血漿LPS、DAO及血清AST、ALT水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與姜黃素低劑量組比較，△P＜0.05。

組別對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組ALT（U/L）35.69 ± 9.5975.03 ± 10.86*52.65 ± 7.48*#44.00 ± 5.49*#△LPS（EU/mL）0.27 ± 0.090.55 ± 0.10*0.37 ± 0.07*#0.46 ± 0.07*#△DAO（U/mL）0.46 ± 0.141.06 ± 0.25*0.83 ± 0.18*#0.64 ± 0.12*#△AST（U/L）130.71 ± 14.09165.28 ± 10.26*153.47 ± 8.84*#141.60 ± 8.27*#△

2.3 各組大鼠小腸組織氧化應激指標比較 各組大鼠小腸組織MDA含量及SOD活性比較見表2。由表2可知，與對照組相比，模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠小腸組織MDA含量均升高（P均＜0.05），但姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組低于模型組（P均＜0.05），且有劑量依賴性（P均＜0.05）；與對照組相比，模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠小腸組織SOD活性均降低（P均＜0.05），但姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組高于模型組（P均＜0.05），且有劑量依賴性（P均＜0.05）。

表2 各組大鼠小腸組織MDA含量及SOD活性比較（±s）

表2 各組大鼠小腸組織MDA含量及SOD活性比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與姜黃素低劑量組比較，△P＜0.05。

SOD（U/mg）179.02 ± 12.56135.48 ± 16.48*154.70 ± 10.12*#166.74 ± 9.06*#△組別對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組MDA（nmol/mg）3.55 ± 0.837.21 ± 1.39*5.65 ± 1.12*#4.60 ± 0.89*#△

2.4 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較見表3。由表3可知，與對照組相比，模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均升高（P均＜0.05），且姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組高于模型組（P均＜0.05），且有劑量依賴性（P均＜0.05）。

表3 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與姜黃素低劑量組比較，△P＜0.05。

HO-1蛋白0.37 ± 0.100.54 ± 0.13*0.67 ± 0.11*#0.80 ± 0.13*#△組別對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組Nrf2蛋白0.29 ± 0.060.40 ± 0.07*0.63 ± 0.08*#0.77 ± 0.09*#△

3 討論

高脂飲食可誘發胰島素抵抗、NAFLD、代謝綜合征、2型糖尿病及動脈硬化性心腦血管疾病的發生［8］，嚴重危害人民的生命健康。NAFLD已成為我國第一大慢性肝病［9］，成為公共健康問題。肝臟的血供有約70%來源于腸道相關血管，肝腸解剖上的關系決定了其功能上的密切聯系。近年來，“腸—肝軸”被人們認識和重視，“腸—肝軸”在NAFLD的發病過程中具有重要地位［10］。NAFLD常伴腸黏膜屏障受損［11］，腸黏膜屏障的受損加速了NAFL向NASH、肝纖維化及肝硬化的發展。本研究成功應用高脂飲食誘導了大鼠肝臟脂肪變，大鼠血清LPS水平升高，說明NAFLD大鼠腸黏膜屏障功能受損。

氧化應激是NAFLD時腸黏膜屏障損傷的重要機制［12］。LI等［13］研究發現，高脂飲食可使腸黏膜大量促炎細胞因子產生，誘導腸黏膜氧化應激反應，導致腸黏膜肌球蛋白輕鏈激酶 （myosin light chain kinase，MLCK）表達升高，緊密連接受損，腸黏膜通透性升高。本研究發現，高脂喂養大鼠腸組織中MDA水平升高、SOD水平降低，說明高脂喂養大鼠腸黏膜存在氧化應激，血漿DAO活性升高，血清LPS水平升高，說明腸黏膜通透性升高，腸黏膜屏障功能受損，與既往研究結果一致。

Nrf2是一種調控機體氧化應激反應的重要的核轉錄因子［14］，富含亮氨酸拉鏈結構，屬于CNC轉錄因子家族成員，是體內氧化應激的中樞調控者，在維持體內氧化還原穩態過程中發揮重要作用。生理狀態下，Nrf2在胞漿與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1結合而被降解，機體受到親電體和活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）刺激后，Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1解離進入到細胞核，進一步與抗氧化反應元件結合，啟動下游抗氧化酶基因表達［15］。HO-1為Nrf2下游重要的保護性蛋白酶［16］。HO-1是一種微粒體酶，可將血紅素分解代謝為膽綠素、膽紅素、一氧化碳和自由鐵，發揮其強大的抗氧化、抗炎作用［17］。本研究中，高脂喂養大鼠由于腸組織氧化應激水平的升高，Nrf2、HO-1的表達較正常對照組增加，這是一種機體在病理情況下的保護性調節行為，這也說明了Nrf2/HO-1在NAFLD時是調控腸道氧化應激的重要信號。

姜黃素有強大的抗氧化、清除自由基的作用［18］。LIN等［19］通過體外細胞培養發現，姜黃素能夠激活Nrf2-Keap1信號通路發揮其抗氧化作用。本研究應用姜黃素對高脂喂養大鼠進行干預后發現，大鼠腸組織中MDA水平降低、SOD水平升高，Nrf2、HO-1的表達較模型組顯著增加，并且與姜黃素應用的劑量相關，這表明姜黃素激活了Nrf2/HO-1通路。同時姜黃素干預組大鼠，腸源性內毒素血癥減輕，小腸黏膜損傷程度明顯減輕，肝臟脂肪變程度得到改善。

綜上所述，姜黃素灌胃可改善脂肪肝大鼠的腸黏膜屏障損傷，其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路改善腸道氧化應激狀態有關。本研究為肝病腸治提供了理論依據，但本研究未以該通路抑制劑進行對照驗證，且對其上游信號分子也未進行充分探討，后期將深入進行相關研究。