白藜蘆醇單用或與miR-27b激動劑聯合應用對腦出血大鼠腦組織繼發性病理損傷的防治作用觀察

舒藝璇，何曉英，陳鑫，蔣義碧

西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川 瀘州 646000

腦出血（intracerebral hemorrhage， ICH）是神經系統常見病多發病，占我國腦卒中患者的25%～55%，其致殘率及死亡率高［1］。ICH后腦組織會出現病理性損傷，包括原發性損傷和繼發性損傷。腦組織繼發性病理損傷主要是由于ICH后有害物質釋放引起的血腦屏障破壞、炎性反應、氧化損傷等病理損傷，與ICH預后密切相關，而減輕ICH后繼發性病理損傷一直是神經學者研究的熱點［2］。微小RNA（MicroRNAs， miRNA）是一類約22個核苷酸長度的非編碼RNAs，通過特異性互補堿基對靶mRNA的3′非翻譯區（UTR）降解或直接抑制靶基因的翻譯，從而調控多種途徑。近年來研究［3］發現，miRNA-27b與ICH密切相關，降低miR-27b水平能減輕ICH大鼠的病理損傷。既往研究［4-5］通過雙熒光素酶報告基因分析，提示核因子相關因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2， Nrf2）mRNA是miR-27b的直接靶點，miR-27b表達下降可能激活Nrf2/抗氧化應激反應元件（antioxidant response element，ARE）信號通路。Nrf2/ARE信號通路是機體內調節氧化還原平衡的主要承擔者，Nrf2/ARE信號通路可減輕ICH后病灶周圍炎癥反應，具有重要神經保護作用［6-7］。白藜蘆醇（Resveratrol， Res）是一種天然多酚類化合物。既往研究［8］證明，Res可減輕ICH后腦組織周圍水腫及凋亡，具有抑制炎癥反應等作用，并且在腫瘤、心血管、糖尿病等多種疾病中可降低促炎miRNA水平，提高抗炎能力［9］。2022年6月—2023年10月，我們觀察了Res單用或與miR-27b激動劑聯合應用對ICH大鼠腦組織繼發性病理損傷的防治作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 大鼠 8周齡雄性SD大鼠180只，體質量250～300 g，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號SYXK（鄂）2022-0065，上述動物均通過西南醫科大學實驗動物福利倫理審查。

1.2 大鼠分組和ICH模型制備方法 將SD大鼠隨機分為假手術組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組，每組36只。ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組以及NC組大鼠采用膠原酶注射尾狀核法制備ICH模型［10］：造模前大鼠適應性喂養7 d，禁食8 h后常規稱重，用7%水合氯醛（0.7 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，將其固定在腦立體定位儀上，頭部備皮，常規消毒，剪開皮膚；以前囟作為原點，向后0.2 mm、向右3 mm處鉆一直徑為1 mm小圓孔作為注射孔，將吸人膠原酶的微量注射器固定好，沿注射孔將針頭垂直、緩慢插入大鼠腦實質，深度約6 mm，以0.5 μL/min的速度注人膠原酶，注射完畢后停針10 min，緩慢向上拔針，每向上拔針1 mm停針5 min，直至全部拔出；結束后閉孔、消毒、縫合。假手術組以生理鹽水代替膠原酶，其余操作與其他組一致。造模后采用Longa評分，1～3分視為造模成功［11］。造模成功后繼續喂養24 h用于后續實驗。

1.3 Res和miR-27b激動劑給予方法 Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠在造模前連續7 d 腹腔注射50 mg/（kg·d） Res，假手術組及ICH組采取同樣方法向大鼠腹腔注射等體積的2% DMSO。Res+miR-27b agomir組大鼠在造模前3 d將5 μL（20 nmol/L）miR-27b激動劑miR-27b agomir注入大鼠右側腦室，NC組大鼠采取同樣方法將5 μL（20 nmol/L）agomir陰性對照試劑注入右側腦室，假手術組、ICH組、Res組則注入等量生理鹽水。

1.4 各組大鼠神經功能評估 每組取6只大鼠，使用mNSS評分量表評估大鼠神經功能，評分越高表示神經功能障礙越嚴重。

1.5 各組大鼠腦組織神經細胞凋亡率測算 采用TUNEL法。每組取6只大鼠，處死后取腦組織制作石蠟切片，常規脫蠟后用乙醇、PBS洗滌，于蛋白酶K溶液中孵育，配制TdT標記反應緩沖液，加入50 μL反應混合物，避光孵育，PBS清洗，DAPI復染，再次PBS洗滌，封片后熒光顯微鏡下觀察拍照并計數凋亡細胞，計算神經細胞凋亡率。神經細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.6 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應激相關因子檢測 采用ELISA法。每組取6只大鼠，處死后取腦組織制成勻漿，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定腦組織中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、丙二醛（Malonic dialdehyde， MDA）水平及超氧化物（Superoxide dismutase， SOD）。

1.7 各組大鼠腦組織中miR-27b、Nrf2 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。每組取6只大鼠，處死后取腦組織，采用TRIzol法提取總RNA。采用cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix試劑盒進行RT-PCR操作。引物序列如下：Nrf2正向引物為5'-GTCGCTTGCCCTGGATATTC-3'，反向引物5'-TAGCTCCTGCCAAACTTGCTC-3'；miR-27b-3p正向引物為5'-AGTGGCTAAGTTCTGCCTCAAC-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'；U6正向引物為5'-CCTGCTTCGGCAGCACAT-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正向引物5'-GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3'，反向引物5'-GTGGATGCAGGGATGATGTTC-3'。以2-ΔΔCt表示組織中目的mRNA的相對表達量。

1.8 各組大鼠腦組織中Nrf2/ARE信號通路相關蛋白Nrf2、血紅素加氧酶（Heme oxygenase 1， HO-1）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase1， Nqo1）檢測 采用Western Blotting法。每組取6只大鼠，處死后取腦組織，加入組織蛋白提取試劑，冰浴徹底勻漿，離心后取上清液，使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度；經過制膠、上樣、轉膜后，加入封閉液室溫封閉1 h；加入一抗在4 ℃過夜，TBST洗3次；加入二抗，室溫孵育30 min，TBST洗4次；滴加ECL混合溶液，經過顯色、曝光、顯影、定影后保存膠片；將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對表達量以目標蛋白灰度值/內參蛋白灰度值表示。

1.9 統計學方法 采用SPSS 27.0.1統計軟件。計量資料呈正態分布時以±s表示，多組間比較用ANOVA分析法，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 假手術組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠mNSS評分分別為（0.83 ± 0.75）、（14.33 ± 0.81）、（8.00 ±0.63）、（12.00 ± 0.89）、（8.50 ± 1.05）分，其中假手術組大鼠mNSS評分均低于其余各組（P均＜0.05），ICH組大鼠mNSS評分均高于其余各組（P均＜0.05），且Res+miR-27b agomir組大鼠mNSS評分均高于Res組和NC組（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織神經細胞凋亡率比較 假手術組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠腦組織神經細胞凋亡率分別為0.84% ±0.69%、37.18% ± 1.14%、6.41% ± 0.92%、19.46% ±1.35%、6.57% ± 0.77%，其中假手術組大鼠腦組織神經細胞凋亡率均低于其余各組（P均＜0.05），ICH組大鼠腦組織神經細胞凋亡率均高于其余各組（P均＜0.05），且Res+miR-27b agomir組大鼠腦組織神經細胞凋亡率均高于Res組和NC組（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應激相關因子表達水平比較 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應激相關因子表達水平比較見表1。由表1可知，假手術組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達水平均低于其余各組（P均＜0.05），SOD活力均高于其余各組（P均＜0.05）；ICH組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達水平均高于其余各組（P均＜0.05），SOD活力均低于其余各組（P均＜0.05）；且Res+miR-27b agomir組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達水平均高于Res組和NC組（P均＜0.05），SOD活力均低于Res組和NC組（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應激相關因子表達比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應激相關因子表達比較（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與ICH組相比，#P＜0.05；與Res組比，△P＜0.05；與Res+miR-27b agomir組相比，＆P＜0.05。

組別假手術組ICH組RES組RES+miR-27b agomir組NC組SOD（U/mg）53.52 ± 1.0927.72 ± 1.82*48.92 ± 2.56*#39.13 ± 1.41*#△47.55 ± 1.57*#＆n66666 TNF-α（pg/mg）22.38 ± 1.2254.21 ± 2.39*27.79 ± 1.25*#37.02 ± 1.10*#△27.56 ± 1.39*#＆IL-1β（pg/mg）15.04 ± 0.8846.00 ± 1.92*19.38 ± 1.20*#28.04 ± 1.20*#△19.09 ± 2.07*#＆MDA（nmol/mg）1.88 ± 0.327.27 ± 0.41*2.86 ± 0.30*#4.15 ± 0.21*#△2.91 ± 0.60*#＆

2.4 各組大鼠腦組織中miR-27b、Nrf2 mRNA相對表達量比較 假手術組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠腦組織中miR-27b相對表達量分別為1.02 ± 0.01、0.62 ± 0.04、0.23 ± 0.03、0.32 ±0.05、0.20 ± 0.04，其中Res組和NC組大鼠腦組織中miR-27b相對表達量無統計學差異（P＞0.05），其余組間相比，P均＜0.05。假手術組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠腦組織中Nrf2 mRNA相對表達量分別為1.01 ± 0.01、3.29 ± 0.05、4.74 ± 0.06、3.96 ± 0.05、4.77 ± 0.06，其中Res組和NC組大鼠腦組織中Nrf2 mRNA相對表達量無統計學差異（P＞0.05），其余組間相比，P均＜0.05。

2.5 各組大鼠腦組織中Nrf2/ARE信號通路相關蛋白Nrf2、HO-1、NQO1相對表達量比較 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達量比較見表2。由表2可知，Res組和NC組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達量無統計學差異（P＞0.05），其余組間相比，P均＜0.05。

表2 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達量比較（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與ICH組相比，#P＜0.05；與Res組比，△P＜0.05；與Res+miR-27b agomir組相比，＆P＜0.05。

組別假手術組ICH組Res組Res+miR-27b agomir組NC組NQO1蛋白0.06 ± 0.030.15 ± 0.07*0.76 ± 0.09*#0.25 ± 0.06*#△0.75 ± 0.04*#＆n66666 Nrf2蛋白0.06 ± 0.030.11 ± 0.04*0.54 ± 0.08*#0.16 ± 0.03*#△0.51 ± 0.02*#＆HO-1蛋白0.05 ± 0.040.16 ± 0.07*0.71 ± 0.12*#0.45 ± 0.08*#△0.70 ± 0.05*#＆

3 討論

腦組織繼發性病理損傷是指在ICH后，由于腦實質內的血液及溶血產物釋放的有害物質通過激活炎癥反應、細胞性毒性和興奮性毒性，促使神經元和神經細胞在退行性改變、炎癥和生化級聯的相互作用下，引起的腦組織損傷和細胞死亡［12］。Res是一種天然的多酚植物抗毒素，具有非常廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎免疫和神經保護等作用［13-14］。本實驗中觀察到予以Res干預ICH大鼠后，Res組神經功能缺損明顯改善，炎癥因子TNF-α、IL-1β表達下降以及SOD活性提升，表明其減輕腦組織炎癥反應及氧化損傷，說明Res能減輕ICH大鼠神經損傷，其可能是通過減輕炎癥反應及提升抗氧化應激能力起到了神經保護的作用。

miRNAs是一類約22個核苷酸長度的非編碼RNAs，能與靶基因3′-UTR區域結合，誘導該靶基因mRNA降解，抑制靶基因表達［3］。miRNAs在神經系統疾病如脊髓損傷、多發性硬化、缺血性卒中和阿爾茨海默病等病理過程中發揮了重要的調節神經炎癥作用。miR-27家族及其基因簇與人體內多種疾病有著較高的相關性。SAKSHI等［15］研究指出，在糖尿病足潰瘍進展過程中，miR-27b損害Nrf2介導的足部血管生成。此外，miR-27b是ICH后早期神經功能惡化的危險因素，抑制miR-27b表達可減輕ICH后的損傷。多項研究［16］發現，Res可能以一種新的方式——調控miRNA的表達而呈現多樣的生物活性，例如Res促進miR-20b-5p表達后抑制STIM2表達，改善線粒體功能，從而減輕急性心肌梗死后的缺血再灌注；Res在阿爾茨海默癥的大鼠模型中，調節Sirt1/miRNA-134/GSK3β表達，逆轉神經炎癥和神經毒性。在本研究中發現，與ICH組相比，Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組miR-27b的表達均降低；在予以miR-27b激動劑后，與Res組相比，Res+miR-27b agomir組miR-27b的表達升高，而NC組作為陰性對照與Res組無明顯差異，上述結果提示ICH后大鼠miR-27b表達下降，而Res可進一步抑制miR-27b表達的作用；并且在Res組中神經功能評分、腦組織凋亡率及促炎因子表達隨之降低，推測Res可能是通過下調ICH大鼠miR-27b的表達減輕ICH后的腦組織繼發性病理損傷。

Nrf2/ARE通路是抗氧化最重要的防御機制之一，它與炎癥性疾病、癌癥、神經退行性疾病、心血管疾病等密切相關。Nrf2/ARE信號通路激活后，Nrf2與細胞骨架相關蛋白Keap1（Kelch-like ECH-associated protein-1）解離并轉位進入細胞核，通過與ARE相互作用，可啟動下游抗氧化基因的轉錄，調節抗氧化酶的表達，促進自由基的清除，以抵抗氧化應激損傷［7］。近年來相關研究發現氧化應激反應可調節多種miRNA，改變其完整性、穩定性及生物學功能。miR-27b是一類與氧化應激有關的miRNA，參與多種疾病的發生發展。本研究中觀察到，在大鼠ICH模型中miR-27b表達下降，予以Res干預后進一步抑制其表達。在Res組中觀察到，伴隨miR-27b水平下降的同時，大鼠腦組織Nrf2 mRNA的水平明顯上升，并且Nrf2/ARE信號通路下游蛋白表達進一步增加，TNF-α、IL-1β等促炎因子水平明顯下降，SOD活力明顯提升。相反，與Res組相比，當Res+miR-27b agomir組miR-27b表達上升后，Nrf2 mRNA的水平則降低，并且Nrf2/ARE信號通路下游蛋白含量減少，Res的抗炎及抗氧化應激作用也受到一定的抑制。通過上述結果發現Nrf2可能是miR-27b的潛在靶向分子，二者表達可能存在負相關。因此推測Res抑制ICH大鼠miR-27b的表達后，可能進一步激活Nrf2/ARE信號通路影響其下游蛋白的表達，從而發揮抗炎及減輕氧化損傷作用。

綜上所述，Res單用或聯合miR-27b激動劑可對ICH大鼠腦組織繼發性病理損傷起防治作用，其防治作用可能與激活Nrf2/ARE信號通路有關。這表明Res可能成為治療ICH有價值的藥物，而miR-27b則可作為ICH治療的重要研究靶點，為改善ICH繼發性損傷提供新的思路。